楊家耀+陶冬青+劉嵩+張書+馬威+時(shí)昭紅

[摘要] 通過油酸誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞株LO2構(gòu)建非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型，探討四君子湯、理中湯和附子理中湯對(duì)非酒精性脂肪肝細(xì)胞增殖與凋亡的影響。不同濃度的油酸誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞株LO2構(gòu)建非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型，油紅O染色觀察非酒精性脂肪肝細(xì)胞的脂滴形成狀況；全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)細(xì)胞上清液中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平。分別設(shè)正常組、模型組、模型+四君子湯組、模型+理中湯組和模型+附子理中湯組，MTT檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況；Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中PCNA，cleaved caspase-3，cleaved caspase-8，cleaved caspase-9，Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。油紅O染色結(jié)果顯示，與低濃度誘導(dǎo)相比，80 mg·L-1油酸誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型效果最佳，且誘導(dǎo)成功后細(xì)胞上清液中AST，ALT，TC和TG含量顯著升高（P<0.01）。MTT和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，四君子湯、理中湯和附子理中湯均能有效促進(jìn)非酒精性脂肪肝細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡（P<0.01），且附子理中湯的作用效果最佳。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，四君子湯、理中湯和附子理中湯能下調(diào)非酒精性脂肪肝細(xì)胞中cleaved caspase-3，cleaved caspase-8，cleaved caspase-9和Bax蛋白表達(dá)量，上調(diào)PCNA和Bcl-2蛋白的表達(dá)量，且附子理中湯的調(diào)節(jié)效果較其他2組藥物處理更顯著。該實(shí)驗(yàn)表明四君子湯、理中湯和附子理中湯均能有效促進(jìn)非酒精性脂肪肝細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，且附子理中湯的作用效果最佳，其藥效機(jī)制可能與3種湯藥介導(dǎo)增殖與凋亡相關(guān)通路中關(guān)鍵因子的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 四君子湯；理中湯；附子理中湯；非酒精性脂肪肝；LO2細(xì)胞株

Effects of three Wenyang Jianpi Tang on cell proliferation and

apoptosis of nonalcoholic fatty liver cells

YANG Jia-yao1*， TAO Dong-qing2， LIU Song1， ZHANG Shu1， MA Wei1， SHI Zhao-hong1

（1. Wuhan Integrated Traditional Chinese Medicine & Western Medicine Hospital（Wuhan No.1 Hospital）， Wuhan 430022， China；

2. Zhongshan Hospital， Medical College of Wuhan University， Wuhan 430026， China）

[Abstract] To investigate the effects of Sijunzi Tang， Lizhong Tang and Fuzi Lizhong Tang on the cell proliferation and apoptosis of nonalcoholic fatty liver cells through the nonalcoholic fatty liver cell model established by inducing L02 cells with oleic acid. Different concentrations of oleic acid were added into L02 cells to induce the nonalcoholic fatty liver cell model. Oil red O staining was used to observe fatty droplets of fatty liver cells. Automatic biochemical analyzer was used to detect the levels of aspartic transaminase（AST）， alanine aminotransferase（ALT）， total cholesterol（TC）， and triglyceride（TG） in the cell supernatants. There were five groups， namely normal group， model group， model and Sijunzi Tang group， model and Lizhong Tang group， and model and Fuzi Lizhong Tang group. The cell proliferation and apoptosis of the five groups were detected by MTT colorimetry test and flow cytometer. The expressions of PCNA， cleaved caspase-3， cleaved caspase-8， cleaved caspase-9， Bax and Bcl-2 proteins of the five groups were detected by Western blot. The oil red O staining results showed that the optimum concentration of oleic acid that was used to induce nonalcoholic fatty liver cell models was 80 mg·L-1. The levels of AST， ALT， TC and TG in the nonalcoholic fatty liver cell supernatants were higher than that in normal liver cell supernatants（P<0.01）. MTT colorimetry test and flow cytometer results showed that all of Sijunzi Tang， Lizhong Tang and Fuzi Lizhong Tang could effectively promote the cell proliferation， and inhibit the cellular apoptosis of nonalcoholic fatty liver cells（P<0.01）. And Fuzi Lizhong Tang showed the best effect. Western blot results showed that Sijunzi Tang， Lizhong Tang and Fuzi Lizhong Tang could down-regulate the expressions of cleaved caspase-3， cleaved caspase-8， cleaved caspase-9 and Bax proteins， and up-regulate the expressions of PCNA and Bcl-2 proteins of nonalcoholic fatty liver cells. And Fuzi Lizhong Tang showed the best effect. In conclusion， all of Sijunzi Tang， Lizhong Tang and Fuzi Lizhong Tang could effectively promote the cell proliferation， and inhibit the cellular apoptosis of nonalcoholic fatty liver cells. And Fuzi Lizhong Tang showed the best effect. The pharmacodynamic mechanism may be related to the expressions of key factors in pathways related with proliferation and apoptosis mediated by the three decoctions.

