熊文?！×枞f旭　顏洪奎　何錦

摘要：云南省某養(yǎng)殖場飼養(yǎng)母豬260多頭，所產仔豬近期有20%左右發(fā)病，發(fā)病時間已達2個多月，部分仔豬出生第2天發(fā)病，主要癥狀表現為腹瀉，拉黃色糞便，同養(yǎng)殖場肥豬、保育豬均表現正常。為診斷仔豬患病情況，為綜合防控提供支持，對該場送檢的3頭病仔豬進行病理剖檢，采集組織用PCR技術進行病原檢測。檢測結果為1號豬豬圓環(huán)病毒2型抗原檢測呈陽性，3頭仔豬豬輪狀病毒抗原檢測呈陽性，說明該生豬養(yǎng)殖場發(fā)生了豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病毒的混合感染。通過對該養(yǎng)殖場母豬、仔豬進行免疫接種，發(fā)病仔豬隔離治療、加強養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理等措施，最終控制了豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病毒混合感染的疫情。

關鍵詞：仔豬腹瀉；豬圓環(huán)病毒2型；豬輪狀病毒；混合感染；PCR診斷

中圖分類號：S828 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170132061

前言

豬輪狀病毒（RV）屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬（Rotavirus）雙股RNA病毒。豬輪狀病毒病為急性腸道傳染病，臨床上表現為哺乳仔豬和斷奶前、后仔豬嘔吐、腹瀉、脫水體重減輕為特征的急性腸道傳染病。該病在全世界各地豬場均有發(fā)生，多發(fā)生于晚秋、冬季和早春，呈地方性流行，輪狀病毒感染是斷奶前后仔豬腹瀉的重要原因，初期病豬表現為沉郁、食欲不振和不愿活動，之后不久會發(fā)生嚴重腹瀉，糞便呈水樣或糊狀，黃白色或暗黑色，嚴重脫水、消瘦、體重減輕30%。本病癥狀的輕重受發(fā)病豬日齡、環(huán)境條件以及免疫狀況等的影響，一周齡以內的仔豬受母源抗體的保護，不易發(fā)病，但如果缺乏有效的母源抗體保護，10日齡內的仔豬發(fā)病癥狀嚴重，嚴重時病死率可達100%。病豬剖檢時可見豬小腸脹氣，腸內容物呈棕黃色水樣，腸壁菲薄呈半透明狀，有時可見小腸彌漫性出血，胃中有未消化凝乳塊。

豬圓環(huán)病毒?。≒VCD）是近年來發(fā)現的一種較難控制的病毒性傳染病，該病由豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）引發(fā)。該病不同年齡階段的豬均可感染，該病主要侵害哺乳仔豬和育肥豬及懷孕母豬。臨床表現為豬高熱、呼吸困難、咳嗽、腸炎，母豬表現為繁殖障礙等。其引起的疫病包括豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS），增生性壞死性肺炎（PNP）、豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）、豬呼吸系統(tǒng)疾病綜合征（PRDC）、繁殖障礙、先天性震顫及腸炎等。該病的主要病理變化為：貧血、黃疸、淋巴結異常腫脹，內臟和外周淋巴結腫大到正常體積的3～4倍，切面為均勻的白色，肺部有灰褐色炎癥和腫脹，肝臟發(fā)暗、萎縮、腎臟水腫、脾臟輕度腫大，胰、小腸、結腸也常有腫大及壞死病變。豬圓環(huán)病毒病為免疫抑制性疾病，常引發(fā)其他病原混合感染和繼發(fā)感染。如豬圓環(huán)病毒2型與豬瘟混合感染、豬圓環(huán)病毒2型與豬附紅細胞體混合感染等，而豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病混合感染卻不常見。

云南某生豬養(yǎng)殖場共養(yǎng)殖母豬260多頭，所產仔豬近期有20%左右發(fā)病，發(fā)病時間已達2個多月，發(fā)病豬死亡率不高，仔豬從出生的第2天發(fā)病，主要癥狀表現腹瀉，拉黃色糞便，仔豬斷奶后病情有所好轉。同養(yǎng)殖場大豬、保育豬均表現正常。

2016年9月1日，云南省某生豬養(yǎng)殖場把3頭腹瀉仔豬送往云南農業(yè)大學做檢測，根據腹瀉仔豬臨床癥狀、病理解剖結果、養(yǎng)殖場流行病學調查和實驗室PCR檢測結果，最終確診該養(yǎng)殖場哺乳仔豬腹瀉由豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病毒混合感染引發(fā)，根據診斷結果養(yǎng)殖場立即采取防控措施，7d后病情被控制，14d后疫情完全平息，現報告如下。

