韋梅琴 +唐楠++張文蓮+胡鮮寧

摘要：以大巖桐試管苗為試材，用改良過(guò)的過(guò)氧化氫-醋酸離析法制片，光學(xué)顯微鏡下觀察并比較試管正常苗與玻璃化苗的葉表結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2類(lèi)試管苗的上下表皮均有氣孔器、腺毛、表皮毛的分布，但它們的數(shù)量與氣孔特征具有顯著差異。與試管正常苗相比，玻璃化苗上下表皮細(xì)胞單位面積表皮毛、腺毛、氣孔器密度減少，保衛(wèi)細(xì)胞形態(tài)異常，氣孔器的長(zhǎng)度差異不明顯，但氣孔器寬度、相對(duì)開(kāi)張度均較正常苗顯著增大，是正常試管苗的2倍。此外，玻璃化苗與外界進(jìn)行氣體和水分交換量明顯大于正常苗，從而導(dǎo)致玻璃化苗持水能力弱、易失水，這是試管玻璃化苗在繼代、生根培養(yǎng)中不能正常生長(zhǎng)、極易死亡的主要原因。

關(guān)鍵詞：大巖桐；試管正常苗；玻璃化苗；葉表皮；比較

中圖分類(lèi)號(hào)： Q945.45文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）04-0093-03

大巖桐（Sinningia speciosa）屬苦苣苔科苦苣苔屬多年生草本植物，別稱(chēng)落雪泥，原產(chǎn)于巴西，是點(diǎn)綴和裝飾室內(nèi)及窗臺(tái)的理想盆花。目前圍繞大巖桐做了過(guò)量表達(dá)CFL以及激素處理改變花的發(fā)育與調(diào)控作用及其機(jī)理研究、再生體系的建立和優(yōu)化及遺傳轉(zhuǎn)化等研究[1-9]；大巖桐常規(guī)的繁殖方法一般用播種、枝插、分球莖等方法來(lái)進(jìn)行，但繁殖系數(shù)低，滿(mǎn)足不了人們的需求。而利用組織培養(yǎng)的方法可有效提高繁殖系數(shù)，為大巖桐的快繁提供保障；但在組織培養(yǎng)過(guò)程中不可避免地出現(xiàn)異常苗，胡鑫等對(duì)大巖桐再生植株經(jīng)過(guò)連續(xù)組織培養(yǎng)以后，發(fā)現(xiàn)了如葉序的改變和花的同源異型現(xiàn)象等表型突變[9]，在大巖桐后期的繼代培養(yǎng)中見(jiàn)到了玻璃化苗，其增殖能力較低，難以生根成苗，對(duì)組培體系的穩(wěn)定性和種苗生產(chǎn)造成嚴(yán)重的影響[2，9]。本試驗(yàn)針對(duì)大巖桐試管正常苗和玻璃化苗的葉片，進(jìn)行葉表結(jié)構(gòu)比較，試圖從解剖學(xué)的角度探討試管玻璃化苗在繼代培養(yǎng)中不能正常生長(zhǎng)、極易死亡的原因，為深入研究試管玻璃化苗的機(jī)理提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

取溫室中生長(zhǎng)較為健壯的大巖桐莖尖，經(jīng)過(guò)初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)獲得試管正常苗與試管玻璃化苗。

1.2方法

以大巖桐試管正常苗和試管玻璃化苗為試材，2類(lèi)苗各取6株，從頂端向下取第3張葉片，將葉片中上部主葉脈兩側(cè)部位剪成1 cm左右的方塊。將上述葉片方塊用改良過(guò)的過(guò)氧化氫-醋酸離析法對(duì)上、下表皮進(jìn)行離析，1%番紅染色，中性樹(shù)膠封片；在奧特BK-5000（OPTEC-BK5000）光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照；利用測(cè)微軟件TSView對(duì)上、下表皮的氣孔進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，測(cè)定氣孔的長(zhǎng)和寬，氣孔開(kāi)口長(zhǎng)、開(kāi)口寬等指標(biāo)；所得數(shù)據(jù)均為20個(gè)視野下的平均值。