[Key words] Sijunzi Tang； Lizhong Tang； Fuzi Lizhong Tang； nonalcoholic fatty liver disease； LO2 cell line

近年來，隨著人們生活水平的提高，非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD）的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，已有的研究已證實(shí)NAFLD與2型糖尿病、代謝綜合征以及相關(guān)的心腦血管病有一定的相關(guān)性[1-2]，且其后期發(fā)展可導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohetitis，NASH）、肝硬化以及肝癌等重癥疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康[3]。關(guān)于NAFLD的動(dòng)物模型研究較多，但由于動(dòng)物模型會(huì)出現(xiàn)個(gè)體差異大、實(shí)驗(yàn)相關(guān)條件不易控制、周期較長(zhǎng)以及穩(wěn)定性差等缺陷，越來越多的研究者采用離體細(xì)胞模型進(jìn)行脂肪肝相關(guān)研究，細(xì)胞模型能有效縮短研究周期；實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好；且有利于非酒精性脂肪肝發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究以及大規(guī)模的藥物篩選[4-5]。中醫(yī)藥認(rèn)為脾虛、濕熱和痰瘀為脂肪肝病機(jī)的關(guān)鍵[6]，因此，本研究采用體外細(xì)胞模型進(jìn)行相關(guān)研究，旨在探討四君子湯、理中湯和附子理中湯3種具有溫陽(yáng)健脾功效的湯藥對(duì)非酒精性脂肪肝細(xì)胞增殖與凋亡的影響，為臨床上非酒精性脂肪肝的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 本研究所用的人正常肝細(xì)胞株LO2（貨號(hào)JL10103）由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司代購(gòu)。

1.2 藥物 四君子湯（益氣健脾）、理中湯（溫陽(yáng)化氣）和附子理中湯（溫中健脾）的中藥配方見表1，按照《方劑學(xué)》[7-8]確定各藥物所用劑量（本實(shí)驗(yàn)用黨參15 g替代人參9 g），所有藥材均購(gòu)自湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司，黨參（批號(hào)201602010）、茯苓（批號(hào)201602004）、白術(shù)（批號(hào)201602011）、炙甘草（批號(hào)201602011）、干姜（批號(hào)20160127）、炮附子（批號(hào)201601015），以上藥材均由武漢中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院余南才主任鑒定合格。3種中藥根據(jù)配方按常法煎煮2次，合并2次濾液，于水浴鍋上將藥液濃縮至每1 mL含4 g藥材，將其溶于RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)整藥物質(zhì)量濃度為400 g·L-1，于4 ℃保存?zhèn)溆?，臨用前用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋為40 g·L-1。由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室代加工。

1.3 試劑和設(shè)備 油酸（貨號(hào)O1008）由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司代購(gòu)；油紅O（貨號(hào)PAB10010018）和四甲基偶氮唑鹽（MTT，貨號(hào)PAB180013）均購(gòu)自中國(guó)Bioswamp公司；胎牛血清（貨號(hào)10270-106）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RPMI-1640培養(yǎng)液（貨號(hào)SH30809.01B）和DMEM（貨號(hào)SH30022.01B）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（貨號(hào)20142400109）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（貨號(hào)20142400119）、總膽固醇（TC）試劑盒（貨號(hào)20142400134）、甘油三酯（TG）試劑盒（貨號(hào)20142400135）均購(gòu)自寧波美康生物科技股份有限公司。顯微鏡來自美國(guó)Olympus公司；東芝TBA-40FR全自動(dòng)生化分析儀來自東芝醫(yī)療系統(tǒng)（中國(guó)）有限公司；酶標(biāo)儀來自美國(guó)Thermo公司。純化兔抗人PCNA（貨號(hào)ab18197），cleaved caspase-3（貨號(hào)ab2302），cleaved caspase-8（貨號(hào)ab25901），cleaved caspase-9（貨號(hào)ab69514）和Bax（貨號(hào)ab53154）多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；純化兔抗人Bcl-2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司（貨號(hào)2872T）；山羊抗兔二抗購(gòu)自中國(guó)Bioswamp公司（貨號(hào)PAB160011）。

