劉偉林， 占桂婷，王婷， 程偉，尤恒，李珂，徐蕭，丁坤明饒輝福，張君岱，程長松，李亞東，李洋，吳文華，王行國

(1.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062；2.湖北咸寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 咸寧437100)

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草螺菌Herbaspirillumsp.WT00F的生理生化性質(zhì)和促生作用研究

劉偉林1， 占桂婷1，王婷1， 程偉1，尤恒1，李珂1，徐蕭1，丁坤明2饒輝福2，張君岱2，程長松2，李亞東1，李洋1，吳文華1，王行國1

(1.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062；2.湖北咸寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 咸寧437100)

0 引言

草螺菌(Herbaspirillumsp.)是新近才發(fā)現(xiàn)的一類嗜用有機(jī)酸、耐性強(qiáng)、微需氧、略呈彎曲的革蘭式陰性非發(fā)酵桿菌，可在高糖培養(yǎng)基上生長但不利用蔗糖的新細(xì)菌類群，隸屬于β-變形菌綱(β-Proteobacteria)草酸桿菌科(Oxalobacteraceae) 草螺菌屬(Herbaspirillum).織片草螺菌(Herbaspirillumseropedicae)是草螺菌屬的代表菌株.一些草螺菌具有固氮能力，常見于禾谷類植物和雙子葉植物(如玉米、小麥、甘蔗、高粱、香蕉和菠蘿)中[1-3].另一些從火山灰或水體分離出的草螺菌則不能固氮，其中從污泥中分離出的熒蒽降解菌H.chlorophenolicum還具有高效降解氯酚的能力[4].由于多數(shù)植物草螺菌具有固氮或產(chǎn)生植物激素的功能并具有使宿主植物增產(chǎn)的潛能，因此逐漸受到國內(nèi)外科研工作者的重視. Baldani等[5]發(fā)現(xiàn)，接種織片草螺菌(H.seropedicae) 的植株，根部發(fā)育明顯加快. Rothballer等[6]也發(fā)現(xiàn)佛萊辛草螺菌(H.frisingense)具有類似的功效.目前織片草螺菌已應(yīng)用于農(nóng)作物的田間試驗(yàn)研究，接種織片草螺菌能使高粱和水稻增加產(chǎn)量[7].本實(shí)驗(yàn)室從茶樹組織中分離出兩株內(nèi)生草螺菌，經(jīng)16S rRNA基因序列和生化鑒定為草螺菌并命名為Herbaspirillumsp.WT00C 和WT00F[8].

與草螺菌WT00C一樣，草螺菌WT00F也產(chǎn)生植物激素吲哚乙酸(IAA)、NH4+和嗜鐵載體[8].在體外培養(yǎng)條件下，IAA 含量可達(dá)(24.9±1.5) mg /L[8].將pUC18質(zhì)粒導(dǎo)入內(nèi)生草螺菌后接種不同的農(nóng)作物，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生草螺菌僅在茶樹內(nèi)定殖，不能在水稻、小麥、油菜、白菜內(nèi)定殖；其感染方式為創(chuàng)口入侵，澆灌和噴灑都不能感染受試植物；注射接種后也未見任何受試植物產(chǎn)生病理癥狀[9].茶樹扦插實(shí)驗(yàn)顯示草螺菌WT00C具有明顯的促生作用，不僅誘導(dǎo)扦插枝下部的不定根形成而且促進(jìn)上端新生芽的生長[9].本文中報(bào)道了草螺菌WT00F的生理生化特性以及它對(duì)茶樹生長發(fā)育的影響.雖然它在生理生化性質(zhì)方面與草螺菌WT00C不完全相同，但草螺菌WT00F同樣對(duì)茶樹扦插桿生根和對(duì)荼樹新芽生長發(fā)育具有明顯的促生作用，有望作為一種新型的綠色生物促生劑應(yīng)用于茶樹栽培以提高茶葉產(chǎn)量和減少化肥的使用.

1 材料與方法

1.2 細(xì)菌生長溫度、pH和鹽耐受性測(cè)定

1.2.1 細(xì)菌生長溫度測(cè)定 將10 μL活化的細(xì)菌接入10 mL NB液體培養(yǎng)基中，置不同溫度(4、20、25、30、34、37、40 ℃)條件下培養(yǎng).培養(yǎng)16 h后，在分光光度計(jì)上測(cè)定細(xì)菌的OD600值.

