尹彥波 袁雅生 遲放魯

(復旦大學附屬眼耳鼻喉醫(yī)院耳鼻喉科 上海 200031)

隱性聽力下降小鼠耳蝸內(nèi)毛細胞突觸的病理改變

尹彥波 袁雅生 遲放魯△

(復旦大學附屬眼耳鼻喉醫(yī)院耳鼻喉科 上海 200031)

目的 探討噪聲暴露后出現(xiàn)暫時性閾移的小鼠在聽覺反應閾值完全恢復正常后耳蝸內(nèi)毛細胞突觸的病理改變。方法 將小鼠分為正常對照組和實驗組,實驗組小鼠進行強度98 dB SPL、時長2 h的噪聲暴露,建立暫時性閾移模型。將對照組和暫時性閾移模型小鼠進行全基底膜鋪片并行免疫熒光染色,共聚焦顯微鏡拍照成像并觀察細胞形態(tài)。利用耳蝸長度計算耳蝸所處的頻率位置,最后用圖形處理軟件對突觸結(jié)構(gòu)進行三維重建,觀察對照組小鼠和實驗組小鼠的耳蝸內(nèi)毛細胞突觸前、后結(jié)構(gòu)的空間分布規(guī)律及其病理改變特點。結(jié)果 對照組小鼠耳蝸內(nèi)毛細胞的突觸復合體有明顯的分布特點,每個內(nèi)毛細胞通過5～30個突觸與耳蝸神經(jīng)纖維形成突觸連接,靠近蝸軸側(cè)的突觸前結(jié)構(gòu)體積較大,與之相匹配的突觸后結(jié)構(gòu)體積較小。靠近柱細胞側(cè)的突觸前結(jié)構(gòu)體積偏小,與之相匹配的突觸后結(jié)構(gòu)體積偏大。實驗組小鼠在高強度噪聲暴露后第2天聽覺測試結(jié)果顯示,聽性腦干反應(auditory brain-stem response,ABR)和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(distortion product otoacoustic emission,DPOAE)閾值升高30～40 dB,2周后再次測試顯示閾值恢復正常,但是ABR的Ⅰ波波幅下降46.1%,且耳蝸內(nèi)毛細胞的突觸復合體結(jié)構(gòu)數(shù)量也減少了41.3%。 而內(nèi)毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞沒有明顯丟失。結(jié)論聽覺閾值功能測試對判斷小鼠耳蝸內(nèi)毛細胞突觸的損害和丟失不敏感;而聽覺閾上功能測試對評價小鼠耳蝸內(nèi)毛細胞突觸的損害和丟失相對敏感。

噪聲性聾; 暫時性閾移; 隱性聽力下降; 突觸; 小鼠

耳聾是臨床上常見的疾病,往往嚴重影響患者的生活質(zhì)量。導致耳聾的病因有基因因素,也有環(huán)境因素(如噪聲暴露、創(chuàng)傷和藥物等)。每年有出生缺陷的新生兒中,就包括大量的聽力障礙患兒。據(jù)中國殘疾人聯(lián)合會的抽樣調(diào)查統(tǒng)計顯示,我國聽力殘疾人數(shù)約占總殘疾人數(shù)的1/4。輕中度聽力障礙患者可以借助助聽器來改善聽力;重度聽力障礙患者需要安裝價格昂貴的人工耳蝸來恢復聽力[1],這些都會給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟和精神負擔。因此,早期發(fā)現(xiàn)聽力下降和盡早實施臨床干預可以避免和減輕聽力障礙的進一步加重。