1.4 非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型的構(gòu)建 將人正常肝細(xì)胞株L02以1.5×105個(gè)/mL接種于6孔板中，在含5%CO2的孵箱中37 ℃孵育24 h，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，設(shè)對(duì)照組和模型組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組；培養(yǎng)液中分別加入20，40，60，80 mg·L-1油酸設(shè)為模型組。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別進(jìn)行油紅O染色，400倍顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 生化檢測(cè) 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)對(duì)照組和模型組細(xì)胞上清液中AST，ALT，TC和TG水平。具體操作按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 分組與給藥 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞于96孔板中，5×104個(gè)/孔，每孔加入180 μL細(xì)胞懸液，模型組細(xì)胞中分別加入40 g·L-1的四君子湯、理中湯和附子理中湯20 μL，以200 μL培養(yǎng)液做空白對(duì)照，分別設(shè)正常組、模型組、模型+四君子湯組、模型+理中湯組和模型+附子理中湯組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.7 MTT和Annexin-V/PI雙染分別檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡 在以上藥物處理24，48，72 h的細(xì)胞中加入90 μL新鮮培養(yǎng)液后再加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后吸去上清，每孔加入110 μL Formazan溶解液，將96孔板置于搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。按照Annexin-V/PI說明書對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行染色，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.8 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞用藥后的PCNA，cleaved caspase-3，cleaved caspase-8，cleaved caspase-9，Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)情況 收集各組細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后裂解離心收集上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，將20 μL蛋白樣品經(jīng)12%的SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉進(jìn)行室溫封閉1 h，TBST洗滌后加入一抗4 ℃孵育過夜，經(jīng)TBST洗滌后，加入HRP標(biāo)記的特異性二抗，室溫孵育1 h，洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光試劑對(duì)其曝光顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間差異采用方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型的建立 油紅O染色結(jié)果見圖1，對(duì)照組LO2細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形、細(xì)胞邊緣清晰、胞質(zhì)透明、細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色、極個(gè)別細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見極少量紅色脂滴。20～60 mg·L-1油酸誘導(dǎo)的脂肪肝細(xì)胞中，部分細(xì)胞變圓、形狀不規(guī)則、細(xì)胞胞質(zhì)可見大小不一的紅色脂滴。80 mg·L-1油酸誘導(dǎo)的脂肪肝細(xì)胞形狀不規(guī)則、視野可見細(xì)胞的胞質(zhì)中均有明顯的紅色脂滴環(huán)繞細(xì)胞核。因此，油酸誘導(dǎo)構(gòu)建非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型的最佳質(zhì)量濃度為80 mg·L-1。

2.2 AST，ALT，TC和TG水平檢測(cè) 模型組細(xì)胞上清液中AST，ALT，TC和TG水平均顯著高于正常組細(xì)胞（P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型誘導(dǎo)成功，見表2。

2.3 對(duì)非酒精性脂肪肝細(xì)胞增殖的影響 與藥物作用后48 h相比，各組細(xì)胞在藥物作用后72 h的增殖能力有所下降，因此，判定藥物作用的最適時(shí)間為48 h。與正常組相比，模型組細(xì)胞增殖能力明顯下降（P<0.01），說明非酒精性脂肪肝細(xì)胞的增殖速度慢于正常細(xì)胞。藥物作用48 h后，與模型組相比，模型+四君子湯組、模型+理中湯組和模型+附子理中湯組的細(xì)胞增殖能力明顯上升（P<0.01），且模型+附子理中湯組的細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于模型+四君子湯組和模型+理中湯組（P<0.05），但模型+四君子湯組和模型+理中湯組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。說明3種湯藥都能促進(jìn)非酒精性脂肪肝細(xì)胞的增殖，且附子理中湯的效果最佳。

