王冉 史新元 楊樹芳 戴幸星 喬延江

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·論著·

冰片對氟尿嘧啶經(jīng)皮促透作用的多尺度研究

王冉 史新元 楊樹芳 戴幸星 喬延江

目的 研究冰片對氟尿嘧啶的經(jīng)皮促透作用，探究冰片對親水性藥物的促透機理。方法 采用體外透皮實驗、透射電子顯微鏡和介觀分子動力學模擬等方法，分別對氟尿嘧啶的自身滲透性和冰片對其的促透作用進行多尺度研究。結果 氟尿嘧啶難以穿透角質層，最大滲透速率(0.82 μg/cm2)和單位面積累計滲透量(20.45 μg/cm2)均較低，在冰片的促透作用下，氟尿嘧啶的滲透速率和滲透量均增大，當冰片濃度為1%時，氟尿嘧啶的滲透速率[13.58 μg/(cm2·h)]和24小時單位面積累計滲透量(325.50 μg/cm2)較高，促滲比達16.57倍，且對角質層結構影響不大，為冰片促透氟尿嘧啶的最佳濃度；冰片的促透作用主要表現(xiàn)為疏松角質層中脂質的排列，促進其中水通道的形成，從而促進氟尿嘧啶透過。結論 冰片可以促進親水性氟尿嘧啶經(jīng)皮滲透，其主要促透機理為疏松角質層脂質排列，促進水通道的形成。

冰片； 氟尿嘧啶； 促透作用； 分子動力學模擬； 多尺度方法

經(jīng)皮給藥系統(tǒng)(transdermal drug delivery system， TDDS)現(xiàn)已成為藥劑學的研究熱點之一，但由于皮膚角質層致密的“磚墻”結構，使其成為阻礙藥物經(jīng)皮吸收的重要屏障。研究表明，經(jīng)皮促透劑的加入可有效提高藥物的透皮量[1]。中藥冰片是樟科植物樟Cinnamomumcamphora(L.) presl的新鮮枝葉經(jīng)提取加工而得，具有開竅醒神、清熱止痛的功效，是一種常用的中藥揮發(fā)油類經(jīng)皮促透劑，促透效果良好[2-3]，且對皮膚刺激性、毒性較小[4]。文獻報道，冰片對不同種類、不同性質的藥物均具有良好的促透效果[5]，但關于冰片對各類藥物促透機制的研究較少。前人多運用定量構效關系(quantitative structure-property relationship，QSPR)將不同藥物滲透性與其結構性質相關聯(lián)，結果表明藥物的疏水性和相對分子質量與其滲透性關系緊密[6]。本文以常用于治療皮膚病的親水性藥物氟尿嘧啶為被促透藥物[7-8]，采用體外滲透實驗、透射電子顯微鏡和介觀分子動力學模擬等方法，分別從宏觀和介觀層面探究冰片對難以經(jīng)皮滲透的親水性藥物的促透機理，以期為含冰片制劑的開發(fā)提供依據(jù)，為經(jīng)皮滲透作用的研究提供新方法。

1 材料與方法

1.1 經(jīng)典透皮實驗部分

1.1.1 實驗動物 SD大鼠，清潔級，24只，5～6周齡，雄性，體重(200±10) g，購于斯貝福實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2016-0002。本文實驗全程中，動物處置方法確保符合動物倫理學要求。

1.1.2 藥物與主要試劑 冰片(純度98%，批號：111688-200501，中國食品藥品檢定研究院)；氟尿嘧啶(純度98%，批號：100187-201203，中國食品藥品檢定研究院)；無水乙醇(分析純，批號：20150504，北京化工廠)；1,2-丙二醇(分析純，批號：20120213，北京化工廠)；甲醇[分析純，批號：148671，賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；氯化鈉(分析純，批號：20071211，北京化工廠)；PBS緩沖液(pH=7.2～7.4，批號：20150827，北京索萊寶科技有限公司)；戊二醛固定液(2.5%，批號：20141219，Biotopped Life Sciences)；蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

1.1.3 儀器 智能透皮擴散儀(TP-6，天津市新天光分析儀器技術有限公司)；高效液相色譜儀(1100，Agilent，USA)；分析天平(BP211D，Sartorius，GER)。

