余雪君+劉欣艷+李彩榮+王錦俊+趙純誠(chéng)+盛霞+陶玙婧

[摘要] 目的 探討非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-2（TIMP-2）的表達(dá)與肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。 方法 收集上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院2012年1月～2015年12月臨床和病理確診的56例NSCLC標(biāo)本，其中25例肺鱗癌、31例肺腺癌；另取20例癌旁正常肺組織作為陰性對(duì)照，用免疫組化SP法檢測(cè)標(biāo)本中VEGF、MMP-2和TIMP-2的表達(dá)。 結(jié)果 VEGF、MMP-2和TIMP-2在肺癌和正常肺組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；VEGF和MMP-2的表達(dá)與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈正相關(guān)（P < 0.05），TIMP-2的表達(dá)與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈負(fù)相關(guān)（P < 0.05），但都與病理類(lèi)型無(wú)關(guān)（P > 0.05）。 結(jié)論 VEGF、MMP-2和TIMP-2的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為評(píng)價(jià)肺癌組織侵襲和轉(zhuǎn)移能力的指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 非小細(xì)胞肺癌；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-2；免疫組織化學(xué)；腫瘤轉(zhuǎn)移

[中圖分類(lèi)號(hào)] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）03（b）-0107-04

Expression of vascular endothelial growth factor， matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 in non small cell lung carcinoma and its clinical significance

YU Xuejun1 LIU Xinyan1 LI Cairong1 WANG Jinjun1 ZHAO Chuncheng2 SHENG Xia3 TAO Yujing1

1.Department of Geriatrics， Central Hospital of Shanghai Putuo District， Shanghai 200062， China； 2.Department of Thoracic Surgery， Central Hospital of Shanghai Putuo District， Shanghai 200062， China； 3.Department of Pathology， Central Hospital of Shanghai Putuo District， Shanghai 200062， China

[Abstract] Objective To study the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF）， matrix metalloproteinase-2 （MMP-2） and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 （TIMP-2） in non small cell lung carcinoma （NSCLC） and their relationship with invasion and metastasis of the lung cancerous tissues. Methods Fifty-six cases of human NSCLC tissues which had clinical and pathological diagnosis were collected from the Central Hospital of Shanghai Putuo District from January 2012 to December 2015. Among them， 25 cases had lung squamous cell carcinoma and 31 cases had lung adenocarcinoma. Another 20 cases of adjacent normal lung tissue were taken as a negative control. The expression of VEGF， MMP-2 and TIMP-2 were detected by SP immunohistochemical technique in all specimens. Results The expression of VEGF， MMP-2 and TIMP-2 in lung carcinoma and normal lung tissues were statistically significantly different （P < 0.05）. There were positive correlations between the expression of VEGF and MMP-2 with lymph node metastasis and clinical stage （P < 0.05）， but there was negative correlation between the expression of TIMP-2 with lymph node metastasis and clinical stage respectively （P < 0.05）. The expression of VEGF， MMP-2 and TIMP-2 had no association with pathological type （P > 0.05）. Conclusion The expression of VEGF， MMP-2 and TIMP-2 are associated with the invasion and metastasis in lung carcinoma， which may be potentially useful for indicating the metastasis and invasion of lung carcinoma.

[Key words] Non small cell lung carcinoma； Vascular endothelial growth factor； Matrix metalloproteinase-2； Tissue inhibitor of metalloproteinase-2； Immunohistochemistry； Tumor metastasis

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類(lèi)型，占肺癌總數(shù)的80%～85%，已成為致死率最高的腫瘤[1]，而且，有80%以上的患者死于侵襲和轉(zhuǎn)移[2]，因此研究NSCLC侵襲與轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制，對(duì)制訂正確的治療方案及判斷預(yù)后具有重要的臨床意義。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是多因素、多步驟的生物學(xué)過(guò)程，涉及到腫瘤血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解等變化[3]。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）是目前發(fā)現(xiàn)的刺激腫瘤血管生成最重要的因子，可直接或間接地促進(jìn)血管生成[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）水解ECM，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-2（TIMP-2）是MMP-2的抑制劑，正常情況下二者處于平衡狀態(tài)，當(dāng)TIMP-2水平高時(shí)，會(huì)抑制MMP-2的激活，而當(dāng)TIMP-2水平低時(shí)，則介導(dǎo)MMP-2的激活[5-6]。本研究采用免疫組化SP法檢測(cè)肺癌中VEGF、MMP-2和TIMP-2的表達(dá)，探討肺癌組織侵襲和轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制，為其生物學(xué)行為的判斷和臨床預(yù)后提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集普陀區(qū)中心醫(yī)院2012年1月～2015年12月行手術(shù)治療且術(shù)前未經(jīng)化療、放療及免疫治療的56例NSCLC標(biāo)本（NSCLC組），均經(jīng)臨床表現(xiàn)和手術(shù)病理確診為NSCLC，均在患者的知情同意下進(jìn)行。另取20例癌旁正常肺組織作為陰性對(duì)照（對(duì)照組），所取組織距病灶邊緣5 cm以上。NSCLC組中，男41例，女15例，年齡43～73歲，平均（62.25±12.37）歲；對(duì)照組中，年齡44～72歲，平均（61.86±11.83）歲，兩組年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。NSCLC中，鱗癌25例，腺癌31例；臨床分期采用國(guó)際抗癌聯(lián)盟分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期12例，Ⅱ期26例，Ⅲ期14例，Ⅳ期4例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例；腫瘤分化中、高度44例，低分化12例。

