魏英+李婷婷+鄧志緯+劉貝貝+李斌

[摘要] 目的 研究湖北十堰地區(qū)女性宮頸脫落細(xì)胞人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染和亞型分布情況。 方法 收集2015年12月～2016年12月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院接受HPV檢測的8543名女性為研究對象，采用PCR基因擴(kuò)增和免疫雜交技術(shù)，進(jìn)行21種HPV亞型的基因分型檢測。 結(jié)果 總樣本數(shù)8543例，共檢查HPV陽性標(biāo)本783例（高危604例，低危179例），感染率為9.17%；其中，單一亞型感染718例，占91.70%，多重感染65例，占8.30%；前五位單一高危險(xiǎn)型分別為52型（114例）、16型（86例）、58型（84例）、53型（60例）、39型（40例），其陽性率分別為14.56%、10.98%、10.73%、7.66%、5.11%?！?5歲年齡組感染率最高為17.07%，<25歲年齡組陽性率為15.46%，25～<35歲年齡組感染率為9.20%，35～<45歲和45～<55歲年齡組感染率分別為7.76%和9.90%。 結(jié)論 湖北十堰地區(qū)女性HPV感染率較居中，以單一高危感染為主，HPV52、16、58型為前三大常見感染亞型，且各年齡段HPV感染率構(gòu)成比呈現(xiàn)“U”型走勢。

[關(guān)鍵詞] 人乳頭狀瘤病毒；感染率；基因分型；年齡

[中圖分類號] R711 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）03（c）-0107-04

HPV infection in cervix and genotype distribution of women in Shiyan of Hubei

WEI Ying1 LI Tingting2 DENG Zhiwei2 LIU Beibei2 LI Bin3

1.Experiment Center， Dongfeng Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China； 2.The Second Clinical College， Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China； 3. Department of Gynaecology and Obstetrics， Dongfeng Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China

[Abstract] Objective To investigate the infection and genotype distribution of human papilloma virus （HPV） in female cervical exfoliative cells in Shiyan， Hubei province. Methods Samples of cervical exfoliated cells were collected from 8543 female in Dongfeng Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine from December 2015 to December 2016 as study objects. Twenty-one HPV subtypes were examined by PCR gene amplification and immune hybrid technology. Results In the total sample of 8543， HPV positive was detected in 783 cases （604 cases of high risk HPV， and 179 cases of low risk HPV）， total infection rate of HPV was 9.17%. Among these positive samples， the single-subtype infection rate was 91.70% （718 cases）， and the multiple-subtype infection rate was 8.30% （65 cases）. HPV-52 （114 cases， 14.56%）， HPV-16 （86 cases， 10.98%）， HPV-58 （84 cases， 10.73%）， HPV-53 （60 cases， 7.66%） and HPV-39 （40 cases， 5.11%） were the top five prevalent subtypes. The highest HPV positive rate （17.07%） was found in older than 55 years age group. The rate of younger than 25 group was 15.46%， the rates of 25-<35 years， 35-<45 years and 45-<55 years age group was 9.20%， 7.76% and 9.90% respectively. Conclusion The female HPV infection rate in Shiyan Area is median， and the single and high-risk subtype infection accounts for a considerable proportion. HPV-52， HPV-16 and HPV-58 are the top three prevalent subtypes， and the distribution of HPV infection rate in each age group presented "U" shaped trend.

[Key words] Human papilloma virus； Infection rate； Genotype； Age

宮頸癌是全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因，全球每年有530 000例新發(fā)病例和275 000例死亡病例[1]。宮頸癌是全球第三大常見的癌癥，但在發(fā)達(dá)國家是第六個(gè)最常見的癌癥，而在資源有限的國家卻是第二個(gè)最常見的癌癥[2]。在中國，宮頸癌的發(fā)病率每年增加2%～3%，每年大約有135 000例宮頸癌新發(fā)病例，且每年大約有50 000名女性死于宮頸癌[3-4]。

宮頸癌有較長的癌前病變期，通過全民篩查和組織病理學(xué)檢測，可有效降低宮頸癌的發(fā)病率。人乳頭狀瘤病毒（HPV）檢測是宮頸癌篩查的重要手段，流行病學(xué)研究顯示，HPV感染是宮頸癌和癌前病變的主要原因[5]。HPV基因組有8000對堿基，呈球形，無包膜，是超螺旋雙鏈環(huán)狀DNA病毒。在人和動(dòng)物中分布廣泛，具有高度的種屬特異性。到目前為止，已鑒定出超過100種HPV基因型，有54種可以感染生殖道黏膜[6]。根據(jù)感染生殖道黏膜HPV菌株的致癌性顯著不同將其分為低危型和高危型[7]，高危型HPV的持續(xù)感染與宮頸癌密切相關(guān)。已經(jīng)證明，幾乎所有類型的宮頸癌（鱗狀細(xì)胞癌、腺鱗癌和腺癌）都與高危型HPV感染有關(guān)。根據(jù)流行病學(xué)和分子生物學(xué)報(bào)告，至少有15中HPV基因型已經(jīng)確認(rèn)為宮頸癌的高危因素（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68）[8]。因此，HPV感染的檢測，特別是高危HPV感染的檢測，已經(jīng)成為預(yù)防宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵問題。