氣孔密度：

[JZ]D=S/M。

式中：D為氣孔器密度；S代表整個(gè)視野內(nèi)的氣孔數(shù)目；M代表每個(gè)視野的面積。

氣孔相對(duì)開(kāi)張度：

[JZ]氣孔相對(duì)開(kāi)張度=氣孔開(kāi)口寬/氣孔開(kāi)口長(zhǎng)×100%。

1.3數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用Excel2003及SPSS 13軟件進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1大巖桐試管正常苗和玻璃化苗形態(tài)特征

取溫室中生長(zhǎng)的大巖桐莖尖，經(jīng)過(guò)離體培養(yǎng)獲得無(wú)菌初代培養(yǎng)物，在初期的培養(yǎng)中試管苗生長(zhǎng)健壯無(wú)異?，F(xiàn)象，在后期的繼代培養(yǎng)中才可見(jiàn)玻璃化苗，并隨培養(yǎng)代數(shù)增加，玻璃化加重。離體培養(yǎng)條件下的試管正常苗和試管玻璃化苗的葉的形狀和株高差異不大，其株高均在7～8 cm左右，葉對(duì)生，卵圓形或長(zhǎng)橢圓形，有鋸齒；但葉片的大小與顏色有明顯的不同，即試管正常苗的葉片小而厚、葉色呈深綠色，而玻璃化苗的葉片大而薄，整個(gè)葉片明顯失綠，色澤呈粉紅色，僅在葉片的葉脈附近可見(jiàn)少量綠色，未有腫脹或明顯的水浸狀，這類(lèi)苗增殖分化能力較低，難以進(jìn)行生根培養(yǎng)（圖1）。

2.2葉表結(jié)構(gòu)

大巖桐的葉表結(jié)構(gòu)由表皮細(xì)胞、表皮毛及氣孔器等幾部分組成。2類(lèi)試管苗的葉表結(jié)構(gòu)差異主要表現(xiàn)在表皮細(xì)胞的形狀、氣孔復(fù)合體的大小、密度等方面（表1、圖2）。

2.2.1表皮細(xì)胞的形狀及其附屬物

光學(xué)顯微鏡下2類(lèi)試管苗葉的表皮細(xì)胞形狀明顯不同，即試管正常苗葉片的上、下表皮細(xì)胞呈多邊形，垂周壁平直或弓形；試管玻璃化苗的上、下表皮細(xì)胞呈不規(guī)則形狀其垂周壁上表皮的為淺波形，下表皮的為深波形。大巖桐試管苗表皮細(xì)胞上的附

從氣孔長(zhǎng)/寬的值看，大巖桐試管正常苗上表皮比值為0.96，下表皮比值為1.01，比值都在1左右，說(shuō)明大巖桐試管正常苗的氣孔器近乎圓形；玻璃化苗上表皮比值為0.72，下表皮比值為0.88，可見(jiàn)氣孔形狀呈扁圓形（表2、圖2）。同時(shí)還存在氣孔發(fā)育不完善現(xiàn)象：（1）氣孔器開(kāi)口極大，開(kāi)口形狀有長(zhǎng)方形、月牙形與圓形等；（2）2個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞發(fā)育不平衡，大小不等（圖2-E至圖2-H）。試管正常苗下氣孔的相對(duì)開(kāi)張度0.51，玻璃化苗的0.98，開(kāi)口近乎圓形；試管正常苗上氣孔的相對(duì)開(kāi)張度0.34，玻璃化苗的0.64，二者差異顯著?？梢?jiàn)，不論是上表皮還是下表皮，玻璃化苗的氣孔的相對(duì)開(kāi)張度是正常試管苗的2倍。

2.2.2.2氣孔密度

大巖桐試管正常苗的上表皮氣孔密度（188.66±14.13）個(gè)/mm2，下表皮氣孔密度（191.46±21.90）個(gè)/mm2，上、下表皮細(xì)胞之間氣孔密度差異不明顯；試管玻璃化苗的上表皮氣孔密度為（135.31±20.67）個(gè)/mm2，下表皮氣孔密度（175.66±15.36）個(gè)/mm2（表2）。由此可見(jiàn)，同一類(lèi)型的試管苗表現(xiàn)為下表皮氣孔數(shù)量大于上表皮的；不同類(lèi)型的試管苗，不論上表皮還是下表皮均表現(xiàn)為試管正常苗的氣孔密度多于試管玻璃化苗的氣孔密度，兩者差異顯著，這與槐樹(shù)和絲石竹中的結(jié)果[10-11]相反。