1.1.4 方法 (1)皮膚樣品的制備：大鼠乙醚麻醉后脫頸處死，剃去腹部毛發(fā)，剪取腹部正中部位皮膚，拭去皮下組織，備用。(2)體外透皮實驗：采用改良的Franz擴散池裝置。將皮膚固定于供給室和接收室之間，有效接觸面積為1.23 cm2。供給室分別加入各組供試液，給藥體積為2 mL；接收室加入PBS緩沖液，溶劑體積為15 mL。設定磁力攪拌速度為300 r/min，水浴溫度為34℃。實驗開始時刻為0時刻，在第1、2、4、6、9、12、22小時分別取樣2 mL，并向接收室補充等體積的PBS緩沖液。將取出的樣品過0.45 μm濾膜，4℃冰箱保存待測。透皮實驗后的皮膚浸于2.5%戊二醛固定液中，于4℃冰箱保存，待用于透射電子顯微鏡觀察。(3)氟尿嘧啶色譜條件：采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)，選用Waters×bridge C18(250×4.6 mm，5 μm)色譜柱；柱溫30℃；流動相為甲醇-水(5-95)；檢測波長266 nm；流速1 mL/min；進樣量20 μL。1.2 透射電子顯微鏡部分

1.2.1 儀器 超薄切片機(EMUC7，Leica，GER)；透射電子顯微鏡[JEM-1230(HC)，JEOL，JAP]。

1.2.2 方法 將透皮實驗后的皮膚樣品在1%OsO4中固定，并在梯度濃度的丙酮中脫水。將脫水后的樣品嵌入低黏度的環(huán)氧樹脂混合物中，切片。超薄切片用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色后，用透射電鏡觀察。

1.3 計算機模擬部分

本文所有模擬工作均基于Gromacs 4.6.3分子模擬程序展開，采用粗?；慕橛^模擬方法，選用適用于脂質、聚合物、糖類及糖脂類化合物的Martini力場。

1.3.1 模擬體系粗粒化模型搭建 研究表明，角質層脂質分子主要由神經(jīng)酰胺(ceramides，CER)、膽固醇(cholesterol，CHOL)、游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)組成，配比約為2∶2∶1[9-10]。課題組已對此模型的結構性質進行考察，結果表明，此模型具有真實角質層的屏障作用及穩(wěn)定的結構，適用于對生物膜的的模擬研究[11]。神經(jīng)酰胺2、膽固醇、C24游離脂肪酸、冰片、氟尿嘧啶分子結構可從Pubmed數(shù)據(jù)庫檢索下載，并根據(jù)Martini力場粗?；?guī)則對沒有粗?；鰠?shù)的分子進行粗?；傲鰠?shù)的賦予。各分子結構及粗?；Ｐ秃徒琴|層脂質模型詳見圖1。

注：BO：冰片；FLU：氟尿嘧啶；blank membrane：空白脂質膜

圖1 3種脂質分子及其粗?；Ｐ?/p>

1.3.2 模擬參數(shù)設置 具體模擬參數(shù)如表1所示。

表1 介觀模擬參數(shù)設置

2 結果

2.1 體外透皮研究

氟尿嘧啶的臨床用量為0.1%～0.5%，預實驗結果表明，濃度為0.2%時氟尿嘧啶自身滲透性最好，因此將其濃度設置為0.2%，冰片濃度分別設置為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%和3.0%，進行冰片對氟尿嘧啶促透的體外透皮實驗。計算各濃度冰片作用下，氟尿嘧啶的單位面積累計滲透曲線(Qn-t)、滲透速率J[μg/(cm2·h)]、24小時累計單位面積累計滲透量Q24 (μg/cm2)和促滲比。結果如表2所示。

由表2可知，未加入冰片時，氟尿嘧啶的滲透速率和24小時累計滲透量較低，滲透能力無法達到治療需求[12]。加入冰片后，氟尿嘧啶的累計滲透量和滲透速率均有明顯上升。隨冰片濃度增大，累計滲透量、滲透速率和促滲比均增大，當冰片濃度達到3.0%時，促滲比約為18倍；當冰片濃度低于0.5%時，促滲比增速較快；冰片濃度達到1.0%后，促滲比增速較緩，接近飽和。為了闡釋冰片的促透機理，還需進行透射電鏡實驗及介觀模擬。

2.2 透射電鏡研究

將體外透皮實驗后的各組皮膚進行透射電子顯微鏡觀察，結果如圖2所示。比較不同濃度冰片作用后的角質層結構可知，未加入冰片時，角質層排列整齊；加入冰片后，角質層出現(xiàn)明顯的波動。冰片濃度低于0.5%時，隨冰片濃度上升，角質層紊亂度增強，波動明顯，表明角質層流動性較強，易于滲透，此時冰片對氟尿嘧啶的促滲比增速較大；當冰片濃度達到1.0%后，角質層出現(xiàn)斷層、層間交錯等現(xiàn)象，脂質膜內(nèi)部劇烈運動，利于藥物滲透；當冰片濃度達2.0%后，角質層整體變薄，出現(xiàn)皺縮、剝離等現(xiàn)象，層狀結構徹底被破壞，甚至出現(xiàn)溶解狀態(tài)，不利于藥物的進一步滲入，冰片對氟尿嘧啶的促透作用趨于飽和狀態(tài)。

