易凡琪，鄭軍平，李瓊瑜，焦思明，杜昱光，葉云，劉洪濤

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幾丁寡糖對脂肪酸代謝紊亂的抑制作用及分子機制

易凡琪1,2，鄭軍平2，李瓊瑜2，焦思明2，杜昱光2，葉云1，劉洪濤2

1 西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院藥劑科，四川瀘州 646000 2 中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190

旨在從細胞學實驗及整體動物水平探討幾丁寡糖 (NACOS) 對機體脂代謝紊亂的抑制作用及其潛在的分子機制。在細胞學實驗中，HepG2細胞被分為4組，即對照組、棕櫚酸 (Palmitic acid，PA) 組、幾丁寡糖(NACOS) 組、NACOS+PA組。在體內(nèi)實驗中，將雄性C57BL/6小鼠隨機分為4組 (=5)，即正常對照(NCD)組、高脂飲食 (HFD) 組、NACOS組、NACOS+HFD組，實驗共20周。主要檢測方法如下：采用油紅O染色檢測細胞脂質沉積，RT-PCR方法檢測脂代謝調(diào)控分子及炎癥因子的轉錄表達水平，Western blotting 方法檢測MAPKs及PI3K/Akt通路中相關蛋白激酶的蛋白磷酸化水平。細胞學實驗表明，NACOS對HepG2沒有明顯的細胞毒性作用，并能顯著降低細胞內(nèi)脂滴顆粒的沉積，下調(diào)肝細胞及小鼠肝臟組織中脂代謝相關調(diào)控因子 (PGC1α、Cox5b及Mcad) 及炎癥因子IL-1β的轉錄表達水平 (<0.05或0.01)，抑制肝細胞及肝臟組織中p38、ERK1/2及Akt蛋白激酶的激活(<0.05或0.01)。基于上述研究，NACOS可抑制肝臟線粒體脂肪酸氧化和脂質從頭合成途徑，阻斷炎癥反應的發(fā)生，從而預防脂代謝紊亂的發(fā)生。

幾丁寡糖，高脂飲食，脂肪酸，脂代謝紊亂，炎癥

幾丁質 (Chitin) 又名殼多糖、甲殼質，廣泛存在于昆蟲和甲殼類動物 (蝦、蟹等) 的外骨骼、多種植物和真菌的細胞壁及一些綠藻中，是海洋環(huán)境中碳、氮及能量存在的主要形式之一，其在自然界中的含量僅次于纖維素[1]。幾丁質是由N-乙酰氨基葡萄糖 (GlcNAc) 通過β-1，4-糖苷鍵連接而成的多糖，分子式為(C8H13NO5)。幾丁質具有良好的組織相容性和生物降解性，安全無毒，無刺激性，無抗原性[2]。幾丁質不溶于水、有機溶劑及堿液，在酸中不穩(wěn)定，易發(fā)生糖苷鍵的斷裂，形成聚合度不等的水溶性片段，采用適當?shù)姆椒▽⑵浣到?，可得到不同聚合度和乙酰度的水溶性幾丁寡?(Chitin oligosaccharides，NACOS)。研究表明，小分子幾丁寡糖的聚合度、乙酰度及乙?；稽c不同時，將表現(xiàn)出不同甚至完全相反的生物學活性。文獻證實，不同結構的幾丁寡糖亦表現(xiàn)出多種藥理活性，如抗氧化、抗菌、抗腫瘤及增強機體免疫功能等[3–6]。

過多的脂肪聚集不但會擾亂機體內(nèi)糖和脂肪的代謝，還會引起代謝與免疫調(diào)節(jié)通路的整合[7]。伴隨著脂肪組織及肝臟的脂肪酸蓄集，上述組織和/或器官中炎癥細胞的浸潤及炎性反應標記物的增高亦將隨之出現(xiàn)。文獻報道，肥胖機體內(nèi)存在一種慢性、低度的炎癥狀態(tài)，學者稱之為代謝性炎癥[8]。代謝性炎癥可影響機體的主要代謝器官如肝臟、脂肪、骨骼肌等，導致胰島素抵抗、血脂升高和肝脂肪沉積等系統(tǒng)性代謝紊亂。肝臟也是肥胖機體炎癥通路激活的主要器官，其炎癥反應同樣可通過器官的交互作用引起系統(tǒng)性炎癥和代謝紊亂[9]。本研究使用棕櫚酸刺激肝細胞產(chǎn)生過量脂滴積累，及高脂飲食誘導小鼠產(chǎn)生脂肪肝，旨在研究NACOS預處理對肝細胞及小鼠肝臟組織脂代謝紊亂的保護作用和潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