1.2 研究方法

所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋和切片，HE染色和病理學(xué)診斷。石蠟切片厚4 μm，采用免疫組化常規(guī)SP法，按說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行。VEGF、MMP-2和TIMP-2單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照。采用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0分析免疫組化片結(jié)果。

1.3 結(jié)果判斷

VEGF、MMP-2和TIMP-2陽(yáng)性判定：均以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽(yáng)性[7-8]。根據(jù)腫瘤細(xì)胞胞漿染色的程度及染色細(xì)胞百分率，以下列符號(hào)表示[9]：“-”表示無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞率為0；“+”表示陽(yáng)性細(xì)胞率為10%～<40%；“++”表示陽(yáng)性細(xì)胞率為40%～ <70%；“+++”表示陽(yáng)性細(xì)胞率≥70%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF、MMP-2和TIMP-2在肺癌組織和正常癌旁組織中的表達(dá)

PBS陰性對(duì)照組未著色。VEGF、MMP-2和TIMP-2在NSCLC組中的表達(dá)陽(yáng)性率均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 肺癌VEGF、MMP-2和TIMP-2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

NSCLC腺癌組織VEGF、MMP-2和TIMP-2的表達(dá)均略高于鱗癌，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），說(shuō)明三者的表達(dá)均與肺癌的病理類(lèi)型無(wú)關(guān)。VEGF和MMP-2的表達(dá)在高中分化肺癌組織中比低分化組織中低，但TIMP-2的表達(dá)卻比低分化組織的高（P < 0.05），說(shuō)明三者的表達(dá)與肺癌的分化程度有關(guān)。VEGF和MMP-2的表達(dá)隨臨床分期的增加而增加，Ⅰ期患者的陽(yáng)性率均高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），但TIMP-2的表達(dá)隨臨床分期的增加而減少（P < 0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者VEGF和MMP-2的表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P < 0.05），但TIMP-2的表達(dá)低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

VEGF是一種高度特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂因子，通過(guò)與其特異性受體結(jié)合，釋放多種細(xì)胞因子與生長(zhǎng)因子，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)新生血管生成，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用[10-11]。本研究表明，VEGF的表達(dá)隨臨床分期的增加而增加，而且與肺癌分化程度相關(guān)，分化程度越低，表達(dá)越高，在臨床上，惡性程度越高的腫瘤，越容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[12]，這就提示VEGF可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了重要的作用。而且，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，VEGF的表達(dá)在正常肺組織和肺癌中有顯著性差異，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的VEGF表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，說(shuō)明VEGF的表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管的生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，在肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮作用。梁乃超等[13]檢測(cè)NSCLC組織的VEGF水平，發(fā)現(xiàn)肺癌組織中的VEGF水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常肺組織，本研究結(jié)果與其一致。常超等[14]發(fā)現(xiàn)VEGF-C、VEGF-D及其受體VEGFR-3蛋白在NSCLC中表達(dá)顯著增高，并可促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)，可見(jiàn)VEGF表達(dá)率有可能作為診斷肺癌的一項(xiàng)生物學(xué)標(biāo)志，同時(shí)具有能夠判斷肺癌是否轉(zhuǎn)移的潛能。

MMPs是一類(lèi)在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)作用的鋅離子依賴(lài)的內(nèi)源性蛋白水解酶[15]，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子是MMPs的天然抑制劑，TIMP-2可與活化的或無(wú)活性的MMP-2結(jié)合，抑制MMP-2的活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞侵襲[16-19]。MMP-2與TIMP-2之間的平衡在腫瘤進(jìn)展中具有重要意義，正?；蛟缙诘哪[瘤MMP-2/TIMP-2的比值接近1.0，而重度和晚期的腫瘤卻高得多[20-23]，體外腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)也證明，MMP-2/TIMP-2的比值與其侵襲能力相關(guān)[24-25]。在本研究中，正常肺組織MMP-2和TIMP-2陽(yáng)性表達(dá)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于肺癌，表達(dá)量的差異具有顯著性，說(shuō)明在正常生理情況下，MMP-2和TIMP-2的表達(dá)處于一種動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài)。MMP-2的表達(dá)與臨床分期、肺癌分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，但TIMP-2的表達(dá)與臨床分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明在惡性程度越高的腫瘤中，TIMP-2由于其表達(dá)量降低，因而不能抑制表達(dá)越來(lái)越多的MMP-2的活性，導(dǎo)致MMP-2/TIMP-2的比值不斷增高，MMP-2發(fā)揮其水解細(xì)胞外基質(zhì)的作用，最終腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。

總之，本研究結(jié)果提示，VEGF、MMP-2和TIMP-2的表達(dá)與NSCLC的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系，也可能是肺癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制之一，可作為臨床判斷肺癌轉(zhuǎn)移能力的指標(biāo)，為深入研究肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了新的方向。

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