目前國內(nèi)職業(yè)病防治所和許多企業(yè)都非常重視噪聲性聾的防護工作,對長期在噪聲環(huán)境下工作的工人發(fā)放防噪耳塞并進行定期的聽力檢測和篩查,一旦發(fā)現(xiàn)異常,盡早調(diào)離噪聲工作崗位,避免聽力的進一步下降和嚴重傷害[2]。但是,許多聽力障礙患者并不能及時就醫(yī)進行診斷和治療。尤其對于那些隱性聽力下降的患者,臨床并不能及時發(fā)現(xiàn)。因此,及早發(fā)現(xiàn)聽力下降比較隱匿的人群、及早給予預防和治療具有重要的臨床意義。

本研究擬對小鼠在噪聲暴露箱內(nèi)實施2 h 98 dB的噪聲暴露,暴露后第2天及2周后進行聽力測試,并觀察小鼠耳蝸內(nèi)毛細胞基底區(qū)的突觸結(jié)構(gòu)及病理改變,以期為隱性聽力下降的臨床患者的研究提供更多的實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

實驗動物及主要試劑 SPF級CBA小鼠,18～22 g,8～10周齡,按照隨機數(shù)表法分為對照組(18只)和實驗組(18只),動物飼養(yǎng)及動物實驗方案均嚴格按照動物倫理委員會實驗動物規(guī)范執(zhí)行。

隱性聽力下降動物模型的建立 將實驗組小鼠放入噪聲暴露箱中,98 dB (8～16 kHz)噪聲暴露2 h,噪聲箱內(nèi)進行噪聲暴露前必須先進行校準,以保住噪聲暴露的一致性。

電生理數(shù)據(jù)的采集 兩組小鼠腦干誘發(fā)電位和耳聲發(fā)射測試均在隔音室內(nèi)測試,室內(nèi)溫度控制在31 ℃。使用胺酮(100 mg/kg,i.p)和甲苯噻嗪(10 mg/kg,i.p)聯(lián)合用藥進行麻醉,腦干誘發(fā)電位的刺激信號采用5 ms的短純音,刺激速率固定在30次/秒。耳聲發(fā)射的兩個頻率比為1∶1.2,兩個頻率的強度差為10 dB。得到的畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射信號頻率為2f1-f2。

全基底膜鋪片 所有小鼠全身心臟灌注4%甲醛溶液固定,然后耳蝸灌注固定,在4%多聚甲醛溶液里放置2 h;EDTA除鈣2天,加入5%的馬血清,室溫靜置1 h;加入一抗,37 ℃過夜;加入小鼠(IgG1)抗CtBP2@1∶200,小鼠(IgG2α)抗GluA2@1∶2 000兔抗VAT@1∶200;第2天,沖洗3次,用時10 min;加入二抗,37 ℃靜置1 h;加入山羊抗小鼠(IgG1)@1∶1 000,山羊抗小鼠(IgG2a)@1∶1 000,雞抗兔@1∶200,沖洗;加入二抗,37 ℃靜置1 h;加入山羊抗小鼠(IgG1)@1∶1 000,山羊抗小鼠(IgG2a)@1∶1 000,雞抗兔@1∶200,沖洗。加入小鼠抗TuJ抗體@1∶500。加入小鼠抗PV31∶300。具體染色步驟和方法參考文獻[3]。

免疫熒光共聚焦成像 使用德國Zeiss共聚焦顯微鏡觀察兩組小鼠完整的內(nèi)毛細胞和突觸的形態(tài),每張圖片上有大約10個內(nèi)毛細胞,這些圖像最終由Amira Imaging 圖像處理軟件進行突觸形態(tài)的分析。

