高澤磊+田童童++張建

摘要：為了研究新疆白蕓豆中凝集素的提取及純化工藝，以凝集素特異性活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素及響應(yīng)面分析法對(duì)新疆白蕓豆中的凝集素進(jìn)行研究。結(jié)果表明，新疆白蕓豆中凝集素提取的最佳工藝參數(shù)為料液比 1 g ∶10 mL、pH值7.5、提取時(shí)間20 h、提取液為磷酸鹽緩沖溶液（PB），在該條件下模型預(yù)測(cè)凝集素特異性活力為 1 209.04 HU/mg，實(shí)際試驗(yàn)值為1 193.62 HU/mg。利用二乙氨乙基（DEAE）A-50陰離子交換層析和Sephadex G-75 凝膠層析進(jìn)行純化，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析，確定目標(biāo)凝集素的分子量為30～40 ku。

關(guān)鍵詞：白蕓豆；凝集素；響應(yīng)面分析；純化

中圖分類號(hào)： TS201.1；R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）06-0191-05

凝集素（lectin）是一類至少有1個(gè)非催化結(jié)構(gòu)域、能非共價(jià)地可逆結(jié)合專一性單糖或寡糖的非免疫源性、非酶本質(zhì)的糖結(jié)合蛋白，目前在動(dòng)物、植物、微生物和病毒中均有發(fā)現(xiàn)[1-3]。關(guān)于凝集素的免疫作用、抗?fàn)I養(yǎng)作用（致毒作用）、使細(xì)胞表面成分再分布、修飾細(xì)胞膜酶的活力、阻斷卵受精、對(duì)脂肪細(xì)胞具有類似胰島素的活性等也逐漸被研究和證實(shí)[4-5]。目前對(duì)于凝集素的研究主要集中于植物凝集素，由于凝集素對(duì)于單糖或糖復(fù)合物特異性結(jié)合的能力，使其在如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)、植物防御等諸多信號(hào)過程中均具有重要作用。同時(shí)，凝集素具有細(xì)胞凝集、抗病毒、抗真菌及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或自噬等多種能力，因此在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)及農(nóng)業(yè)方面均有較好的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。

在植物凝集素研究中發(fā)現(xiàn)，豆科植物凝集素種類最豐富，有600多種，其中70多種已經(jīng)被分離純化，大多來自豆科植物的種子，在成熟種子中占蛋白質(zhì)總含量的10%左右[6]。另外，在其他組織，如葉、莖、果實(shí)、樹皮、根中也分布著一些與種子凝集素高度同源的凝集素[7-9]，它們雖然與種子凝集素有類似的氨基酸序列和糖結(jié)合特異性，但仍然是由不同基因編碼的。豆科植物凝集素一級(jí)氨基酸序列和三級(jí)結(jié)構(gòu)相似性很高，但是糖專一性和四級(jí)結(jié)構(gòu)卻有很大的不同[10]。因此，研究不同豆科類來源凝集素的結(jié)構(gòu)，對(duì)于豆科類凝集素在生物學(xué)、農(nóng)學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要的意義。

白蕓豆（white kidney bean）屬豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papiliononideae）菜豆族菜豆屬[11]。由于其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富（100 g干豆中含碳水化合物37.6%～48.5%，蛋白質(zhì) 19.9%～20.0%，脂肪1.6%～2.1%，鈣120 mg，鐵10 mg），因此可作為一種高鉀低鈉食品，適合高血脂、心臟病、動(dòng)脈硬化和忌鹽者食用[12]，而且食用后不會(huì)產(chǎn)生腹瀉、乏力、厭食、體質(zhì)量反彈等現(xiàn)象，完全符合世界衛(wèi)生組織的減肥原則[13-16]。因此，自白蕓豆從阿根廷、墨西哥引進(jìn)并經(jīng)人工栽培馴化后已經(jīng)在全國(guó)各地廣泛種植。然而，目前關(guān)于白蕓豆中凝集素的研究卻鮮有報(bào)道。因些，本研究以新疆白蕓豆為研究對(duì)象，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化凝集素的提取工藝，并通過實(shí)際試驗(yàn)考察以驗(yàn)證響應(yīng)面模型的正確性。利用二乙氨乙基（DEAE）A-50陰離子交換層析和Sephadex G-75凝膠層析對(duì)凝集素的粗提取物進(jìn)行純化，通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析，確定目標(biāo)凝集素的分子量，以期為后續(xù)研究其結(jié)構(gòu)及生理功能打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

