陶永佳，李 根，薛永常

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

海洋產(chǎn)油酵母菌篩選及油脂提取條件優(yōu)化

陶永佳，李 根，薛永常

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

采用蘇丹黑B染色法，從海洋淤泥和巖石附著藻類中篩選得到一株高產(chǎn)油脂的海洋酵母菌，利用生理生化特征結(jié)合分子生物學(xué)方法進行目的菌株的鑒定，結(jié)果證明其為季也蒙畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)。利用酸熱法進行油脂提取，在單因素實驗的基礎(chǔ)上通過正交實驗對提取條件進行優(yōu)化。得到最優(yōu)條件為：每0.5 g干菌體需4 mol/L鹽酸10 mL，酸熱時間10 min，有機溶劑氯仿-甲醇(體積比2∶1)25 mL，0.15% NaCl溶液10 mL。在最優(yōu)提取條件下，油脂得率為40.12%。

季也蒙畢赤酵母；篩選；油脂提?。徽粚嶒?/p>

微生物油脂又叫單細胞油脂，是由細菌、霉菌、酵母和藻類產(chǎn)生的[1]。微生物油脂的成分與動植物油脂類似，但其原料來源廣泛、生產(chǎn)周期短、能連續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)、不受季節(jié)和氣候的影響[2-3]，因此開發(fā)利用微生物油脂不僅可緩解植物油緊缺，且可生產(chǎn)功能性油脂、制備生物柴油、類可可脂以及高級不飽和脂肪酸等[4-7]，對人類可持續(xù)發(fā)展和提高生活質(zhì)量有重要的貢獻。目前對陸地微生物研究較多，而海洋微生物研究較少，海洋低溫、高壓、無光照的特異環(huán)境，使海洋微生物代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了許多具有特異、新穎、多種多樣化學(xué)結(jié)構(gòu)的生物活性物質(zhì)，包括抗腫瘤、抗菌的活性物質(zhì)和脂肪酸等，開發(fā)海洋微生物具有重要意義[8]。

本文采用蘇丹黑B染色法[9-10]，從海洋淤泥和巖石附著藻類中篩選海洋高產(chǎn)油脂酵母菌，通過生理生化鑒定和分子生物學(xué)方法對目的菌株進行鑒定，并利用單因素實驗和正交實驗對酸熱法提取油脂的條件進行優(yōu)化，對進一步探索海洋微生物油脂生產(chǎn)和利用有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

大連星海灣淺海淤泥和巖石表面附著藻類；鹽酸、甲醇、氯仿、氯化鈉均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基:蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L，陳海水配制，pH 6.0，121℃滅菌20 min；產(chǎn)油培養(yǎng)基：葡萄糖70 g/L，酵母浸粉0.5 g/L，(NH4)2SO42 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂粉20 g/L，陳海水配制，pH 6.0，121℃滅菌20 min；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖70 g/L，酵母浸粉0.5 g/L，(NH4)2SO42 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，陳海水配制，pH 6.0，121℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器與設(shè)備

TP600 PCR儀；DYY-2C型電泳儀；TGL-16C臺式離心機；SPX-150-Z振蕩培養(yǎng)箱；DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋；B210S型精密電子分析天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘇丹黑B染色篩選

將采集的樣品用滅菌陳海水洗滌后涂平板，在恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)2 d，然后進行連續(xù)的分離純化，直至得到單菌落，然后用蘇丹黑B分別染色(脂肪粒散布在細胞質(zhì)內(nèi)，可被脂溶性染料蘇丹黑B氧化成黑藍色，根據(jù)脂肪粒的多少區(qū)別是否為高產(chǎn)菌株[11])并鏡檢，篩選高產(chǎn)油脂酵母。

1.2.2 形態(tài)和生理生化特征鑒定

對篩選所得的目的菌株進行形態(tài)觀察，并依據(jù)《酵母菌的特征和鑒定手冊》進行生理生化特征鑒定。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定

參照生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(酵母)說明書提取目的菌株基因組DNA。使用真菌的ITS區(qū)序列擴增的通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)通過PCR擴增5.8s rRNA基因[4]。PCR擴增產(chǎn)物交由北京六合華大基因股份有限公司測序，測序結(jié)果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST，并用Clustal X 2.0同源性分析和MEGA 6.0構(gòu)建進化樹。

1.2.4 干菌體的獲得

將篩選得到的菌株接發(fā)酵培養(yǎng)基，在恒溫搖床中28℃、180 r/min培養(yǎng)3 d。然后離心收集菌體，于60℃烘箱烘干至恒重。

1.2.5 酸熱法提取油脂[12-13]