HPV感染率及基因型的分布，特別是高危型基因的分布，在不同國家和地區(qū)顯示出多樣性，在中國各省市也大大不同，這種地區(qū)的多樣性對未來針對特定地區(qū)人群設(shè)計(jì)有效預(yù)防HPV疫苗至關(guān)重要。湖北十堰地區(qū)地理位置獨(dú)特，衛(wèi)生健康條件相對匱乏，尚無有關(guān)HPV感染流行病學(xué)調(diào)查的報(bào)告。這項(xiàng)研究針對該地區(qū)8543例女性宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行了HPV的感染率和基因型分布的初步分析，發(fā)現(xiàn)了該地區(qū)HPV感染的特點(diǎn)，為該地區(qū)宮頸癌篩查和疫苗的預(yù)防戰(zhàn)略提供了理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年12月～2016年12月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院進(jìn)行HPV檢測的8543名女性。所納入的對象均簽署知情同意書自愿參加本研究調(diào)查。

1.2 儀器與試劑

核酸提取液試劑盒、HPV分型檢測PCR試劑盒和HPV分型檢測雜交試劑盒均購自凱普生物科技有限公司；PCR擴(kuò)增儀器（美國Applied Biosystems公司）；自動(dòng)雜交儀器（凱普生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 患者均處于非月經(jīng)期，采集樣本前1 d無性生活，且檢測前3 d無陰道用藥。樣本采集由專業(yè)婦科醫(yī)生負(fù)責(zé)，先用無菌棉拭子擦拭宮頸口可見的分泌物，再將宮頸刷置于宮頸口，輕輕搓動(dòng)宮頸刷使其順時(shí)針旋轉(zhuǎn)5圈，刷取宮頸脫落細(xì)胞，放入加有專用細(xì)胞保存液的取樣管中保存。樣本采集后立即送檢。4℃保存不超過24 h，標(biāo)本運(yùn)送時(shí)采用低溫保存運(yùn)送。

1.3.2 DNA分離提取與PCR擴(kuò)增 取保存有宮頸細(xì)胞的細(xì)胞保存液1.0 mL，以14 000 r/min離心1 min，棄去上清液，用核酸提取試劑盒提取DNA。取2 μL DNA提取液，加入PCR擴(kuò)增體系，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物90 ℃變性10 min，立即取出冰浴5 min。

1.3.3 PCR產(chǎn)物雜交 按照試劑的說明書及儀器操作數(shù)進(jìn)行操作。已變性DNA樣品溶液加入0.3 mL預(yù)熱至45℃的雜交液，開啟自動(dòng)雜交程序。雜交完畢用鑷子取出雜交膜放在吸水紙上，1 h內(nèi)分析結(jié)果。

1.3.4 結(jié)果判定 檢測結(jié)果陽性點(diǎn)為清晰可見的藍(lán)紫色圓點(diǎn)；根據(jù)膜條HPV分型分布圖，判斷陽性點(diǎn)為何種類型HPV；Biotin對照點(diǎn)，反映酶與顯色底物反應(yīng)，在檢測中應(yīng)為陽性。內(nèi)對照點(diǎn)（IC）為質(zhì)控模板DNA探針，若擴(kuò)增反應(yīng)體系中沒有抑制因素，IC點(diǎn)出現(xiàn)；以上兩對照點(diǎn)為陽性，其他點(diǎn)為陰性，應(yīng)判定該樣本檢測結(jié)果為陰性，如果有一個(gè)HPV分型點(diǎn)為陽性，代表該樣本為單一HPV感染，一個(gè)以上分型點(diǎn)為陽性代表該樣本為多重HPV感染。

1.4 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)患者HPV感染的情況以及不同亞型檢出率的分布情況，比較不同年齡組HPV的感染率及不同基因型的分布情況。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染的總體情況

在接受HPV檢測的8543名患者中，一共檢出783例HPV陽性病例，陽性率為9.17%；其中高危604例，低危179例。前五位單一高危險(xiǎn)型分別為HPV52型（114例）、HPV16型（86例）、HPV58型（84例）、HPV53型（60例）、HPV39型（40例），其陽性率分別為14.56%、10.98%、10.73%、7.66%、5.11%。見表1。

2.2 各年齡段患者HPV檢出率

<25歲年齡組陽性率為15.46%，25～<35歲年齡組感染率為9.20%，35～<45歲年齡組感染率為7.76%，45～<55歲年齡組感染率為9.90%，≥55歲年齡組感染率為17.07%。見表2。

2.3 HPV感染情況

在檢測的8488例樣本中，既有單一型HPV感染，也有兩種及以上基因型的混合感染，樣本的陽性例數(shù)為783例，其中單重陽性數(shù)為718例，單重陽性率為91.70%，多重陽性數(shù)為65例，多重陽性率為8.30%。見表3。