人肝癌細胞系購于中國科學院細胞庫；殼寡糖購自大連格萊克生物科技有限公司；棕櫚酸 (Palmitic acid，PA) 購自美國OCROS公司；MEM 培養(yǎng)基及青霉素/鏈霉素購自Gibco公司；胎牛血清 (FBS) 購自北京康源世紀有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒及油紅O染液購自西安赫特生物科技有限公司；RNA抽提試劑盒及Ultra SYBR Green試劑盒購自Promega公司。

幾丁寡糖 (NACOS) 由實驗室制備，主要流程如下：1) 取5.0 g殼寡糖 (分子量為 300–1 700 Da，脫乙酰度為90%)，溶于50 mL水中，分別加入3 mL甲醇及0.1 g 4-二甲氨基吡啶，再加入乙酸酐4.37 mL，于 60 ℃下反應4 h；2) 在反應液中加入5倍體積的丙酮，得到灰白色沉淀，過濾后用丙酮洗滌2–3遍，置于真空干燥箱中干燥2 h，得到灰白色NACOS；3) 經(jīng)LC-MS及核磁共振分析，確定NACOS的乙酰度為97%，聚合度為3–10。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及藥物處理

HepG2細胞用MEM常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng) (含10% FBS胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素及1%非必需氨基酸)，培養(yǎng)溫度37 ℃，5% CO2濃度。細胞融合度達80%后，以0.125%胰酶消化傳代 (含0.02% EDTA)。

藥物處理如下：1) 待細胞融合度為80%左右時，以不同濃度的NACOS預處理12 h；2) 棄上清，以無血清培養(yǎng)基洗滌2次；3) 加入含PA (100 μmol/L) 的新鮮培養(yǎng)基 (1%或10% FBS)，根據(jù)實驗設定時間進行培養(yǎng)；4) 處理完畢，棄上清，收集細胞并進行后續(xù)相關實驗。

1.2.2 細胞活性實驗

1) 收集對數(shù)生長期HepG2細胞，調(diào)整細胞懸液的濃度為104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔150 μL；2) 細胞融合度達到80%左右時，棄上清，以無血清培養(yǎng)基洗滌2次；3) 加入不同濃度的NACOS和/或PA，進行藥物處理；4) 處理完畢，棄上清，以無血清培養(yǎng)基洗滌2次；5) 加入100 μL含MTT (5 mg/mL) 的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 h；5) 棄上清，每孔加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶充分溶解；6) 使用酶聯(lián)免疫檢測儀，于490 nm處測量各孔的光吸收值；7) 計算細胞活力，活力%＝(給藥–空白)/(對照–空白)×100%。

1.2.3 油紅O染色

1) HepG2細胞接種于六孔培養(yǎng)板中，待細胞融合度為80%左右時，進行藥物處理；2) 藥物處理完畢，棄上清，以預冷PBS清洗2次；3) 4%多聚甲醛固定30 min；4) PBS漂洗1 min后，60 %異丙醇沖洗15 s；5) 油紅O工作液染細胞1 min后，PBS漂洗3次，每次3 min。

1.2.4 動物實驗

本研究所用實驗動物由北京維通利華科技有限公司提供，系4周齡清潔級雄性C57BL/6小鼠，體重18–20 g。高脂飼料 (蛋白∶碳水化合物∶脂=20∶35∶45，Kcal%) 及基礎飼料 (蛋白∶碳水化合物∶脂=20∶70∶10，Kcal%) 均購自北京維通利華科技有限公司。飼養(yǎng)條件控制在20–25 ℃，自然照明，自由飲水和攝食。

小鼠隨機分為4組 (=5)，具體分組及藥物處理如下：1) 正常對照組(Normal chow diet，NCD)，飼以基礎飼料+正常飲水；2) 高脂模型組 (High fat diet，HFD)，飼以高脂飼料+正常飲水；3) NACOS組：飼以基礎飼料+NACOS (1 mg/mL) 水溶液；4) NACOS+高脂模型組：飼以高脂飼料，以濃度為1 g/L的NACOS替代正常飲水。飼養(yǎng)20周后，麻醉后殺死小鼠，分別提取肝臟組織中的mRNA和蛋白質進行實驗檢測。