主要材料：白蕓豆，購(gòu)自新疆石河子市好家鄉(xiāng)超市。主要試劑：牛血清蛋白（分析純），天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純），天津市福晨化學(xué)試劑廠；氯化鈉（分析純）、分析純乙醇（95%），天津市永晟精細(xì)化工有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris，分析純），北京拜爾迪生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)（Coomassie Brilliant Blue）G-250（分析純），Biotopped。

1.2儀器與設(shè)備

主要儀器與設(shè)備：PHS-3C型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；BINDER電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，北京航鵬普瑞技術(shù)開發(fā)中心；Heraeus Multifuge X3電動(dòng)離心機(jī)，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；RHP-600高速粉碎機(jī)，浙江榮浩工貿(mào)有限公司；KQ-200VDE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UVmini-1240紫外分光光度計(jì)，島津（中國(guó)）有限公司；JM-B10002電子天平，諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1原料預(yù)處理將市場(chǎng)上購(gòu)買的白蕓豆去除雜質(zhì)，準(zhǔn)確稱取30 g，在4 ℃冰箱中用150 mL蒸餾水浸泡24 h，撈去雜質(zhì)并瀝干后，手工去皮，在35 ℃烘箱中干燥后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過80目篩得到白蕓豆種子粉末。將經(jīng)過上述處理的樣品裝入聚乙烯袋中，4 ℃冰箱中保藏備用。

1.3.2蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定對(duì)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采取的是考馬斯亮藍(lán)G-250法。參考王孝平等的方法[17]，略有改動(dòng)。

1.3.3白蕓豆凝集素活力檢測(cè)參照李笑梅等的方法[18-19]，略有改動(dòng)。利用采血管抽取新鮮雞血10 mL，抽取 2 mL 至肝素鈉抗凝管中。將新鮮血液倒入離心管中并于 3 000 r/min 離心3 min，用移液槍去除上層血清，向沉淀中添加生理鹽水以清洗血紅細(xì)胞。輕輕顛倒搖勻洗滌，然后再次于3 000 r/min離心3 min，去除上清液，如此重復(fù)操作洗滌3次。根據(jù)紅細(xì)胞壓積，按照離心出的紅細(xì)胞體積，加入生理鹽水配成濃度2%的紅細(xì)胞懸液，在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?6孔反應(yīng)板上，每孔加入50 μL生理鹽水；在96孔板各排第1孔內(nèi)分別加入50 μL樣品溶液，混勻后從第1孔吸取50 μL加入第2孔，混勻后再吸取50 μL加入第3孔，按此方法倍比稀釋到第11孔，混勻后吸取50 μL棄去，以第12孔作空白對(duì)照；再在每孔內(nèi)加入50 μL紅細(xì)胞懸液，水平搖動(dòng)，放置1.5 h后觀察凝集效果。凝集素的特異性活力計(jì)算方法見式（1）：

特異性活力（HU/mg）=血凝滴度（2n）×1 000 μg/mg1每孔添加體積（μL）×凝集素或粗蛋白濃度（μg/μL）。（1）

式中：n為樣品經(jīng)過倍比稀釋后在96孔“V”形板上的凝集孔數(shù)，孔；2n為凝集素的血凝滴度，指在96孔板上使雞血紅細(xì)胞凝集的最小稀釋倍數(shù)。

1.3.4提取條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

1.3.4.1提取劑的確定準(zhǔn)確稱取10 g豆粉，按料液比 1 g ∶10 mL，分別加入0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PB，pH值為7.6）、生理鹽水、去離子水、Tris-HCl（pH值為7.6），超聲波振蕩20 min后，在4 ℃冰箱中進(jìn)行浸提，設(shè)定提取時(shí)間為18 h；浸提液經(jīng)4層紗布過濾后，將上清液倒入離心管中，于6 000 r/min離心20 min，將得到的上清液分別用96孔“V”形板反應(yīng)法和考馬斯亮藍(lán)G-250法進(jìn)行血凝檢測(cè)和蛋白質(zhì)含量測(cè)定，確定最佳提取液。