3結(jié)論與討論

玻璃化苗是植物組織培養(yǎng)中特有的一種生理性病變，在組織培養(yǎng)中普遍存在[10-11]。它作為一種畸型苗，在形態(tài)特征上一般表現(xiàn)為植株矮小、莖葉腫脹畸形、組織半透明水浸狀、葉色為海綠色、組織質(zhì)脆易斷等[12]。大巖桐玻璃化苗外部形態(tài)與正常苗無(wú)明顯差異，植株具有明顯的節(jié)與節(jié)間，葉片大而薄，沒(méi)有腫脹多汁現(xiàn)象，整個(gè)葉片明顯失綠，色澤呈粉紅色，僅在葉片的葉脈附近可見(jiàn)少量綠色，未有腫脹或明顯的水浸狀。P[KG-*5]a[DD（-1*2][HT6]^[DD）]ques認(rèn)為，玻璃化苗可分為外觀形態(tài)明顯異常與基本無(wú)異常2種類(lèi)型，大巖桐玻璃化苗形態(tài)與后者相似，屬于基本無(wú)異常類(lèi)型[13]。這可能受培養(yǎng)條件的影響，使得外植體在培養(yǎng)基中分別導(dǎo)致非多汁和多汁玻璃苗的產(chǎn)生[14]，同時(shí)也與植物種類(lèi)、基因型的差異有關(guān)，長(zhǎng)期的組織培養(yǎng)導(dǎo)致內(nèi)源激素水平發(fā)生改變，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，瓶?jī)?nèi)氣體積累不斷增加，引起植物對(duì)物質(zhì)的利用受阻，從而導(dǎo)致試管玻璃化的發(fā)生[15]。

葉片表皮是植物體和外界環(huán)境接觸的最外層組織，氣孔器是調(diào)節(jié)氣體出入和水分蒸騰的重要結(jié)構(gòu)，與植物的光合作用、蒸騰作用直接相關(guān)[16]。2類(lèi)試管苗氣孔器的長(zhǎng)度變化不明顯，而氣孔器的寬度和長(zhǎng)寬比差異顯著，玻璃化苗的氣孔相對(duì)開(kāi)張度較正常苗顯著增大，是正常試管苗的2倍，說(shuō)明環(huán)境對(duì)2類(lèi)試管苗的氣孔特性的影響程度不同?；睒?shù)、絲石竹、蘋(píng)果的離體培養(yǎng)研究表明，玻璃化后葉片上、下表皮氣孔數(shù)明顯增多[10-11，17]，而筆者的結(jié)果與之相反，但與芥菜的玻璃苗結(jié)論[18]一致，即單位面積內(nèi)氣孔數(shù)減少，這可能與玻璃化苗葉片的大小有關(guān)。與試管正常苗相比，大巖桐玻璃化苗葉面積顯著增大，使得氣孔在單位葉面積內(nèi)的分布量下降，可見(jiàn)氣孔密度的變化與葉面積的變化有一定的聯(lián)系。

此外，玻璃化苗與正常苗在內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)上也存在明顯差異。與正常試管苗相比，玻璃苗葉片的機(jī)械組織較弱、維管束組織發(fā)育不良[11，17，19-20]，從而影響體內(nèi)生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，使得玻璃化苗的內(nèi)源生長(zhǎng)素分布狀況發(fā)生改變，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分運(yùn)輸不暢通[20-21]；葉表附屬物——表皮毛及腺毛較少；氣孔器異常、發(fā)育不完全，開(kāi)口較大。這些特點(diǎn)顯示出玻璃化苗與外界進(jìn)行氣體（包括水、氣）交換的途徑明顯較正常苗的增大[14]，持水能力較弱；同時(shí)葉片葉色褪綠，不能行使正常的光合作用，最終導(dǎo)致其新陳代謝和生理功能失調(diào)[22-23]，這是試管玻璃化苗在繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)中不能正常生長(zhǎng)，極易死亡的主要原因之一[17]。因此，在大巖桐試管苗的培養(yǎng)過(guò)程中，控制繼代培養(yǎng)次數(shù)對(duì)減少玻璃化的發(fā)生至關(guān)重要。玻璃化的產(chǎn)生也與培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件等密切相關(guān)，因此如何控制這類(lèi)物質(zhì)的用量以防止大巖桐試管苗玻璃化的發(fā)生有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]曹桂萍，王建美. 大巖桐的組織培養(yǎng)與快速繁殖研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（5）：16-16，22.