1.2.5 樣品RNA提取及RT-PCR反應

RNA提取流程如下：1) 稱取40 mg新鮮肝臟組織，加入800 μL Trizol，放入1.5 mL離心管中，研磨均勻；2) 每毫升勻漿液加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min；3) 4 ℃、12 000 r/min離心15 min，將上層無色水相轉移至一新的離心管中；4) 加入等體積異丙醇，顛倒均勻，室溫放置10 min；5) 離心10 min，條件同上；6) 棄上清，加入75 %乙醇800 μL，洗滌沉淀，渦旋3 s；7) 離心3 min，條件同上；8) 棄上清，室溫放置2–3 min，加入50 μL DEPC水溶解；9) 確定各樣品RNA濃度，并使用cDNA逆轉錄試劑盒合成cDNA。細胞樣品RNA提取及逆轉錄步驟同上。

RT-PCR 反應使用 UltraSYBR試劑盒，反應體系為25 μL，組成如下：1 μL cDNA，10 μL SYBR Green，1 μL上、下游引物 (上海生工公司合成，引物序列見表1)，13 μL去離子水。反應參數(shù)設置為：50 ℃ 1 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；上述反應條件下，共40個循環(huán)。

表1 RT-PCR實驗引物序列表

1.2.6 Western blotting蛋白檢測

1) HepG2細胞種于六孔培養(yǎng)板中，經(jīng)不同濃度的藥物處理后，預冷PBS清洗1次；2) 加入RIPA裂解液，用細胞刮刀輕輕刮下細胞，收集到1.5 mL離心管中；3) 4 ℃條件下離心15 min (12 000×g)，收集離心上清液；4) 經(jīng)BCA法定量各組蛋白樣品后，加入適量上樣緩沖液，混勻后95 ℃變性；5) 樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 分離目的條帶，以濕轉法將目的條帶轉移至PVDF膜上；6) 經(jīng)5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入p-p38、p38、p-ERK1/2、ERK1/2、p-Akt、Akt及β-actin一抗，4 ℃孵育過夜；7) TBST漂洗3次，每次5 min；8) 加入辣根過氧化物酶標記的相應二抗，室溫孵育1 h；9) TBST漂洗3次，每次5 min；10) 免疫反應復合物用ECL化學發(fā)光試劑盒檢測。

1.2.7 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)應用SPSS軟件進行統(tǒng)計學處理，資料以均數(shù)±標準差 (±)表示。

2 結果與分析

2.1 PA和NACOS處理對HepG2細胞活力的影響

MTT細胞活性實驗表明，PA在25–200 μmol/L范圍內(nèi)對HepG2細胞的活力沒有明顯的抑制作用 (圖1A)，表明PA在該濃度下沒有細胞毒性。另外，NACOS (100 μmol/L) 可略微增加HepG2的活力，但沒有統(tǒng)計學差異，且NACOS與PA聯(lián)合進行藥物處理時亦沒有表現(xiàn)出細胞毒作用(圖1B)。

2.2 PA及NACOS對HepG2細胞脂代謝調(diào)控因子及炎癥因子轉錄表達的影響

RT-PCR實驗結果表明，HepG2細胞經(jīng)PA (100 μmol/L) 處理3–12 h后，過氧化物酶體增殖體受體共激活因子-1α (PGC1α)、炎癥因子IL-1β、乙酰輔酶A1 (ACC1)、細胞色素氧化酶亞單位-5b (Cox5b)、中鏈酰基輔酶A脫氧酶 (Mcad) 均表現(xiàn)出不同程度的升高 (<0.05或0.01)，并在作用6 h后達峰值 (圖2A)。與PA單處理組相比，HepG2細胞經(jīng)NACOS預處理15 h后可明顯抑制PA誘導的前述因子的轉錄激活 (<0.01) (圖2B)，而NACOS單處理則對各因子的轉錄水平?jīng)]有明顯的影響。上述結果表明，NACOS可抑制PA刺激引起的HepG2細胞脂代謝的紊亂及相關炎癥因子的過表達。

圖1 PA及NACOS處理對HepG2細胞活力的影響(A：PA對HepG2細胞活力的影響；B：NACOS與PA共處理對HepG2細胞活力的影響)

圖2 PA及NACOS對HepG2細胞脂代謝調(diào)控分子及炎癥因子在轉錄水平的影響(A：PA對HepG2細胞脂代謝調(diào)控分子及炎癥因子轉錄表達的影響；B：NACOS對PA誘導的HepG2細胞脂代謝調(diào)控分子及炎癥因子過表達的抑制作用。*P<0.05或**P <0.01，VS對照組；#P<0.05或##P<0.01，VS PA單處理組)