1.3.4.2提取液pH值的確定準(zhǔn)確稱取10 g豆粉，按料液比1 g ∶10 mL，分別加入0.05 mol/L pH值為6.4、6.8、7.2、7.6、8.0的PB，超聲波振蕩20 min后，在4 ℃冰箱中進(jìn)行浸提，設(shè)定提取時(shí)間為18 h；浸提液經(jīng)4層紗布過濾后，將上清液倒入離心管中，于7 000 r/min離心20 min，將得到的上清液分別利用96孔“V”形板反應(yīng)法和考馬斯亮藍(lán)G-250法進(jìn)行血凝檢測(cè)和蛋白質(zhì)含量測(cè)定，確定最佳pH值。

1.3.4.3料液比的確定準(zhǔn)確稱取10 g豆粉，分別按 1 g ∶6 mL、1 g ∶8 mL、1 g ∶10 mL、1 g ∶12 mL、1 g ∶14 mL的料液比，加入0.05 mol/L PB（pH值=7.6），超聲波振蕩 20 min 后，在4 ℃冰箱中進(jìn)行浸提，設(shè)定提取時(shí)間為 18 h；浸提液經(jīng)4層紗布過濾后，將上清液倒入離心管中，于 6 000 r/min 離心20 min，將得到的上清液分別利用96孔“V”形板反應(yīng)法和考馬斯亮藍(lán)G-250法進(jìn)行血凝檢測(cè)和蛋白質(zhì)含量測(cè)定，確定最佳料液比。

1.3.4.4提取時(shí)間的確定準(zhǔn)確稱取10 g豆粉，按照料液比1 g ∶10 mL，加入0.05 mol/L PB（pH值=7.6），超聲波振蕩20 min后，在4 ℃冰箱中進(jìn)行浸提，分別設(shè)定提取時(shí)間為16、18、20、22、24 h；浸提液經(jīng)4層紗布過濾后，將上清液倒入離心管中，于8 000 r/min離心20 min，將得到的上清液分別利用96孔“V”形板反應(yīng)法和考馬斯亮藍(lán)G-250法進(jìn)行血凝檢測(cè)和蛋白質(zhì)含量測(cè)定，確定最佳提取時(shí)間。

1.3.5響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用 Design-Expert 7.0軟件應(yīng)用響應(yīng)面分析法，以料液比（A）、提取時(shí)間（B）和pH值（C）為主要影響因素，以特異性活力為（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)（表1），選用Box-Behnken通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合響應(yīng)面模型，對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，研究工藝條件對(duì)提取效果的影響。每個(gè)試驗(yàn)組合重復(fù)試驗(yàn)3次，取其平均值作為結(jié)果，試驗(yàn)結(jié)果采用 Design-Expert 7.0軟件分析，確定最佳工藝路線。

1.3.6白蕓豆凝集素的硫酸銨分級(jí)沉淀法純化將白蕓豆豆粉與提取劑混合，置于4 ℃冰箱，將溶液進(jìn)行超聲波振蕩，抽提24 h，用4層紗布過濾，棄去濾渣，濾液于10 000 r/min離心15 min，收集上清液；向上清液中加入固體硫酸銨至40%飽和度，置于4 ℃冰箱12 h，然后于10 000 r/min離心 15 min；收集上清液后，逐漸加固體硫酸銨至溶液70%飽和度，4 ℃靜置12 h后于10 000 r/min離心15 min，收集沉淀，將沉淀溶于提取劑，透析、冷凍干燥，得到白蕓豆凝集素粗提物，置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.7白蕓豆凝集素的柱層析純化（1）DEAE A-50的預(yù)處理。稱取5 g A-50，懸于500 mL蒸餾水中，1 h后倒去上層細(xì)粒；再按1 g A-50加15 mL 0.5 mol/L NaOH的比例，將A-50浸泡于0.5 mol/L NaOH中，攪勻，靜置30 min，反復(fù)用蒸餾水洗至pH值呈中性；再用0.5 mol/L HCl同以上操作過程進(jìn)行處理；最后用0.5 mol/L NaOH再處理1次，放于電熱爐上煮沸30 min進(jìn)行脫氣處理，處理完后將A-50浸泡于pH值7.5的PB中過夜。（2）裝柱。將PB緩沖溶液沿玻璃棒倒入柱中約1/4高度，再倒入預(yù)處理后與上樣緩沖液調(diào)成稀糊狀的A-50，待A-50凝膠沉降2～3 cm厚時(shí)，開啟出水口螺旋夾，控制流速1 mL/min，同時(shí)連續(xù)倒入糊狀A(yù)-50凝膠至所需高度；關(guān)閉出水口，待A-50凝膠完全沉降后，塞緊柱上口；平衡：開啟出水口螺旋夾，控制流速12～14 d/min，使約2倍體積的洗脫液流出。（3）Sephadex G-75凝膠預(yù)處理。100 mL燒杯中稱取5 g G-75，加入50 mL去離子水，浸泡溶脹24 h；隨后倒去Sephadex G-75溶脹后凝膠上層的清水，加入凝膠等體積的1.0 mol/L NaOH溶液處理，用攪拌棒輕輕攪動(dòng)，并浸泡1 h后倒去上層液體，再用蒸餾水洗滌，洗滌過程中用傾去法除去細(xì)顆粒，其方法是將凝膠攪勻（注意不要過分用力攪拌以防止顆粒破碎）并放置數(shù)分鐘；將未沉淀的細(xì)顆粒隨上層的水倒掉，重復(fù)3～5次，直至上層沒有細(xì)顆粒為止，再浸泡于水中至中性；將G-75凝膠水溶液放于電熱爐上進(jìn)行煮沸脫氣處理30 min。裝柱方法類似DEAE A-50陰離子柱。平衡后即可正常使用。