2.3 介觀分子動力學模擬

2.3.1 氟尿嘧啶 自身滲透性考察介觀分子動力學模擬可進行分子水平機理的闡釋，揭示宏觀體系動態(tài)變化規(guī)律，但由于計算機模擬研究與真實體系中的反應存在一定差異，模擬體系與實驗中的藥物濃度并不能達到數(shù)值上的完全對應。在模擬研究中，將氟尿嘧啶濃度分別設置為1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、10.0%、15.0%和20.0%，考察其在角質層的擴散情況。以藥物濃度為3.0%的體系為例，藥物在體系中的分布及體系中各成分在z方向的密度分布圖如圖3所示。

表2 氟尿嘧啶滲透參數(shù)

注：A冰片濃度0.0%； B冰片濃度0.2%； C冰片濃度0.5%； D冰片濃度1.0%； E冰片濃度2.0%； F冰片濃度3.0%

圖2 透皮實驗后透射電子顯微鏡觀察結果(×20000)

圖3 氟尿嘧啶與角質層相互作用的模擬圖及脂質頭基、脂質尾鏈、氟尿嘧啶密度分布圖

圖4 冰片對氟尿嘧啶促透作用模擬400 ns后體系快照

2.3.2 冰片對氟尿嘧啶促透作用 研究設置氟尿嘧啶濃度為3%，冰片濃度分別為3%、5%、7%、10%和15%，考察冰片對氟尿嘧啶透過的影響。當冰片濃度低于7%時，冰片分子全部進入膜內(nèi)，并大量聚集在脂質的疏水尾鏈區(qū)；氟尿嘧啶分子部分進入膜內(nèi)，多數(shù)分布在脂質頭基部位，隨冰片濃度增大，膜的波動更明顯，冰片濃度達到7%時，脂質膜波動劇烈、出現(xiàn)彎曲。當冰片濃度達到10%后，膜的雙分子層結構被破壞，大量脂質在膜內(nèi)堆積，氟尿嘧啶進入膜內(nèi)的數(shù)量增多，且由頭基部位轉移至膜內(nèi)部。觀察藥物與脂質膜的相互作用過程發(fā)現(xiàn)，當模擬開始時，冰片迅速進入膜內(nèi)，分別與脂質頭基和脂質疏水鏈相互作用，并牽引部分脂質進入膜內(nèi)。處于膜內(nèi)的脂質大量堆積、再排列，疏水鏈伸向膜體系的疏水區(qū)域，與其他脂質尾鏈交叉排列，脂質頭基由于彼此間的氫鍵作用形成親水表面，即水通道，供親水性成分通過脂質膜。水通道的形成與冰片對親水性藥物透膜關系緊密，因此本文對各體系中，水通道的形成時間和持續(xù)時間進行記錄，以解釋各濃度冰片的促透作用。結果見圖4～5。

圖5 冰片促透氟尿嘧啶模擬體系中水通道的形成始末時間

實驗證明，當加入的冰片濃度達到5%后，膜體系開始出現(xiàn)瞬時水通道，且隨冰片濃度增大，水通道出現(xiàn)的時間越早，持續(xù)時間越長。即使在高濃度冰片(10%及以上)作用下，脂質膜的結構被破壞之前，依然會產(chǎn)生瞬時水通道，促進氟尿嘧啶透膜。

為了量化冰片對角質層脂質膜結構的影響，本文采用脂質膜的單個脂質頭基面積、厚度、脂質神經(jīng)酰胺和游離脂肪酸分子的有序度參數(shù)對脂質膜結構進行了定量分析，結果見圖6。由圖可知，當冰片濃度小于7%時，隨冰片濃度增大，膜脂質排列趨于疏松，脂質間隙變大，單個脂質頭基面積增大；脂質活動區(qū)域增大，活動增強，出現(xiàn)彎曲等現(xiàn)象，導致脂質的有序度減小，膜厚度減小。當冰片濃度增大至7%后，大量脂質進入膜內(nèi)形成逆膠束結構，膜結構被破壞，使膜整體表面積減小而APL減小，厚度增大，脂質有序度參數(shù)降低。