稱取0.5 g干菌體，加入4 mol/L鹽酸10 mL，室溫放置1 h，沸水浴10 min，迅速置于-20℃中30 min，然后加有機溶劑氯仿-甲醇(體積比2∶1)20 mL進行提取，分離有機相，用10 mL 0.15 % NaCl溶液洗滌，在60℃蒸發(fā)氯仿，之后在80℃烘1 h，并計算油脂得率和油脂相對得率，以上條件為基礎(chǔ)條件進行單因素實驗和正交實驗。

油脂得率=(M2-M1)/0.5×100%，油脂相對得率=Xi/Xmax×100%。式中:M1為試管質(zhì)量，g;M2為試管和油脂總質(zhì)量，g;Xi為油脂得率，Xmax為油脂得率的最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)油脂酵母的形態(tài)及生理生化特征

經(jīng)蘇丹黑B染色篩選，得到1株產(chǎn)油酵母，暫命名為T-1。其菌落呈乳白色，表面較光滑、濕潤、有光澤，細胞較小，呈橢圓形，為芽殖。T-1菌株生理生化特征如表1所示。

表1 T-1菌株生理生化特征

注：“+”為陽性反應(yīng)；“-”為陰性反應(yīng)。

根據(jù)T-1的菌落形態(tài)特征和生理生化特征鑒定，初步判定篩選得到的T-1菌株屬于季也蒙畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)。

2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

2.2.1 菌株基因組DNA的提取

利用生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(酵母)提取菌株T-1的基因組DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示。

圖1 菌株T-1基因組DNA電泳圖

由圖1可知，在15 000 bp有1條清晰整齊的條帶，說明提取的基因組DNA比較完整，因此可以用于后續(xù)PCR擴增。

2.2.2 PCR擴增5.8s rRNA

以菌株T-1的基因組DNA為模板，利用真菌的ITS區(qū)序列擴增的通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增5.8s rRNA基因，PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示。

圖2 5.8s rRNA擴增電泳圖

由圖2可知，在600 bp左右有1條清晰整齊的條帶，與預(yù)期大小一致，因此將PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因股份有限公司測序。

2.2.3 系統(tǒng)進化樹分析

測序結(jié)果顯示目的菌株T-1的5.8s rRNA序列長度為587 bp，將其提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST，菌株T-1的序列與季也蒙畢赤酵母菌(Meyerozymaguilliermondii)相似度為99%。選取5株與目的菌株T-1同源性較高的菌株，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，菌株T-1與M.guilliermondii32A屬于同一分支，說明親緣關(guān)系較近。證明菌株T-1屬于季也蒙畢赤酵母，并暫且命名為MeyerozymaguilliermondiiT-1，用于后續(xù)工作。

2.3 單因素實驗

2.3.1 鹽酸體積對油脂相對得率的影響

鹽酸能與細胞壁中的蛋白質(zhì)和多糖等反應(yīng)，從而疏松細胞壁，為油脂的提取奠定基礎(chǔ)。因此，對不同體積的4 mol/L鹽酸對油脂相對得率的影響進行考察，結(jié)果如圖4所示。

圖3 T-1菌株系統(tǒng)發(fā)育進化樹

圖4 鹽酸體積對油脂相對得率的影響

由圖4可知，在4 mol/L鹽酸體積為10 mL時油脂相對得率最高。鹽酸過少，則細胞壁通透性差，不利于提取，鹽酸過多，則可能使油脂部分發(fā)生分解。

2.3.2 酸熱時間對油脂相對得率的影響

酸熱時間直接影響疏松細胞破壁的效果以及油脂的分解，因此對酸熱時間對油脂相對得率的影響進行考察，結(jié)果如圖5所示。

圖5 酸熱時間對油脂相對得率的影響

由圖5可知，在酸熱時間為10 min時油脂相對得率最大。酸熱時間太短或過長，油脂相對得率都較低。時間短則破壁不完全，時間過長則油脂發(fā)生分解。

2.3.3 有機溶劑體積對油脂相對得率的影響

油脂易溶于非極性有機溶劑氯仿，因此對不同體積有機溶劑氯仿-甲醇(體積比2∶1)對油脂相對得率的影響進行考察，結(jié)果如圖6所示。

圖6 有機溶劑體積對油脂相對得率的影響

由圖6可知，在有機溶劑氯仿-甲醇(體積比2∶1)體積為25 mL時油脂相對得率最大。隨著有機溶劑體積增加，油脂相對得率相應(yīng)提高，但有機溶劑過多時則相對得率降低，可能是蒸發(fā)帶走過多的油脂。

2.4 正交實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以油脂得率為考察指標進行正交實驗，正交實驗因素水平見表2，正交實驗設(shè)計與結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2 正交實驗因素水平