1.3.8SDS-PAGE分析方法SDS-PAGE采用Laemmli的方法[20]，不連續(xù)垂直板狀凝膠電泳。白蕓豆凝集素電泳條件：濃縮膠5%，分離膠12%。（1）試劑的配制。10% SDS：將 10 g SDS加水定容至100 mL。10%過硫酸銨：0.1 g過硫酸銨加1.0 mL水，混勻，使用前配制。丙烯酰胺單體貯液：29.10 g 丙烯酰胺+0.90 g N，N-甲叉雙丙烯酰胺加水定容至100 mL，用棕色瓶于4 ℃保存。分離膠緩沖貯液（1.5 mol/L Tris-HCl，pH值8.8）：將18.15 g Tris溶于 80 mL 水，用4 mol/L HCl調(diào)pH值至8.80，定容至100 mL，4 ℃ 保存。濃縮膠緩沖貯液（1.0 mol/L Tris-HCl，pH值 6.8）：將12.10 g Tris溶于60 mL水，用4 mol/L HCl調(diào)pH值至6.80，定容至100 mL，4 ℃保存。樣品緩沖液：1% SDS，0.1 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L β-巰基乙醇，0.1 g/L溴酚藍(lán)，150 g/L蔗糖，pH值8.0，4 ℃保存。電泳緩沖液：3.0 g Tris+14.4 g甘氨酸（gly）+1.0 g SDS，加水定容至 1 000 mL，4 ℃保存。脫色液：50 mL甲醇，75 mL冰乙酸，875 mL 純水。染色液：2.5 g考馬斯亮藍(lán)R-250，454 mL甲醇，92 mL冰乙酸，454 mL純水。

（2）操作方法。每次電泳時(shí)，樣品和marker須在沸水浴中保持5 min，然后在常溫下進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后將凝膠小心放入容器中加入染色液，染色結(jié)束后用脫色液在脫色搖床上脫色，其間更換脫色液3～4次直到條帶清晰。凝膠的組分見表2，膠板大小為80 mm（W）×73 mm（H）×0.75 mm（T）。

2結(jié)果與分析

2.1提取條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1不同提取劑對(duì)白蕓豆凝集素特異性活力的影響由圖1可見，提取液種類的不同對(duì)白蕓豆凝集素特異性活力有明顯影響，PB組的凝集素特異性活力明顯高于Tris-HCl組、生理鹽水組、去離子水組，這可能與凝集素是一種水溶性的蛋白質(zhì)或者糖蛋白有關(guān)，蛋白質(zhì)在具有一定離子強(qiáng)度的浸提劑中的溶解度要高于在去離子水中的溶解度，而 Tris-HCl組有更多的雜蛋白溶解出來，對(duì)進(jìn)一步的分離純化造成負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致凝集素含量下降。因此，確定PB作為提取液。