[2]徐全樂(lè)，謝亞紅，劉文婷，等. 大巖桐高頻再生體系建立的兩種途徑[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2010，37（1）：135-140.

[3]邵果園，梁國(guó)魯，王力超，等. 大巖桐快繁體系優(yōu)化研究[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，29（4）：127-130.

[4]周鍾信，李建科，朱惠珍，等. 大巖桐開(kāi)花生物學(xué)的觀察及快繁技術(shù)的研究[J]. 天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，5（2）：1-8.

[5]李達(dá). 大巖桐再生體系的建立及遺傳轉(zhuǎn)化的研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[6]張明哲. 大巖桐過(guò)量表達(dá)CFL以及激素處理改變花的發(fā)育[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2008.

[7]李曉燕. miR159和miR172表達(dá)對(duì)大巖桐花發(fā)育的調(diào)控作用及其機(jī)理研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2012.

[8]郭麗. 大巖桐遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立與LEA蛋白基因的導(dǎo)入[D]. 重慶：西南大學(xué)，2008.

[9]胡鑫，徐全樂(lè). 連續(xù)組織培養(yǎng)引起大巖桐再生植株的表型變化[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（5）：167-170.

[10]王紀(jì)方，李錫香，賈春蘭，等. 絲石竹玻璃苗生理特性和形成機(jī)理初探[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，5（1）：72-78.

[11]王喆之，胡正海. 槐樹(shù)試管正常苗與超度含水態(tài)苗莖葉的比較形態(tài)學(xué)研究[J]. 植物學(xué)報(bào)，1997，39（7）：647-652.

[12]Ziv M. Vitrification：morphological and physiological disorders of plants[M]//Debergh P C，Zimmerman R H. Micropropagation，technology and application. Dorderecht：Kluwer Academic Publ，1991：45-70.

[13]Pa[DD（-1*2][HT6]^[DD）]ques M. Vitrification and micropropagation：causes，remedies and prospects[J]. Acta Horticulturae，1991，289：283-290.

[14]Pa[DD（-1*2][HT6]^[DD）]ques M，Boxus P.A model to learn “vitrification”，the rootstock apple M.26 present results[J]. Journol of Geophysical Research Oceans，1991，96（C4）：7023-7048.

[15]Sriskandarajah S，Serek M. Regeneration from phylloclade explants and callus cultures of Schlumbergera and Rhipsalidopsis[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2004，78（1）：75-81.

[16]馬書(shū)榮，閻秀峰，陳伯林，等. 遮光條件下裂葉沙參和泡沙參氣孔行為的對(duì)比研究[J]. 植物研究，2000，20（1）：63-68.

[17]葛紅娟，梁美霞，戴洪義. 玻璃化與正常蘋(píng)果試管苗的葉片和莖的顯微結(jié)構(gòu)比較[J]. 植物生理學(xué)通訊，46（3）：223-227.

[18]陳國(guó)菊，雷建軍. 芥菜離體培養(yǎng)中玻璃化機(jī)理的研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，22（3）：237-239.

[19]常有宏，張玉嬌，李曉剛，等. “黃冠”梨正常試管苗與玻璃化苗生理生化及超微結(jié)構(gòu)的比較研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2011，38（2）：225-232.

[20]韋梅琴，鄭江偉. 東方百合試管正常苗與玻璃苗葉片解剖結(jié)構(gòu)的比較[J]. 北方園藝，2007，（12）：203-205.

[21]梁海曼，周菊華. 試管苗玻璃化現(xiàn)象的生理生化和機(jī)理探討[J]. 武漢植物學(xué)研究，12（3）：281-288.

[22]楊俊英，羅慶熙，宋明，等. 大蒜試管苗玻璃化機(jī)理的研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，18（6）：801-805.

[23]李云，田硯亭，羅曉芳. 珠美海棠試管苗玻璃化發(fā)生機(jī)理的初步研究[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，18（1）：52-58.