3 結論

本文采用計算機模擬與經(jīng)典實驗相結合的方法，從不同尺度闡釋了冰片對親水性藥物氟尿嘧啶的促透機理。

3.1 氟尿嘧啶自身滲透能力

在透皮實驗中氟尿嘧啶的滲透量、滲透速率均較低，并且在模擬實驗中氟尿嘧啶分子多分布在溶劑中，少量聚集在脂質頭基區(qū)域，不存在明顯的透膜現(xiàn)象，因此證明其自身滲透能力較弱。

3.2 冰片對氟尿嘧啶的促透作用

在冰片的促透作用下，氟尿嘧啶的滲透能力顯著增強。結合透皮實驗和模擬實驗結果可知，當冰片濃度低于1%時(模擬中為低于7%)，膜單個脂質頭基面積增大，厚度減小，脂質有序度降低，即膜脂質排列疏松，靈活度增強，一方面使膜流動性增強，有利于藥物從脂質間滲透，另一方面，有助于瞬時水通道的形成，從而促進氟尿嘧啶通過膜脂質間和水通道進入膜內(nèi)。當冰片濃度進一步上升，膜結構被破壞，此時膜單個脂質頭基面積降低，厚度增大，阻礙藥物滲透，但由于膜被徹底破壞前依舊有水通道形成，因此滲透速率增大，但促滲效果趨于飽和。當冰片濃度為1%時，冰片對氟尿嘧啶的促滲比達16.57倍，并且對角質層的結構影響不大，是冰片促透氟尿嘧啶的最佳濃度。

圖6 冰片促透氟尿嘧啶模擬體系脂質膜的結構參數(shù)

具有促透作用的中藥揮發(fā)油類成分有很多，如薄荷醇、桉油精、檸檬烯等[13-14]，但其促透機理尚未明晰，因此對揮發(fā)油類促透劑促透機理及規(guī)律的研究還需開展大量工作，尤其是對可用于促透親水性藥物的促透劑進行研究，將為經(jīng)皮給藥制劑開發(fā)過程中揮發(fā)油類促透劑的科學應用提供依據(jù)。

此外，本文所建立的計算機模擬與經(jīng)典實驗相結合的方法，從不同尺度考察了促透劑對被促透藥物及脂質膜的影響，所得結果相互佐證、互相補充，更加深入、全面地闡釋了促透劑的促透機理。該方法不僅可應用于促透機理研究，還為經(jīng)皮給藥制劑的開發(fā)提供新方法。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Multi-scale study of borneol on the transdermal effect of fluorouracil

WANGran,SHIXinyuan,YANGShufang，etal.

SchoolofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China

QIAOYanjiang,E-mail:yjqiao@263.net

Objective To investigate the penetration enhancement mechanism of borneolto on fluorouracil,and to explore the permeation mechanism of borneol on hydrophilic drugs.Methods The in vitro permeation experiments,transmission electron microscopic and microscopic molecular dynamics model was used to study the penetration of fluorouracil and the permeation enhancement of borneol.Results Fluorouracil was difficult to penetrate the stratum corneum,the maximum penetration rate was 0.82 μg/(cm2·h), and cumulative osmolality after 24h (20.45 μg/cm2) was low; with the enhancement effect of borneol, both penetration rate and cumulative osmolality of fluorouracil was increased, when the concentration of borneol was 1%, penetration rate[13.58 μg/(cm2·h)] and cumulative osmolality after 24h(325.50 μg/cm2) were the maximum value, the enhancement ratio was 16.57, and it had little effect on the stratum corneum structure, so 1% was the optimum concentration; Borneol can make the membrane lipid become loose and can promote the formation of water channels, thereby promoting the hydrophilic drugs penetration across. Conclusion Borneol can effectively promote the permeation of hydrophilic fluorouracil, the mechanism may be loosing the stratum corneum lipids and promoting the formation of water channels.

Borneol； Fluorouracil； Penetration enhancement； Molecular dynamics simulations； Multi-scale method

國家自然科學基金(81473364)；北京市自然科學基金(7162122)

100069 北京，首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院[王冉(碩士研究生)]；北京中醫(yī)藥大學中藥信息工程研究中心(楊樹芳、戴幸星、史新元、喬延江)

王冉(1992- )，女，2014級在讀碩士研究生。研究方向：中藥化學。E-mail：wangran2017@sina.com

喬延江(1956- )，博士，教授。研究方向：中藥信息學。E-mail：yjqiao@263.net

R284

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.05.002

2017-01-18)