2.1.2pH值對(duì)白蕓豆凝集素特異性活力的影響由圖2可見，pH值從6.4增加至7.6過程中，隨pH值的不斷上升，白蕓豆凝集素的特異性活力值也逐漸增大，這可能是由于凝集素作為一種蛋白質(zhì)，是一種兩性解離的物質(zhì)，當(dāng)提取劑pH值接近凝集素的等電點(diǎn)時(shí)，會(huì)使凝集素發(fā)生沉淀，導(dǎo)致對(duì)應(yīng)的特異性活力值較低；當(dāng)pH值為7.6時(shí)，特異性活力達(dá)到最大值，為1 179.661 HU/mg，說明在此pH值條件下，有利于更多的凝集素溶出。因此，確定pH值為7.6為最佳提取液pH值。

2.1.3料液比對(duì)白蕓豆凝集素特異性活力的影響從圖3可見，隨著料液比的增加，凝集素的特異性活力也發(fā)生明顯的變化，總體呈先提高后降低趨勢(shì)；在料液比1 g ∶10 mL時(shí)白蕓豆凝集素的特異性活力達(dá)到峰值，在料液比較低的時(shí)候，白蕓豆凝集素的特異性活力較低。究其原因，可能是當(dāng)料液比較低時(shí)，由于提取劑的濃度不夠，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不能完全被提取，隨著料液比的增加，傳質(zhì)動(dòng)力增加，蛋白質(zhì)的提取率也就隨之上升，相應(yīng)的凝集素特異性活力提高。因此，從原料的成本考慮，選擇提取料液比1 g ∶10 mL比較適宜。

2.1.4提取時(shí)間對(duì)白蕓豆凝集素特異性活力的影響從圖4可見，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，凝集素活力先上升后下降，時(shí)間為18 h時(shí)，達(dá)到峰值。說明利用提取劑提取豆粉中的凝集素時(shí)，時(shí)間的延長(zhǎng)有利于凝集素的溶出；但是，提取時(shí)間并不是越長(zhǎng)越好，過度的時(shí)間延長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致豆粉中的一些酶類將蛋白質(zhì)分解，同時(shí)由于微生物的存在，它們的生長(zhǎng)繁殖也會(huì)消耗一些蛋白質(zhì)，而這些損失掉的蛋白質(zhì)中有可能含有凝集素；此外，時(shí)間越長(zhǎng)，成本越高，因此選擇凝集素活力表現(xiàn)最佳的階段進(jìn)行提取。由此可見，提取時(shí)間為18 h比較合適。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件

2.2.1響應(yīng)面曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以特異性活力（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Design-Expert 7.0的中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以料液比（A）、提取時(shí)間（B）、pH值（C）為主要影響因素，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，結(jié)果見表3，對(duì)該回歸模型及系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)的結(jié)果見表4。

運(yùn)用Design-Expert 7.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到多元二次回歸方程：

Y=411.13+7.19A+41.65B-31.21C-3.69AB-6.65AC-39.71BC-3.45A2-106.41B2-20.67C2。

由表4可看出，模型P值=0.021 2<0.05，該模型是顯著的；失擬項(xiàng)P值=0.791 6>0.05，差異不顯著；殘差均由隨機(jī)誤差引起，表明所建立的回歸二次模型成立，此模型可用作預(yù)測(cè)和分析白蕓豆凝集素提取工藝參數(shù)。依據(jù)回歸系數(shù)模型顯著性檢驗(yàn)可知，在選定的范圍內(nèi)，影響蛋白質(zhì)提取率的主次因素為B>C>A，即提取時(shí)間>pH值>料液比；模型的R2=0.868，模型擬合程度很好。

2.2.2響應(yīng)面分析為進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用，通過Design-Expert 7.0統(tǒng)計(jì)軟件繪制響應(yīng)面曲面進(jìn)行直觀分析。從圖5-A中可以看出，料液比對(duì)凝集素特異性活力的影響呈現(xiàn)線性關(guān)系，而提取時(shí)間呈二次影響；隨著料液比的不斷升高，凝集素特異性活力沒有表現(xiàn)明顯的變化；而隨著提取時(shí)間的不斷增加，凝集素特異性活力呈現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。從圖5-B中可以看出，料液比對(duì)凝集素特異性活力的影響呈現(xiàn)線性關(guān)系，而pH值呈二次影響；隨著料液比的不斷升高，凝集素特異性活力沒有表現(xiàn)明顯的變化；而隨著pH值的不斷上升，凝集素特異性活力呈現(xiàn)出先提高后降低的趨勢(shì)。從圖5-C中可以看出，pH值和提取時(shí)間對(duì)凝集素特異性活力都呈二次影響，隨著提取時(shí)間的增加，凝集素特異性活力呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)；隨著pH值的增加，凝集素特異性活力同樣呈先增強(qiáng)后減弱趨勢(shì)，說明兩者的交互作用對(duì)蛋白質(zhì)的提取率均有影響。