1.2.3 鹽耐受性測(cè)定 將10 μL活化的細(xì)菌接入10 mL含不同濃度NaCl的NB培養(yǎng)基中培養(yǎng).NaCl終濃度分別為0、0.5、1、1.5、2、2.5、3%. 34 ℃培養(yǎng)16 h后，測(cè)定細(xì)菌的OD600值.

按照文獻(xiàn)[14]報(bào)道的方法，使用API ZYM系統(tǒng)試劑條(bioMérieux)測(cè)定19種酶的活性.首先在LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線接種，37 ℃ 培養(yǎng)48 h.挑單菌落并接種5 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、160 r/min培養(yǎng)20 h.取1 mL 菌液，用滅菌的H2O稀釋至OD550為0.5.依照生產(chǎn)廠家的說明，在API ZYM 條孔內(nèi)放入65 μL細(xì)菌稀釋液，蓋上蓋子，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 h.然后分別加入33 μL ZYM A(三羥甲基-氨基-甲烷25 g，37% 鹽酸11 mL，月桂硫酸鹽10 g，加水至100 mL)和ZYMB(固蘭BB鹽0.12 g，甲醇40 mL，DMSO 60 mL) 試劑. 5 min后將試驗(yàn)條置于 1 000瓦燈泡下 10 s，觀察結(jié)果.

1.6 茶樹扦插桿的選擇與草螺菌WT00F處理

1.6.1 草螺菌WT00F的培養(yǎng) 按1∶100比率將34 ℃活化過夜的草螺菌WT00F菌液接入500 mL LB液體培養(yǎng)基(含5 μg/mL壯觀霉素)，37 ℃搖床(200 rpm)培養(yǎng)至OD600=1.2時(shí)備用.

1.6.3 茶樹扦插桿浸泡處理 按1水∶2細(xì)菌培養(yǎng)物的比例稀釋，制備草螺菌WT00F工作液.將扦插茶桿垂直放入工作液中浸泡1、2、3 h，每個(gè)處理組50株.對(duì)照組則用清水作相同的處理.

1.6.5 扦插苗草螺菌WT00F的檢測(cè) 扦插160 d后，拔出扦插苗.按照根、扦插桿、新莖、新葉4部位取材.按照文獻(xiàn)[8-9]描述的方法消毒根、莖、葉，消毒后的根、葉于5 mL無菌PBS中研磨，研磨液涂布在含5 μg/mL 壯觀霉素、的LB固體平板上；莖則切成1 cm厚的小圓片并直接放在相同的培養(yǎng)基平板上.37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落生長情況.所有操作都在無菌條件下進(jìn)行.如有菌落長出，則挑出菌落并接種至含有5 μg/mL壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基，然后按文獻(xiàn)[8-9]描述的方法檢測(cè)IAA含量，加以驗(yàn)證.

1.7 茶樹修剪與草螺菌WT00F處理

1.7.1 大田茶樹枝的修剪與細(xì)菌制劑噴灑 選用咸寧崇陽有機(jī)茶種植園5年生鄂茶一號(hào)作為實(shí)驗(yàn)材料.待春茶采收完后用電動(dòng)切割機(jī)修剪，剪掉茶樹枝條頂端部分，用噴霧器立即噴酒草螺菌WT00F工作液.實(shí)驗(yàn)分5組, 即清水對(duì)照組、1∶2(v/v)配比實(shí)驗(yàn)組、1∶1(v/v)配比實(shí)驗(yàn)組、2∶1(v/v)配比實(shí)驗(yàn)組、肽肥陽性對(duì)照組.每組茶地面積為 48 m2(48 m×1 m).草螺菌WT00F制劑按上述1.5節(jié)描述的方法制備,噴灑工作液按細(xì)菌制劑∶水來配制.每組實(shí)際噴灑量為63 mL/m2，對(duì)照組僅噴灑清水，陽性對(duì)照組則在茶樹根部地面施用42 g/m2肽肥(水解蛋白粉劑).