1材料與方法

1.1材料的來源

1.1.1病豬病料

來源于云南省某生豬養(yǎng)殖場送檢3頭腹瀉仔豬，由實驗室解剖并無菌采取仔豬的肺臟、腎臟、肝臟，小腸內容物。3頭仔豬組織樣品分別編號1號、2號、3號。

1.1.2試劑

RNAiso PlusTotalRNA購自大連寶生物生物技術有限公司；Bioteke細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購至北京百泰克生物技術有限公司；RI Enzyme Mix、2×ES Reaction Mix、2×Trans Taq HiFiPCR Super Mix購自北京全式金生物技術有限公司；異丙醇、75%乙醇、瓊脂粉、TAE緩沖液、雙蒸水、氯仿等由實驗室提供。

1.2臨床觀察及病理解剖

對送檢的3頭腹瀉仔豬進行臨床癥狀觀察，并向養(yǎng)殖場戶主詳細了解發(fā)病情況，實驗室剖檢3頭腹瀉仔豬，詳細記錄剖檢變化并取材保存。

1.3PCR檢測

1.3.1引物

本次檢測7個病原特異性引物均由云南農業(yè)大學動科院動物傳染病實驗室設計，特異性引物片段長度為：豬瘟病毒234bp、豬藍耳病毒330bp、豬圓環(huán)病毒701bp、豬偽狂犬病毒500bp、豬流行性腹瀉病毒為471bp、豬傳染性胃腸炎病毒439bp、豬輪狀病毒374bp。引物由上海生工（生物）有限公司合成。

1.3.2樣品DNA/RNA提取

用Trizol法提取樣品組織中的總RNA，實驗過程嚴格按照操作說明進行；病毒DNA的提取按照百泰克生物技術有限公司的DNA快速提取試劑盒提取，實驗過程嚴格按照操作說明進行。

1.3.3PCR擴增目的片段

提取的RNA利用北京全式金公司的反轉錄試劑盒（貨號AE301-02）反轉錄得到cDNA，并以eDNA為模板，利用特異性引物分別進行豬瘟、藍耳、豬流行性腹瀉、傳染性胃腸炎及輪狀病毒PCR擴增。提取的DNA利用北京全式金公司的試劑盒（貨號AS131-02），利用特異性引物進行豬圓環(huán)、豬偽狂犬病毒PCR擴增。

1.3.4目的基因片段PCR擴增

將上述提取出來的樣品RNA利用特異性引物對其進行RT-PCR擴增，反轉錄體系如下2×ES Reaction Mix（含10×RTBuffer，dNTPs）5uL，EasyScriptTMⅡRT/RIEmzyme Mix（含Rnase Inhibitor，反轉錄酶）0.5uL，下游引物1uL，模板RNA 3.5uL，反應體系為10uL。將配制好的體系置于42℃反應30min，之后85℃反應5min。反轉錄產物置于4℃保存?zhèn)溆?。將上述反轉錄產物及提取出來的樣品DNA利用特異性引物對其進行PCR擴增，PCR擴增體系為：Mix（含10×PCR buffer，dNTPs，TransTaq酶）12.5 uL，dH20 10.5 uL，上下游引物各0.5 uL，DNA 1 uL，總反應體系為25 uL。PRRSV擴增反應條件為：94℃3 min；94℃1 min，65℃1 min，72℃1 min，40個循環(huán)；72℃5 min。PCV、RV、TGEV、PEDV擴增反應條件同PRRSV。

CSFV第1輪擴增反應條件為：94℃5min；94℃30sec，53℃45sec，72℃50sec，34個循環(huán)；72℃5min。將所得到的第1輪產物稀釋300倍后，進行第2輪擴增，反應條件為：94℃5 min；94℃ 40sec，56℃40sec，72℃ 40sec，34個循環(huán)；72℃ 5 min。

取上述PCR擴增產物10 μL配制成體系后加樣到1.5%瓊脂糖凝膠（含0.2%EB）孔中，并在120V電壓下進行30min的電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果，并拍照。

1.4治療方法

根據診斷結果采取特異性防控措施和綜合性防控措施相結合的方法。方法如下。

1.4.1加強養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理

新生仔豬及時飼喂初乳，注意仔豬防寒保暖；斷奶仔豬提供全價飼料，提高抵抗力；保證畜舍內通風，防止飼養(yǎng)密度過大；做好衛(wèi)生消毒工作，嚴格控制人員、豬只流動，畜舍外每天采用3%火堿進行消毒，畜舍內使用高效且刺激性小的消毒威等消毒液加大稀釋倍數進行帶豬消毒。

