王歡　薛健

摘要：手足口病是由人腸道病毒引起的一種兒童常見傳染病，主要由腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型引起。近年來，尤其是腸道病毒71引發(fā)的手足口病在亞太地區(qū)呈上升趨勢。本研究采用RT-PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增EV71VP1基因序列，克隆至原核表達(dá)載體pET32a（+）中，以期為今后腸道病毒EV71新型疫苗的開發(fā)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：手足口病；EV71；原核表達(dá)載體構(gòu)建

中圖分類號(hào)：R725.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170132011

手足口?。℉and-foot-mouth Disease，HFMD）是由柯薩奇病毒A4、A5、A8、A10、A16、B3、B7和腸道病毒71型等多種人腸道病毒引起的一種兒童常見傳染病，其中引起手足口病疫情的病原體以腸道病毒71型（EV71）、柯薩奇病毒A組16型（cOXAl6）最為常見。大多數(shù)患者癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀。通常情況下，兩者引起的手足口病在臨床癥狀等方面難以區(qū)別，但EV71感染除了引起HFMD外，還能夠引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的較為嚴(yán)重的癥狀。自1974年Schmidt等首次報(bào)道從美國加利福尼亞暴發(fā)表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀疾病的患者中分離到EV71病毒以來，EV71病毒已在世界范圍內(nèi)引起十多次暴發(fā)與流行。近年來，EV71病毒的流行在亞太地區(qū)呈上升趨勢。自2008年3月以來，我國多個(gè)省份出現(xiàn)了手足口病的流行，引起社會(huì)高度重視。

由于手足口病潛伏期長，癥狀不明顯，不易被發(fā)現(xiàn)，因而極易延誤疾病治療，目前國內(nèi)外尚無相關(guān)疫苗類藥物面世。EV71保守序列VPI編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白，具備抗原特異性，本研究采用RT-PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增EV71 VP1基因序列，克隆至原核表達(dá)載體pET32a（+）中，以期為今后腸道病毒EV71新型疫苗的開發(fā)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

EV71病毒RNA、大腸桿菌DH5 α和原核表達(dá)載體pET32a（+）為本實(shí)驗(yàn)室保藏；RT-PCR試劑、限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I購自寶生物工程（大連）有限公司；T4DNA連接酶，質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

1.2引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中EV71 VP1（AB204852.1）

基因序列（891bp），設(shè)計(jì)VP1上下游引物。上游引物：5-GGAATTCCTCTACCAGCACCCACAGGC-3（加入限制性酶切位點(diǎn)EcoR I）；下游引物：5-CTCGAGGCATCGGGCGAGGTATCCAC-3（加入限制性酶切位點(diǎn)Xho I）。

1.3VPl基因擴(kuò)增

1.3.1反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

10μL反應(yīng)體系，其中病毒RNA 2.5μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL，10×RT buffer2μL，dNTPMix 1μL，Oligo-dT 0.5μL，Rnaes抑制劑0.5～tL，Nuclease-free水3μL。70℃變性退火5min，42℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)45min，70℃保溫5min終止反應(yīng)。

1.3.2PCR反應(yīng)

50μL反應(yīng)體系，10×buffer 5μL，dNTP 4μL，上下游引物各1μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μL，DNA聚合酶1μL，雙蒸水33μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30循環(huán)，72℃終延伸5min。產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4pET32a（+）-VP1原核表達(dá)載體構(gòu)建

擴(kuò)增片段鑒定正確后，使用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho 1分別對(duì)VP1擴(kuò)增片段與原核表達(dá)載體pET32a（+）進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，反應(yīng)條件為37℃，120min，65℃滅活20min。膠回收VP1擴(kuò)增片段與pET32a（+）酶切產(chǎn)物，使用T₄DNA連接酶在16℃下進(jìn)行連接反應(yīng)，過夜。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α后，挑取單克隆進(jìn)行雙酶切鑒定后送至上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果通過Bioedit軟件比對(duì)。

2結(jié)果與分析

2.1VPl基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

VP1基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶位于1200bp與800bp之間（圖1），與預(yù)期大小732bp一致。

2.2重組質(zhì)粒pET32a（+）-VP1的鑒定

使用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I對(duì)重組質(zhì)粒pET32a（+）-VP1進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別得到的2條產(chǎn)物片段大小與VPl片段和pET32a（+）載體大小一致，測序結(jié)果表明VPl片段與Genebank中的VP1序列同源性為99%，表明重組原核表達(dá)載體pET32a（+）-VPl構(gòu)建成功。

本研究采用RT-PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增EV71VPl基因序列，通過限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I的雙酶切反應(yīng)和T4DNA連接酶的連接反應(yīng)，將VP1片段克隆至pET32a（+）中，經(jīng)過雙酶切與DNA測序鑒定，表明VP1片段成功被克隆至原核表達(dá)載體pET32a（+）中。在本研究的基礎(chǔ)上，可以進(jìn)一步進(jìn)行VP1蛋白純化，抗血清制備及其免疫原性分析，從而為今后腸道病毒EV71新型疫苗的開發(fā)提供技術(shù)基礎(chǔ)。