1.7.2 促生效果檢測(cè) 修剪噴灑后，讓茶樹生長60 d，用剪刀從每個(gè)枝條修剪處取出新長的幼枝，每個(gè)處理組選取6個(gè)不同的區(qū)域，每一區(qū)域取100枝，共600枝.放入保鮮袋并稱重，同時(shí)測(cè)量新生幼枝的長度.收集數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 草螺菌WT00F的生理生化特性 使用22種糖醇類、21種有機(jī)酸類和13種氨基酸作為唯一碳源，在碳源利用培養(yǎng)基中逐一檢測(cè)內(nèi)生草螺菌WT00F的生長情況.結(jié)果顯示，草螺菌WT00F能利用16種糖醇類、17種有機(jī)酸類和5種氨基酸作為碳源，并能利用14種糖醇類物質(zhì)產(chǎn)酸(見表1).這些結(jié)果說明草螺菌WT00F能廣泛利用多種糖醇類和有機(jī)酸類物質(zhì)作為細(xì)菌生長所需的碳源.草螺菌WT00F能利用21種有機(jī)酸類物質(zhì)中的17種，說明該細(xì)菌與其他草螺菌屬的細(xì)菌一樣嗜用有機(jī)酸.

細(xì)菌酶活檢測(cè)結(jié)果顯示，草螺菌WT00F擁有β-半乳糖苷酶、色氨酸脫氨酶、氧化酶、脲酶、硝酸鹽還原酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、脂酶(C4)、類脂脂酶(C8)、酚-AS-BI-磷酸水解酶、亮氨酸芳胺酶的活性(見表2).API ZYM試劑條可同時(shí)檢測(cè)19種酶，草螺菌WT00F僅顯示β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、脂酶(C4)、類脂脂酶(C8)、酚-AS-BI-磷酸水解酶和亮氨酸芳胺酶活性(見圖1)，其中堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和酚-AS-BI-磷酸水解酶活性較高，類脂脂酶(C8)和亮氨酸芳胺酶活性則較弱.這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅可用來了解草螺菌WT00F的生物學(xué)特性而且可用來作為菌種鑒定的指標(biāo).

抗生素敏感性測(cè)定顯示，草螺菌WT00F對(duì)鏈霉素、氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、利福平敏感，僅對(duì)壯觀霉素有微弱的抗性.大于5 μg/mL壯觀霉素對(duì)內(nèi)生草螺菌WT00F的生長有嚴(yán)重的抑制作用.草螺菌WT00F對(duì)多種抗生素敏感暗示它缺乏與其他環(huán)境微生物競(jìng)爭(zhēng)的能力，即在其他環(huán)境微生物存在的條件下，草螺菌WT00F在土壤環(huán)境中生存困難.

表1 草螺菌WT00F的碳源利用特性

±：生長微弱；+：生長或產(chǎn)酸；++：生長迅速或產(chǎn)酸能力強(qiáng)

-：陰性；±：微弱陽性；+：陽性

圖1 API ZYM試劑條檢測(cè)草螺菌WT00F酶活的結(jié)果

圖2 草螺菌WT00F促進(jìn)扦插苗生根和生長的結(jié)果(來自內(nèi)生草螺菌WT00F浸泡扦插160 d的數(shù)據(jù))

圖3 草螺菌WT00F浸泡扦插280 d后的扦插苗(a) 浸泡1 h;(b) 浸泡2 h;(c) 浸泡3 h

圖4 草螺菌WT00F噴灑修剪茶樹的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(a)和(b)為第一次采樣數(shù)據(jù)；(c)和(d)為第二次采樣數(shù)據(jù)；(e)和(f)為第三次采樣數(shù)據(jù)

使用上述內(nèi)生草螺菌檢測(cè)方法，檢查扦插160 d后扦插苗的各部分是否含有內(nèi)生草螺菌WT00F.在10株隨機(jī)挑選的扦插苗中，所有扦插桿內(nèi)含有草螺菌WT00F，而根、新莖和新葉部位未發(fā)現(xiàn)內(nèi)生草螺菌WT00F.這表明，通過浸泡過程，草螺菌WT00F確實(shí)進(jìn)入到茶樹扦插桿并能在扦插桿中定殖，且定殖的草螺菌WT00F不易有效地遷移至茶樹苗的幼嫩部位.