1.4.2做好免疫接種工作

對該養(yǎng)殖場母豬、哺乳仔豬、斷奶仔豬進行豬輪狀病毒弱毒苗、豬圓環(huán)病毒弱毒苗緊急免疫接種。

1.4.3發(fā)病豬的治療與處理

對于發(fā)病仔豬，采取隔離措施，并對腹瀉物污染的設備、飼料等進行嚴格消毒；停止飼喂母乳，采用抗病毒、抗細菌藥物，防止豬圓環(huán)病毒2型引發(fā)繼發(fā)感染，并配合免疫球蛋白進行治療，口服糖鹽水或靜脈注射10%葡萄糖鹽水和3%-5%碳酸氫鈉溶液，補充Vc。對于治療無效仔豬，立即撲殺，嚴格的無害化處理。

2結果與分析

2.1臨床癥狀及病理解剖結果

送檢3頭仔豬表現現為精神沉郁，怕冷，體型消瘦，腹瀉嚴重，拉黃色糞便。經養(yǎng)殖戶了解到該生豬養(yǎng)殖場共飼養(yǎng)母豬260多頭，所產仔豬近期有20%左右發(fā)病，發(fā)病時間已達2個多月，發(fā)病仔豬死亡率不高，仔豬從出生的第2天發(fā)病，主要癥狀表現腹瀉，拉黃色糞便，仔豬斷奶后病情有所好轉，同養(yǎng)殖場大豬、保育豬均表現正常。

實驗室剖檢3頭仔豬，可見仔豬腎臟出血、腸膨氣脹腫、肺出血變白、脾臟腫大，結合腹瀉仔豬臨床癥狀、及養(yǎng)殖場發(fā)病情況調查，初步懷疑仔豬感染病毒性疾病。

2.2PCR檢測結果與分析

3頭仔豬樣品PCR檢測結果顯示（見圖1）：1號豬組織樣品豬圓環(huán)病毒抗原檢測出現陽性條帶，片段大小為701bp；1號豬、2號豬、3號豬組織樣品輪狀病毒抗原檢測出現陽性條帶，片段大小為374bp；均與預期相符，其他病毒檢測結果均為為陰性；說明該生豬養(yǎng)殖場發(fā)生了豬圓環(huán)病毒2型和豬輪狀病毒的混合感染。

2.3治療結果

采取1.4所述治療措施7d后回訪，養(yǎng)殖場未出現新病例，14d后回訪，疫情已被控制，養(yǎng)殖場正常運轉。

3結果討論

臨床上豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病毒混合感染仔豬的案例并不常見，僅根據病豬臨床癥狀和病理變化，根本無法確診，科學的診斷必須在此基礎上進行實驗室檢測。RV實驗室檢測可以采用電鏡法、放射免疫實驗、ELISA雙抗體夾心法和PCR病原檢測等H。PCV-2實驗室檢測包括病毒分離與鑒定、間接免疫熒光技術、免疫組化技術、PCR病原檢測等。PCR技術具有特異性強、敏感度高、快速、簡便、重復性好等突出優(yōu)點，在動物疫病病原學檢測中越來越受歡迎，PCR技術在不斷完善與改進，臨床已有成熟的PCR方法進行豬輪狀病毒、豬圓環(huán)病毒2型的檢測。此次實驗室檢測正是采用PCR技術。

根據腹瀉仔豬臨床癥狀、剖檢病理變化以及實驗室PCR檢測結果，確診為該養(yǎng)殖場發(fā)生了豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）與豬輪狀病毒（RV）混合感染。該養(yǎng)殖場仔豬腹瀉主要發(fā)生在哺乳仔豬，揭示母源抗體水平下降。此次腹瀉由豬輪狀病毒感染引發(fā)，而豬圓環(huán)病毒感染則使病情進一步惡化。

在確定病因后，養(yǎng)殖場立即采取對母豬、哺乳仔豬、斷奶仔豬緊急免疫接種豬圓環(huán)病毒2型弱毒苗、豬輪狀病病毒弱毒疫苗，對發(fā)病仔豬進行隔離治療以及加強養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理等方面措施，最終控制了疫情。

4結論

該養(yǎng)殖場發(fā)生了豬圓環(huán)病毒2型與豬輪狀病毒混合感染疫情，通過對母豬、斷奶仔豬、哺乳仔豬進行疫苗免疫，以及加強養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理等措施，最終控制了疫情。