表3 HPV單一和多重感染陽性率

3 討論

隨著分子流行病學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌的發(fā)病主要與HPV感染有關(guān)，43%～53%的宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變患者存在HPV感染，約有90%的宮頸癌患者存在HPV感染[9]。HPV是一種屬于乳多孔病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，無包膜，呈球形，病毒基因組是超螺旋雙鏈環(huán)狀DNA，能引起人體黏膜皮膚的鱗狀上皮增殖。HPV是女性陰道中較常見的病原體，正常情況下其感染時(shí)間短暫，依靠陰道黏膜的自凈能力很快消失。如果HPV在陰道中長期持續(xù)感染，則會(huì)導(dǎo)致宮頸上皮的異常增生與癌變。HPV感染屬于性傳播疾病，性活躍期婦女普遍易感，我國每年宮頸癌的發(fā)病率按照2%～3%的速度持續(xù)增高[10]。

根據(jù)HPV致病因素分為高危型和低危型。HPV基因型的分布，特別是高危型基因的分布，在不同地區(qū)顯示出多樣性，這種地區(qū)的多樣性對未來針對特定地區(qū)人群設(shè)計(jì)有效預(yù)防HPV疫苗至關(guān)重要。在西方國家，HPV16和HPV18是兩個(gè)主要的基因型，與70%的侵襲性宮頸癌相關(guān)[11]。而在中國，一些HPV流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，HPV感染基因型存在明顯的地區(qū)差別[12-13]。李霓等[14]在對我國婦女HPV感染的多中心橫斷面研究中發(fā)現(xiàn)，感染率最高的為HPV16型，HPV58型位居第二，HPV52位列第三。在該研究查出十堰地區(qū)783例HPV感染病例，共發(fā)現(xiàn)15種高危HPV基因型，其中前五大基因型為HPV52（14.56%）、HPV16型（10.98%）、HPV58型（10.73%）、HPV53型（7.66%）、HPV39型（5.11%）。這與李霓等[14]報(bào)道的HPV感染多中心橫斷面研究存在一定的差異，但排前三位的基因型是一樣的，此差異的存在尚需進(jìn)一步的研究。

年齡是HPV感染的一個(gè)最重要的危險(xiǎn)因素[15]。類似于先前的報(bào)道[16]，本研究中十堰地區(qū)HPV感染率與年齡也呈現(xiàn)“U”型曲線。如表2所示，HPV感染的陽性率在年齡≥55歲組中最高（17.07%），其次是年齡<25歲組（15.46%）。出現(xiàn)“U”型分布的原因可能為年輕女性有更頻繁的性接觸[17]；絕經(jīng)期卵巢功能下降造成激素的明顯波動(dòng)，再加上衰老導(dǎo)致免疫功能下降，消除和抑制病毒的能力減弱，這些因素增加了HPV持續(xù)感染的易感性，且容易形成多重感染[18]。因此，本研究結(jié)果提示，湖北十堰地區(qū)應(yīng)該更多地關(guān)注年齡<25歲和≥55歲女性的HPV基因分型和宮頸癌的篩查。

女性一生中可能反復(fù)感染HPV，也可存在多重感染。HPV的持續(xù)感染與宮頸癌的發(fā)病關(guān)系密切，控制HPV的持續(xù)感染是預(yù)防宮頸癌的重要措施。最近的研究表明，HPV多重感染形成的癌癥比單重感染在治療中更具有耐藥性，HPV多重感染的宮頸癌患者治療失敗率是HPV單重感染的5倍[19]。但HPV多重感染在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中所扮演的角色仍是一個(gè)比較難的考察區(qū)域，目前尚不清楚是否有兩種HPV基因型存在更多或者更少合并感染的機(jī)會(huì)。研究表明，HPV多重感染發(fā)生宮頸癌癌前病變或侵襲性癌癥的風(fēng)險(xiǎn)并沒有比HPV單純感染高；而另一些研究表明，HPV多重感染似乎對宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展具有協(xié)同作用[20-21]。本研究8488例樣本中，多重感染率較低，僅65例。應(yīng)該注意的是，本研究存在一定的局限性，研究中使用的HPV試劑盒只可以檢測已知的HPV基因型中的21種類型；因此，多重感染的患病率可能在某種程度上被低估。此外，有關(guān)該地區(qū)HPV感染率與宮頸癌癌前病變或侵襲性癌癥的發(fā)病率間的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

總之，十堰地區(qū)總共發(fā)現(xiàn)15個(gè)HPV高?；蛐?，以單一高危感染為多見，HPV52、16、58、53、39為前五個(gè)基因型；<25歲和≥55歲兩個(gè)年齡組HPV感染率最高，構(gòu)成比呈現(xiàn)“U”型走勢。

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（收稿日期：2016-12-09 本文編輯：李亞聰）