統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

正常突觸結(jié)構(gòu)的分布規(guī)律 共聚焦顯微鏡下可見,對照組小鼠每個突觸復合體的前結(jié)構(gòu)和后結(jié)構(gòu)完美地匹配在一起,靠近蝸軸側(cè)的突觸前結(jié)構(gòu)體積偏大,與之相對應的突觸后結(jié)構(gòu)體積偏小。在蝸軸側(cè)和柱式細胞側(cè)的這一條軸在線,突觸前結(jié)構(gòu)逐漸變小,突觸后結(jié)構(gòu)逐漸變大。到了柱式細胞側(cè),突觸前結(jié)構(gòu)體積偏小,突觸后結(jié)構(gòu)體積偏大,低放電率的傳入纖維分布在蝸軸一側(cè),具有體積大的突觸前結(jié)構(gòu)(CtBP2)和體積小的突觸后結(jié)構(gòu)(GluA2),處理安靜環(huán)境下低強度(閾值強度)刺激的聲音。高放電率的傳入纖維分布在柱細胞一側(cè),具有體積小的突觸前結(jié)構(gòu)和體積大的突觸后結(jié)構(gòu),處理噪聲環(huán)境下高強度(閾上強度)刺激的聲音。螺旋神經(jīng)節(jié)發(fā)出的不同放電率的傳入神經(jīng)纖維通過突觸和內(nèi)毛細胞連接。每個內(nèi)毛細胞連接5～30個耳蝸傳入神經(jīng)纖維,不同的頻率連接的神經(jīng)纖維數(shù)目不一樣。敏感頻率連接的耳蝸傳入神經(jīng)纖維數(shù)目較多,非敏感頻率(低頻和高頻)連接的耳蝸傳入神經(jīng)纖維數(shù)目較少,這樣的解剖結(jié)構(gòu)符合生物對外界不同頻率和不同強度聲音的敏感性(圖1)。

A:Inner hair cell area innmunostained for presynaptic ribbons.B:Inner hair cell area innmunostained for postsynaptic glutamate receptors.C:Inner hair cell area innmunostained for presynaptic ribbons,postsynaptic glutamate receptors and efferent terminals.

暫時性閾移小鼠聽覺反應閾值的變化 噪聲暴露的強度大小和時間長短對耳蝸損害的部位和程度有密切關(guān)系。實驗組小鼠在98 dB SPL的噪聲暴露2 h,暴露后的第1天,ABR和DPOAE閾值均升高了30～40 dB,2周后測試閾值均已恢復正常。對閾移進行統(tǒng)計學分析,發(fā)現(xiàn)噪聲暴露后1天,與正常閾值相比閾值移動差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),但2周后閾值恢復正常,與正常閾值相比差異無統(tǒng)計學意義(圖2)。

暫時性閾移聽覺反應閾值恢復正常后耳蝸內(nèi)毛細胞突觸的病理改變 共聚焦顯微鏡觀察到突觸復合體的數(shù)量明顯減少,減少數(shù)量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);突觸后結(jié)構(gòu)明顯減少,突觸前結(jié)構(gòu)孤立地存在靠近細胞核的細胞質(zhì)中,而不是靠近細胞膜處。突觸形態(tài)上數(shù)量的明顯減少引起了耳蝸功能的改變(圖3)。

暫時性閾移聽閾恢復后小鼠的ABR Ⅰ波波幅的改變 2周后實驗組小鼠ABR閾值恢復正常,但ABR的Ⅰ波波幅在32 kHz下降明顯,下降幅度達40%～50%,Ⅰ波反應的生理解剖部位就是耳蝸傳入神經(jīng),暫時性閾移的小鼠模型造成了內(nèi)毛細胞之后的突觸復合體數(shù)量減少,傳入神經(jīng)的神經(jīng)興奮沖動減少。在聽覺閾上功能測試結(jié)果中,ABR Ⅰ波的波幅出現(xiàn)明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),閾上測試結(jié)果顯示聽覺功能的改變與突觸區(qū)的病理改變相一致(圖4)。

圖2 小鼠噪聲暴露(98 dB SPL,2 h)后ABR和DPOAE閾值的變化Fig 2 Changes of ABR and DPOAE thresholds after acoustic trauma (98 dB SPL,2 h) in mice

A:Presynaptic ribbon of pre-trauma; B:Postsynaptic glutamate receptor of pre-trauma; C:Presynaptic ribbon of post-trauma;D:Postsynaptic glutamate receptor of post-trauma.