2.4 對(duì)非酒精性脂肪肝細(xì)胞凋亡的影響 湯藥處理48 h后，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。與正常組相比，模型組、模型+四君子湯組、模型+理中湯組和模型+附子理中湯組的細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，模型+四君子湯組、模型+理中湯組和模型+附子理中湯組的細(xì)胞凋亡率均顯著降低（P<0.01）；3種湯藥處理組組間進(jìn)行比較，模型+附子理中湯組較其他2種湯藥的細(xì)胞凋亡率有所下降（P<0.05），但模型+四君子湯組和模型+理中湯之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。說明四君子湯、理中湯和附子理中湯均能有效抑制非酒精性脂肪肝細(xì)胞凋亡，且附子理中湯的抑制效果最佳。

2.5 對(duì)非酒精性脂肪肝細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與正常組相比，模型組非酒精性脂肪肝細(xì)胞的促凋亡蛋白Bax和凋亡執(zhí)行者cleaved caspase-3，cleaved caspase-8，cleaved caspase-9蛋白表達(dá)量上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2和增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)量下調(diào)，見圖3。表明非酒精性脂肪肝細(xì)胞較正常細(xì)胞增殖能力下調(diào)，凋亡增加。與模型組相比，模型+四君子湯組、模型+理中湯組和模型+附子理中湯組細(xì)胞的cleaved caspase-3，cleaved caspase-8，cleaved caspase-9和Bax蛋白表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)，而PCNA和Bcl-2蛋白的表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)，且模型+附子理中湯組的調(diào)節(jié)效果最明顯，見圖4。表明3種湯藥均能促進(jìn)非酒精性脂肪肝細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡的發(fā)生，其中附子理中湯效果最佳。

3 討論

隨著人們生活水平的提高，肥胖及代謝紊亂性疾病不斷增加，NAFLD的發(fā)病率也逐年升高[9]。NAFLD是一種以肝臟內(nèi)TG積聚為特征的肝臟性疾病，肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性進(jìn)而引起肝細(xì)胞凋亡是其主要的細(xì)胞損傷機(jī)制[10]。關(guān)于NAFLD的動(dòng)物模型研究較多，但由于動(dòng)物模型會(huì)出現(xiàn)個(gè)體差異較大、實(shí)驗(yàn)相關(guān)條件不易控制、周期較長(zhǎng)以及穩(wěn)定性差等缺陷，越來越多的研究者采用離體細(xì)胞模型進(jìn)行脂肪肝相關(guān)研究，細(xì)胞模型能有效縮短研究周期；其實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好；且有利于脂肪肝發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究以及大規(guī)模的藥物篩選[4]。潘雪豐等[11]進(jìn)行了油酸誘導(dǎo)的LO2與HepG2脂肪肝細(xì)胞模型的對(duì)比研究，結(jié)果表明LO2比HepG2更適合作為藥物篩選的體外細(xì)胞模型。因此，本研究采用油酸誘導(dǎo)人正常肝細(xì)胞株LO2構(gòu)建非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型，并在此模型基礎(chǔ)上進(jìn)行藥物作用研究，通過不同濃度的油酸誘導(dǎo)細(xì)胞并采用油紅O染色觀察細(xì)胞中脂滴形成情況，篩選出油酸的最適誘導(dǎo)質(zhì)量濃度為80 mg·L-1。80 mg·L-1油酸誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝細(xì)胞上清液中AST，ALT，TC和TG水平均顯著高于正常組細(xì)胞，說明離體非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型造模成功。