2.4 草螺菌WT00F對(duì)大田茶樹側(cè)生新芽的促生效應(yīng) 為了測(cè)試內(nèi)生草螺菌WT00F是否可以通過茶樹枝條頂端創(chuàng)口進(jìn)入茶枝內(nèi)部，用剪刀剪去盆栽1年生茶樹頂端部分，再用滴管滴一滴1∶1稀釋的細(xì)菌培養(yǎng)液，一周后檢測(cè)修剪枝內(nèi)是否含有草螺菌WT00F.結(jié)果在測(cè)試的茶樹修剪枝上部2 cm 處都含有內(nèi)生草螺菌，說明草螺菌WT00F是可以通過茶樹枝條頂端創(chuàng)口進(jìn)入并定殖于茶枝.

為了進(jìn)一步測(cè)試草螺菌WT00F是否對(duì)茶樹側(cè)生新芽的生長具有促生作用，分別使用不同比例稀釋的細(xì)菌培養(yǎng)物噴灑機(jī)械修剪后的大田茶樹，60 d后采樣收集數(shù)據(jù).采樣時(shí)，每組分6區(qū)采集新長出的幼嫩茶枝，每區(qū)100株，稱濕重和測(cè)量長度，共計(jì)600株.統(tǒng)計(jì)分析顯示每組6個(gè)區(qū)采集的樣本質(zhì)量和長度之間無顯著性差異(P>0.05).圖4a、b的結(jié)果表明,不同比例稀釋的內(nèi)生草螺菌WT00F噴灑的茶樹修剪枝，長出的新生幼枝平均長度和100株平均質(zhì)量均無顯著性差異(P>0.05)，與肽肥陽性對(duì)照組相近但均大于清水噴灑對(duì)照組(P>0.05).自噴灑細(xì)菌后茶地不再施用任何肥料，第二年春茶采收后進(jìn)行機(jī)械修剪，60 d后進(jìn)行第二次采樣，每組采集新長出的幼嫩茶枝600株，稱濕重并測(cè)量長度(見圖4c、d).待夏茶采收后再次進(jìn)行機(jī)械修剪，60 d后進(jìn)行第三次采樣，每組同樣采集新長出的幼嫩茶枝600株，稱濕重并測(cè)量長度(見圖4e、f).統(tǒng)計(jì)分析顯示第二次和第三次采樣的結(jié)果相似，1∶2稀釋噴灑組的新生幼枝平均長度和100株平均質(zhì)量略大于清水噴灑對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)；1∶1稀釋噴灑組的新生幼枝平均長度和100株平均質(zhì)量仍大于清水噴灑對(duì)照組，差異性顯著(P<0.05)；2∶1稀釋噴灑組的新生幼枝平均長度和100株平均質(zhì)量均大于清水噴灑對(duì)照組，差異極顯著(P<0.01), 并優(yōu)于肽肥陽性對(duì)照組.與第一次采樣結(jié)果比較，第二次和第三采樣中1∶2稀釋噴灑組和1∶1稀釋噴灑組新生幼枝平均長度和100株平均質(zhì)量都呈下降趨勢(shì)，尤其是1∶2稀釋噴灑組下降明顯，幾乎接近清水對(duì)照組；唯有2∶1稀釋噴灑組的新生幼枝平均長度和100株平均質(zhì)量與第一次采樣的結(jié)果相似，無顯著性變化.可能原因有：1) 過量稀釋后，噴灑到修剪枝頂端的細(xì)菌數(shù)較少，細(xì)菌在茶枝內(nèi)有效定殖或細(xì)菌有效定殖的茶枝比例較小，導(dǎo)致細(xì)菌難以發(fā)揮持久的促生效應(yīng)，以致于新生幼枝平均長度較短和100株平均質(zhì)量下降.2) 體外培養(yǎng)時(shí)茶樹內(nèi)生草螺菌WT00F能有效分泌IAA和產(chǎn)NH4+，以至于噴灑液中有一定含量.因此，第一次采樣的結(jié)果可能來自定殖的細(xì)菌、噴灑液中的IAA和NH4+的綜合效應(yīng)，而第二次和第三次采樣的數(shù)據(jù)則真正反映定殖細(xì)菌的促生效應(yīng).在第三次采樣的結(jié)果中，肽肥組的新生幼枝平均長度和100株平均質(zhì)量與對(duì)組照組基本相同，但細(xì)菌實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù)仍優(yōu)于對(duì)照組，說明此時(shí)肽肥的肥力已經(jīng)耗盡，而細(xì)菌仍具有促生效應(yīng).2∶1稀釋應(yīng)是大田噴灑較含適的稀釋比例，它能使茶樹內(nèi)生草螺菌WT00F有效定殖并發(fā)揮持久性的促生作用.