圖4 小鼠噪聲暴露(98 dB SPL,2 h)后 ABR Ⅰ波波幅的變化Fig 4 Changes of ABR Ⅰ amplitude after acoustic trauma (98 dB SPL,2 h) in mice

暫時性閾移聽覺反應閾值恢復正常后內(nèi)毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的計數(shù)變化 通過免疫熒光染色可以清晰地觀察到小鼠內(nèi)毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的形態(tài)和數(shù)量,通過計數(shù)后發(fā)現(xiàn)暴露前后差異無統(tǒng)計學意義(圖5、6)。具體計數(shù)方法參考文獻[3]。

A:Inner hair cells were stained with presynaptic and postsynptic markers and was highlighted by dashed circles and numbered.B:A 3D surface of inner hair cells was created in Amira Imaging inner hair cells were numbered.

討 論

Red:Parvalbumin3 was used as an immunomarker for SGCS and hair cells.Green:Anti-neurofilament was used to label the auditory nerve fibers.

在日常生活和工作中,每個人接觸噪聲的強度大小和時間長短都不相同,因此所導致的聽覺功能異常的程度和癥狀也不盡相同。臨床上進行的聽覺功能測試分為閾值功能測試和閾上功能測試,這些測試結(jié)果可以顯示不同程度和不同性質(zhì)的聽覺功能障礙[4-5]。如爆震性耳聾,通常會伴有內(nèi)耳耳蝸機械性的損傷,有些可逆,有些則不可逆[6]。在短時間的噪聲暴露之后,聽覺功能都會有不同程度損傷和恢復。有些聽閾可以完全恢復正常(暫時性的閾值移動),有些聽閾的升高會一直維持在一定的水平、不能恢復正常(永久性的閾值移動)。永久性閾移的病變部位主要在耳蝸的內(nèi)毛細胞和外毛細胞,在強聲暴露后的數(shù)天時間里就可以觀察到毛細胞的受損和死亡[7]。然而,螺旋神經(jīng)元細胞的胞體以及與內(nèi)毛細胞基底區(qū)相連接的神經(jīng)末梢的病理改變通常會在噪聲暴露后的數(shù)月或數(shù)年的時間后發(fā)生。傳統(tǒng)觀點認為傳入神經(jīng)元發(fā)生的病理改變,主要是因為內(nèi)毛細胞的死亡和丟失后,導致傳入神經(jīng)元失營養(yǎng)造成。由于失去了與內(nèi)毛細胞的突觸連接才最終導致蝸后傳入神經(jīng)元的退行性變化[8]。在暫時性閾移的動物模型中,實驗數(shù)據(jù)顯示內(nèi)毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)并沒有死亡,卻仍然可以觀察到耳蝸傳入神經(jīng)纖維的末端腫脹病變,這種損傷已經(jīng)被證實為谷氨酸的興奮性毒性,這種毒性確實可以造成耳蝸傳入神經(jīng)纖維末端的損傷[9]。有實驗表明,谷氨酸拮抗劑可以阻斷和緩解聲音誘發(fā)的興奮性毒性作用。對噪聲性聽覺損害有不同程度的保護和防護作用。也有實驗數(shù)據(jù)表明,即使在沒有聲音誘發(fā)的情況下,也可以用人工的谷氨酸激動劑來模擬出來這種興奮性毒性[10]。

本實驗研究的暫時性閾移小鼠模型,電生理和病理結(jié)果顯示耳蝸內(nèi)毛細胞的結(jié)構(gòu)沒有受損,聽覺反應閾值也沒有受到影響。但是在內(nèi)毛細胞基底區(qū)的突觸復合體區(qū)域可以觀察到突觸前結(jié)構(gòu)和突觸后結(jié)構(gòu)發(fā)生的不可逆的病理改變。盡管ABR的閾值恢復到了正常,但是ABR閾上功能的測試結(jié)果顯示耳蝸的聽覺功能發(fā)生了明顯的改變,這些實驗結(jié)果可以解釋部分臨床現(xiàn)象,雖然有些患者在安靜環(huán)境中的聽力測試閾值正常,但是在噪聲環(huán)境下仍然會存在著不同程度的交流障礙。