表3 正交實驗設(shè)計與結(jié)果

表4 方差分析

由表3可知，3個因素對油脂得率的影響次序依次為A>B>C。通過表4方差分析可知，其因素影響均不顯著，因此不必再進行各因素水平間的多重比較。由表3k值可知，最優(yōu)條件為A2B2C2，即4 mol/L鹽酸體積10 mL，酸熱時間10 min，有機溶劑體積25 mL。按照最優(yōu)條件進行3次平行實驗，平均油脂得率為40.12%。

3 結(jié) 論

本實驗通過蘇丹黑B染色從海洋淤泥和巖石附著藻類中篩選得到高產(chǎn)油脂酵母菌株T-1，綜合形態(tài)觀察、生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定，證明其屬于海洋季也蒙畢赤酵母屬，暫且命名為MeyerozymaguilliermondiiT-1。在單因素實驗基礎(chǔ)上，通過正交實驗進行酸熱法油脂提取條件優(yōu)化，得到最佳的油脂提取條件為每0.5 g干菌體需4 mol/L鹽酸10 mL、酸熱時間10 min、有機溶劑氯仿-甲醇(體積比2∶1)25 mL、0.15% NaCl溶液10 mL，在此條件下的油脂得率為40.12%。研究結(jié)果對進一步探索海洋產(chǎn)油酵母菌的油脂生產(chǎn)和工業(yè)化應(yīng)用有重要意義。

[1] RATLEDGE C. Lipid biotechnology: a wonderland for the microbial physiologist[J]. J Am Oil Chem Soc，1987，64(12):1647-1656.

[2] 高媛，李元媛，王常高，等. 高產(chǎn)油脂酵母的篩選及發(fā)酵條件的研究[J]. 化學(xué)與生物工程，2010，27(1):55-58.

[3] 王莉，宋兆齊，李慧真，等.一株絲孢酵母屬菌株發(fā)酵產(chǎn)油脂的研究[J].中國油脂，2015，40(5)：84-89.

[4] 唐文佳，張懷淵，陳衛(wèi)，等. 檸檬酸在產(chǎn)油酵母油脂積累過程中的中心作用[J]. 食品科學(xué)，2013，34(19):326-329.

[5] 魏濤，王麗娟，張飛，等.一株高產(chǎn)油脂酵母菌株的分離鑒定及其油脂組分的分析[J].中國釀造，2013，32(7):50-52.

[6] IZARD J，LIMBERGER R J. Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells[J]. J Microbiol Methods，2003，55(2):411-418.

[7] PATNAYAK S，SREE A. Screening of bacterial associates of marine sponges for single cell oil and PUFA[J]. Lett Appl Microbiol，2005，40(5):358-363.

[8] 秦艷紅，葉德贊. 海洋產(chǎn)油真菌的簡便初篩[J]. 臺灣海峽，2010，29(1): 128-134.

[9] 李凡正，高新蕾，劉曄. 真菌油脂含量快速測定方法[J]. 中國油脂，2010，35(9):70-73.

[10] WANG J F，LI R M，LU D，et al. A quick isolation method for mutants with high lipid yield in oleaginous yeast[J]. World J Microbiol Biotechnol，2009，25(5):921-925.

[11] 杜連祥，路福平. 微生物學(xué)實驗技術(shù)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2006.

[12] 葉思特，郭麗瓊，劉曉蓉，等. 產(chǎn)油微生物的篩選[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，33(3):384-387.

[13] 孔凡敏，趙祥穎，田延軍，等. 酸熱法提取酵母油脂條件的研究[J]. 中國釀造，2010(5):143-146.

Screening of oleaginous yeast from sea and optimization of oil extraction process

TAO Yongjia, LI Gen, XUE Yongchang

(School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, Liaoning, China)

An oleaginous yeast was screened from sea mud and algae attached rock by Sudan Black B staining method and it was identified asMeyerozymaguilliermondiiby physicochemical and biochemical characteristics combined with molecular biological methods. The oil was extracted by acid-heating method. Based on single factor experiment, the extraction conditions were optimized by orthogonal experiment. The optimal extraction conditions were obtained as follows: 0.5 g of dried cells, 4 mol/L HCl 10 mL, acid-heating time 10 min, organic solvent(volume ratio of chloroform to methanol 2∶1) 25 mL, 0.15% NaCl 10 mL. Under these conditions, the oil yield was 40.12%.

Meyerozymaguilliermondii; screening; oil extraction; orthogonal experiment

2016-08-11；

2016-12-23

陶永佳(1992)，男，碩士研究生，研究方向為海洋微生物(E-mail)1127383109@qq.com。

薛永常，教授(E-mail)xueych@dlpu.edu.cn。

TQ644;Q93-3

A

1003-7969(2017)04-0012-04

油脂加工