NAFLD在古代醫(yī)集中并無(wú)此病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸于中醫(yī)學(xué)的“肝痞”、“肝壅”、“脅痛”、“積聚”、“痰方”[12]。一般認(rèn)為NAFLD的病因?yàn)轱嬍巢还?jié)制、嗜甜油膩食物、肥胖等導(dǎo)致痰濕內(nèi)盛、脾胃失調(diào)、肝失疏泄、脈絡(luò)不和，有學(xué)者認(rèn)為脂肪肝為“脾胃不足之源，乃陽(yáng)氣不足，陰氣有余”，因而對(duì)于NAFLD的治療應(yīng)以溫陽(yáng)化氣為主，恢復(fù)其脾胃功能[13]。目前，關(guān)于NAFLD的治療主要以控制體重結(jié)合飲食治療并輔以一定的藥物治療[9]，研究表明，隨著NAFLD病情的發(fā)展，肝細(xì)胞凋亡逐漸增多，由于NAFLD的病因尚未完全闡明，且沒有專用于治療脂肪肝的藥物，因此，研究中醫(yī)藥對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響進(jìn)而了解中醫(yī)藥治療脂肪肝的相關(guān)機(jī)制具有重要的意義。本研究中四君子湯、理中湯和附子理中湯三方共用黨參、白術(shù)與炙甘草，這3味藥均具有益氣健脾的功效，四君子湯中的茯苓具有利水滲濕的功效，理中湯和附子理中湯中的干姜具有溫運(yùn)健脾的功效，附子理中湯多添加一味炮附子具有回陽(yáng)救逆的功效[14-16]。此3種中藥配方對(duì)于脂肪肝的治療已有少許報(bào)道，柳濤等[14]分別采用四君子湯、理中湯、苓桂術(shù)甘湯和腎著湯喂食脂肪肝模型大鼠，觀察4種中藥對(duì)脂肪肝療效的差異，結(jié)果表明苓桂術(shù)甘湯和腎著湯能有效促進(jìn)大鼠脂肪代謝，四君子湯和理中湯對(duì)大鼠肝組織TG水平的影響無(wú)顯著性差異。已有研究表明，四君子湯和理中湯能有效調(diào)節(jié)脾虛腸易激綜合征大鼠血清及小腸組織中NO/NOS，MOT表達(dá)水平[15]，附子理中湯可有效降低臨床脂肪肝患者的血脂和轉(zhuǎn)氨酶[16]。目前還未有四君子湯、理中湯和附子理中湯作用于離體非酒精性脂肪肝細(xì)胞的相關(guān)報(bào)道，且其對(duì)于非酒精性脂肪肝的具體作用機(jī)制尚未闡明。因此，本研究采用四君子湯、理中湯和附子理中湯分別作用于離體非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型，探討其作用效果及相關(guān)機(jī)制，結(jié)果表明四君子湯、理中湯和附子理中湯均能有效促進(jìn)非酒精性脂肪肝細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，且附子理中湯的作用效果最佳。

由于細(xì)胞凋亡與非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而PCNA，caspase-3，caspase-8，caspase-9，Bax和Bcl-2基因是增殖與凋亡相關(guān)通路中的關(guān)鍵因子。正常細(xì)胞的caspase-3，caspase-8和caspase-9處于非活化的狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞應(yīng)激凋亡刺激時(shí)，細(xì)胞通過一系列的應(yīng)激反應(yīng)，最終通過caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)caspase切割并活化（如cleaved caspase-3，cleaved caspase-8和cleaved caspase-9），最終誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，其中caspase-8和caspase-9分別參與細(xì)胞凋亡的死亡受體凋亡途徑和線粒體凋亡途徑。Bax與Bcl-2分別具有促凋亡和抗凋亡作用，PCNA與細(xì)胞增殖密切相關(guān)[17]。因此，本研究采用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞在四君子湯、理中湯和附子理中湯作用48 h時(shí)細(xì)胞中PCNA，cleaved caspase-3，cleaved caspase-8，cleaved caspase-9，Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)，以探討藥物作用效果及其相關(guān)機(jī)制。結(jié)果表明藥物作用于非酒精性脂肪肝細(xì)胞后，cleaved caspase-3，cleaved caspase-8，cleaved caspase-9和Bax蛋白的表達(dá)量降低，PCNA和Bcl-2蛋白的表達(dá)量升高，且3種湯藥組組間比較發(fā)現(xiàn)，附子理中湯的趨勢(shì)較其他2種湯藥更明顯。表明，3種湯藥均能夠增加非酒精性脂肪肝細(xì)胞的增殖相關(guān)蛋白和抗凋亡蛋白的表達(dá)，同時(shí)能夠降低促凋亡相關(guān)蛋白及凋亡執(zhí)行者的蛋白表達(dá)。

綜上所述，四君子湯、理中湯和附子理中湯3種湯藥均能有效促進(jìn)非酒精性脂肪肝細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，且附子理中湯的效果最佳，其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)周期相關(guān)蛋白和抗凋亡蛋白并下調(diào)促凋亡蛋白及凋亡執(zhí)行者的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。由于本研究?jī)H從細(xì)胞模型方面研究中藥配方對(duì)非酒精性脂肪肝的作用效果，屬于基礎(chǔ)性研究，因此，后續(xù)將繼續(xù)針對(duì)中藥配方對(duì)非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型和臨床患者的作用效果及其具體作用機(jī)制進(jìn)一步深入研究。

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