本實驗使用8～16 kHz的窄帶噪聲98 dB持續(xù)暴露2 h。在噪聲暴露后的第2天,ABR和DPOAE的閾值升高了30～40 dB,但是在暴露后的2周,ABR和DPOAE的閾值均又恢復到了正常。仔細觀察突觸復合體的機構(gòu)后發(fā)現(xiàn),突觸復合體丟失集中出現(xiàn)在32 kHz的區(qū)域,失去突觸后結(jié)構(gòu)以后,突觸前結(jié)構(gòu)會發(fā)生移動,從靠近細胞膜區(qū)域移動到靠近細胞核附近的細胞質(zhì)中。說明一部分存在的突觸前結(jié)構(gòu)已經(jīng)失去功能,從而失去了和細胞后結(jié)構(gòu)的連接。此時再進行聽覺閾上功能測試,發(fā)現(xiàn)ABR Ⅰ波的波幅僅恢復到暴露前的40%～50%,提示暫時性閾移的小鼠模型其耳蝸內(nèi)存在部分神經(jīng)病理學和閾上功能的改變,但聽力測試閾值正常,因此可以想象,若患者耳蝸也存在此種改變,則這些病理改變在臨床上很容易被忽視。小鼠耳蝸的這些病理改變并未在ABR和DPOAE的閾值上表現(xiàn)出來,而是在神經(jīng)反應的幅值上表現(xiàn)了出來。神經(jīng)反應幅值大小由參與神經(jīng)反應的神經(jīng)纖維的數(shù)量決定。當外界給予個體閾值強度的聲音信號刺激時,僅需要少量的神經(jīng)纖維參與即可完成對這些閾值強度聲音的感知,不需要所有的突觸復合體和耳蝸傳入神經(jīng)纖維參與。只有在高強度的聲音刺激下,才需要更多的突觸復合體和耳蝸傳入神經(jīng)纖維參與,來完成對更高強度刺激聲音信號的編碼和感知。

因此,ABR和DPOAE的聽覺反應閾值測試對毛細胞的損害相對敏感,但對耳蝸突觸和傳入神經(jīng)纖維的損傷不敏感,因為耳蝸傳入神經(jīng)纖維具有自發(fā)放電的特點,根據(jù)這個特點可分為高、低至少兩種放電率的神經(jīng)纖維。高放電率的纖維主要在柱細胞側(cè),低放電率的神經(jīng)纖維主要在蝸軸側(cè)。這些不同分組的神經(jīng)纖維有不同的功能,高放電率的神經(jīng)纖維處理低強度(閾值強度)聲音,低放電率的神經(jīng)纖維處理高強度(閾上強度)聲音。有研究表明,在豚鼠的實驗中,暫時性閾移模型造成的耳蝸神經(jīng)纖維損失的實驗數(shù)據(jù)符合本實驗結(jié)果,感知高強度的低放電率神經(jīng)纖維數(shù)從正常耳的49%下降到噪聲暴露耳的27%[11],然而感知低強度閾值區(qū)域的高放電率神經(jīng)纖維卻無明顯損失。這些實驗數(shù)據(jù)說明,ABR的閾值未改變是因為沒有損傷到感知低強度閾值區(qū)域的高放電率神經(jīng)傳入纖維,而ABR Ⅰ波波幅的降低反映了感知高強度聲音的低放電率傳入神經(jīng)纖維受到了比較明顯的損傷。這些結(jié)果可以解釋臨床上聽覺閾值正常,但是在嘈雜的環(huán)境下聽覺功能下降和言語分辨率降低的隱性聽力下降的現(xiàn)象。