綜合分析圖5-A、圖5-B、圖5-C可以看出，提取時(shí)間和pH值變化時(shí)，響應(yīng)值變化較大，表現(xiàn)為曲線較陡；提取時(shí)間和pH值對(duì)凝集素的特異性活力影響較明顯，料液比影響不大。

2.2.3驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)回歸模型進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，分析得到白蕓豆凝集素提取最優(yōu)工藝參數(shù)為料液比1 g ∶10 mL，pH值7.5，提取時(shí)間20 h，特異性活力可達(dá)到1 209.04 HU/mg。為了驗(yàn)證試驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果，用以上優(yōu)化參數(shù)重復(fù)試驗(yàn)3次，平均特異性活力為1 193.62 HU/mg，與理論值偏差1.3%，沒有明顯差異，試驗(yàn)結(jié)果證明，響應(yīng)面分析法對(duì)工藝優(yōu)化是非常有效的。

2.2.4DEAE A-50陰離子交換層析離子交換層析利用帶電分子之間的電荷差異來進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所處環(huán)境的pH值發(fā)生變化時(shí)會(huì)引起蛋白質(zhì)本身所帶電荷的變化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所處的環(huán)境pH值>等電點(diǎn)（pI）時(shí)，帶負(fù)電；當(dāng)環(huán)境的pH值

將凝集素粗品溶液用水系膜除雜，用pH值7.5、0.05 mol/L PB作為上樣緩沖液，紫外檢測(cè)器檢測(cè)平穩(wěn)后開始工作。上樣量為3 mL，經(jīng)緩沖溶液洗脫獲得第1個(gè)吸收峰。然后按照NaCl濃度0.05、0.20、0.50 mol/L的變化梯度進(jìn)行梯度洗脫。各濃度梯度洗脫后得到的洗脫結(jié)果見圖6，其中峰1為PB洗脫液直接洗脫獲得的穿透峰，峰2為添加 0.05 mol/L NaCl的PB洗脫峰，峰3為添加0.20 mol/L NaCl的PB洗脫峰，峰1具有凝集能力，其余的則不含有凝集素，因此將經(jīng)過洗脫后獲得的峰1溶液保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.5Sephadex G-75分子篩分子篩層析是依據(jù)樣品中物質(zhì)分子的差別而進(jìn)行分離的，洗脫時(shí)分子量大的物質(zhì)直接被沖洗下來，而分子量小的在洗脫時(shí)會(huì)進(jìn)入凝膠孔內(nèi)增加運(yùn)行的距離，使得大分子量的先洗脫下來，小分子量的后洗脫下來，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的分離。將DEAE A-50純化后的溶液過水系膜后上Sephadex G-75 分子篩柱。用pH值7.5、005 mol/L PB作為上樣緩沖液，上樣量5mL。得到如圖7所示的洗脫結(jié)果，經(jīng)血紅細(xì)胞檢測(cè)表明，該凝集素具有凝集活力。

2.2.6SDS-PAGE檢測(cè)分析通過對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白各條帶對(duì)應(yīng)的分子量，得知目標(biāo)蛋白的分子量大小在30～40 ku（圖8）。

3結(jié)論

用Design-Expert 7.0統(tǒng)計(jì)軟件，根據(jù)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析試驗(yàn)對(duì)白蕓豆粗凝集素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用響應(yīng)面法對(duì)白蕓豆凝集素提取方法進(jìn)行優(yōu)化，得到擬合方程：Y=411.13+7.19A+41.65B-31.21C-3.69AB-6.65AC-3971BC-3.45A2-106.41B2-20.67C2，以及提取最優(yōu)條件：料液比1 g ∶10 mL，pH值7.5的0.05mol/LPB，提取時(shí)間

20 h，白蕓豆凝集素特異性活力為 1 193.62 HU/mg。白蕓豆凝集素粗品，經(jīng)過DEAE A-50、Sephadex G-75分子篩及SDS-PAGE分析后表明，初步分離產(chǎn)物中白蕓豆凝集素的分子量在30～40 ku，含量較高。

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