3 討論

草螺菌WT00F能將多種糖醇類、有機(jī)酸類以及少數(shù)幾種氨基酸作為碳源利用，其中許多糖醇類、有機(jī)酸類都是植物的代謝產(chǎn)物或代謝途徑中的中間代謝物，暗示寄主與細(xì)菌之間的共生關(guān)系.與其他植物內(nèi)生草螺菌如織片草螺菌(H.seropedicae)[1]、紅蒼白草螺菌(H.rubrisubalbicans)[16]、佛萊辛草螺菌(H.frisingense)[17]一樣，嗜用有機(jī)酸類物質(zhì)且不利用蔗糖.但是，與其他植物內(nèi)生草螺菌不同，草螺菌WT00F無固氮酶活性.草螺菌WT00F的生理生化性質(zhì)與另一株草螺菌WT00C[8-9]相似，不同之處主要有: 草螺菌WT00C有過氧化氫酶活性而草螺菌WT00F沒有； 草螺菌WT00C對(duì)10 μg/mL氨芐青霉素表現(xiàn)抗性而草螺菌WT00F敏感；草螺菌WT00F能利用乳糖產(chǎn)酸而草螺菌WT00C則不能.雖然草螺菌WT00F和草螺菌WT00C的生理生化性質(zhì)稍有不同，它們應(yīng)是同一個(gè)種內(nèi)的不同菌株.兩者雖不能固氮但都能產(chǎn)生IAA、NH4+和嗜鐵載體[8]、都具有促進(jìn)植物生長發(fā)育的潛能.

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(責(zé)任編輯 游俊)

Physiochemical properties and growth-promoting effects ofHerbaspirillumsp.WT00F

LIU Weilin1, ZHAN Guiting1, WANG Ting1, CHENG Wei1, YOU Heng1, LI Ke1XU Xiao1, DING Kunming2， RAO Huifu2, ZHANG Jundai2, CHENG Changsong2LI Yadong1, LI Yang1, WU Wenhua1, WANG Xingguo1

(1. College of Life Sciences, Hubei University, Wuhan 430062，China;2.Xianning Academy of Agricultural Science, Xianning 437100，China)

Herbaspirillumsp.WT00F was an endophytic bacterium isolated fromCamelliasinensisL.It used 16 glycitols, 17 organic acids and 5 amino acids as sole carbon source among 22 glycitols, 21 organic acids and 13 amino acids tested, and also utilized 14 glycitols to produce acid. Moreover, this bacterium displayed activities of 11 enzymes in the tested 33 enzymes. The bacterium grew well at pH 5.0—8.0 or when the final concentration of NaCl was≤1%. The bacterium was able to grow at wide range of temperature(20—40 ℃) with the optimal temperatures of 34—37 ℃.Herbaspirillumsp.WT00F was sensitive to all 8 antibiotics tested, only showed very weak resistance to spectinomycin(≤5 μg/mL). Although this bacterium did not show nitrogen-fixing activity, tea cuttings soaked or the pruned tea twigs sprayed with the bacterial culture demonstrated thatHerbaspirillumsp.WT00F not only induced the rooting of tea cuttages,but also stimulated the growth and development of newborn lateral buds.Whatever soaking or spraying method was applied, tea plats inoculated withHerbaspirillumsp.WT00F grew vigorously without any disease symptom. Our studies suggested thatHerbaspirillumsp.WT00F could be used as a novel green-bioaccelerator for both tea-cuttage propagation and tea-plant cultivation in tea farms.Key words:Herbaspirillum; physiochemical properties; asexual propagation of tea plant; bioaccelerator

2016-10-28

湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2015CFA089)資助

劉偉林(1990-)，男， 碩士生；王行國，通信作者，教授，博士生導(dǎo)師， E-mail: xgwang@hubu.edu.cn

1000-2375(2017)03-0291-08

Q93-332

A

10.3969/j.issn.1000-2375.2017.03.014