隨著臨床聽神經(jīng)病研究的深入,隱性聽力下降的概念漸漸地被研究人員所接受[12]。臨床上純音聽閾測試指標對聽覺傳入神經(jīng)病變的敏感性很差,毛細胞之后的突觸和耳蝸傳入神經(jīng)纖維病變的患者仍然可以表現(xiàn)為純音聽閾正常,但是患者的言語識別率很低,尤其在嘈雜的環(huán)境下。此時如果仔細觀察ABR Ⅰ波波幅的變化,便可以檢測到異常。因為當患者受損傷的部位是耳蝸傳入神經(jīng)纖維中的低放電率纖維,而高放電率神經(jīng)纖維沒有受到損傷時,ABR的閾值并不會發(fā)生改變,只是ABR Ⅰ波波幅發(fā)生改變。要得到正常的ABR Ⅰ波波幅,就需要更多的甚至所有的耳蝸傳入神經(jīng)纖維參與。只要損傷到了耳蝸傳入神經(jīng),無論是低放電率、還是高放電率的傳入神經(jīng)纖維,ABR閾上功能的測試都會出現(xiàn)異常。噪聲性耳聾和老年性耳聾的患者雖然純音測試閾值升高不明顯,但其言語識別率會出現(xiàn)明顯降低,且與純音聽閾的升高不成比例,尤其在嘈雜的環(huán)境中聽力障礙更加明顯。這些患者的病理基礎可能與突觸病變和耳蝸傳入神經(jīng)元的退行性病有關(guān)[13]。

我們的實驗提示,聽覺閾功能的測試對判斷耳蝸突觸病變造成的聽覺閾值正常的隱性聽力下降可能具有指導意義,從而為隱性聽力下降的臨床患者的研究提供了更多的實驗依據(jù)。

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The pathological change of synapses in cochlear inner hair cell of hidden hearing loss mice

YIN Yan-bo, YUAN Ya-sheng, CHI Fang-lu△

(DepartmentofOtolaryngology,EyeandENTHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China)

Objective To investigate the synaptopathy of hidden hearing loss mice,and to observe the synapses of the cochlear inner hair cell after temporary threshold shift of noise exposure. Methods Mice were divided into normal control group and experiment group,the latter was exposed under noise of 98 dB SPL for 2 h to establish the model of temporary threshold shift.Mice cochleae of the two groups were dissected and prepared with whole mount and immunostaining.Cellular morphology was observed under confocal laser scanning microscope.Cochlear lengths were measured through cochlear frequency map to localize hair cells in different frequency regions.Then,3-D morphometry of synapses was constructed by Amira software to observe pre-synaptic ribbons,post-synaptic receptors and its pathological changes. Results In control group,each cochlear nerve fiber contacted a single inner hair cell by a single synapse,each inner hair cell had 5-30 synapses contacting cochlear nerve fibers.The larger ribbons patched smaller receptors located in the modiolar side,and the smaller ribbons patched larger receptors located in the pillar side.While in experiment group,noise overexposures caused moderate or completely reversible thresholds shift,i.e.,distortion product otoacoustic emission (DPOAE) and auditory brainstem response (ABR) thresholds increased 30-40 dB.Although returned to normal after 2 weeks,ABR wave Ⅰ amplitudes recovered to only 46.1% of pre-exposure amplitudes.There was 41.3% synapses loss of inner hair cell,but there was no loss of inner hair cells and spiral ganglion neurons. Conclusions Threshold test is not sensitive to degeneration and loss of synapse in mice inner hair cells,while super threshold test is sensitive to it.

noise induced hearing loss; temporary threshold shift; hidden hearing loss;synapse; mice

國家自然科學基金面上項目(81271084)

R764.5

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.02.008

2016-09-02;編輯:張秀峰)

△Corresponding author E-mail:chifanglu@126.com

*This work was supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81271084).