2.3 NACOS對PA誘導的MAPKs及PI3K/Akt通路激活的抑制作用

Western blotting結果顯示，HepG2細胞經(jīng)PA (100 μmol/L) 刺激后，絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases，MAPKs) 及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (Phosphoinositide 3-kinase，PI3K；Protein kinase B，Akt) 通路中的p38、ERK1/2、Akt激酶迅速激活，其磷酸化水平在0–1 h內(nèi)呈時間依賴性增加。其中，p-ERK1/2及p-Akt在0.5 h時達峰值 (<0.05，vs對照組)，而p-p38則在1 h時達最高水平 (<0.01，vs對照組) (圖3A、3B)。

為研究NACOS對PA誘導的MAPKs及PI3K/Akt通路激活的抑制作用，HepG2經(jīng)NACOS (50–100 μg/mL) 預處理15 h后，再由PA (100 μmol/L) 作用0.5 h。結果表明，NACOS預處理可顯著抑制p-p38、p-ERK1/2及p-Akt的表達水平 (<0.05，vs對照組)，提示NACOS可能通過阻斷MAPKs及PI3K/Akt通路達到抑制HepG2細胞脂代謝紊亂的作用 (圖3C、3D)。

2.4 NACOS對HepG2細胞脂滴形成的抑制作用

為探討NACOS對肝細胞中脂滴形成的抑制作用，HepG2細胞經(jīng)NACOS預處理15 h后，再用PA (100 μmol/L) 刺激24 h。待處理完畢，細胞采用油紅O染色，然后顯微鏡觀察細胞漿中油紅脂滴形成的變化。結果顯示，對照組在光學顯微鏡下可見肝細胞輪廓清晰，細胞內(nèi)呈現(xiàn)的紅色脂肪顆粒極少，而PA處理后則細胞漿中的紅色脂肪顆粒呈顯著聚集趨勢。與PA單處理相比，NACOS預處理可明顯抑制PA誘導所致的HepG2細胞中脂滴的形成 (圖4)。

2.5 NACOS處理對脂代謝紊亂小鼠體重及飲食的影響

為進一步確定NACOS對機體脂代謝紊亂的預防作用，我們考察了高脂模型C57BL/6小鼠在給予NACOS后各項生理指標的的變化 (圖5)。結果表明，與給予基礎飼料的正常對照組 (NCD) 小鼠比較，高脂模型組(HFD) 小鼠的平均體重顯著增加 (<0.01)。相反，當脂代謝紊亂小鼠同時給予NACOS (1 mg/mL，溶于日常飲水中) 處理時，可顯著抑制其體重的增加 (<0.05或0.01)。此外，無論高脂飼料抑或NACOS均對小鼠的采食量及飲水量沒有明顯影響。

圖4 NACOS預處理對PA誘導所致的HepG2細胞中脂滴形成的抑制作用

2.6 NACOS對脂代謝紊亂小鼠肝臟組織脂代謝調(diào)控相關分子及炎癥因子轉錄表達的 影響

我們檢測了NACOS處理對脂代謝紊亂小鼠肝臟組織脂代謝調(diào)控相關分子及炎癥因子轉錄表達的影響 (圖6)。RT-PCR實驗結果表明，HFD組小鼠較NCD組小鼠肝臟組織中PGC1α、ACC1及Mcad顯著升高 (<0.05或0.01)，炎癥因子IL-1β亦增加明顯 (<0.05)，但HFD處理對Cox5b的轉錄表達無顯著影響。與HFD組比較，脂代謝紊亂小鼠經(jīng)NACOS處理后，其肝臟組織中脂代謝調(diào)控因子PGC1α、Mcad及ACC1的轉錄水平均不同程度地受到抑制，炎癥因子IL-1β亦顯著降低，Cox5b轉錄表達水平變化不明顯。上述結果表明，NACOS處理可有效逆轉高脂飲食喂養(yǎng)所致的小鼠肝臟脂代謝紊亂。

2.7 NACOS對小鼠肝臟組織MAPKs及PI3K/Akt通路的影響

為進一步探討NACOS抑制小鼠脂代謝紊亂的分子機制，我們檢測了各實驗組小鼠肝臟組織中MAPKs及PI3K/Akt通路的表達變化 (圖7)。Western blotting結果顯示，與NCD組小鼠相比，HFD組小鼠肝臟的p-p38、p-Akt蛋白的表達水平顯著增高 (<0.05)，而p-ERK1/2則無明顯差別 (圖7A、7B)。與HFD組相比，MACOS可顯著抑制高脂飲食喂養(yǎng)所致p-p38及p-Akt的激活 (<0.01或0.05)。此外，NACOS亦可降低p-ERK1/2的蛋白表達水平 (<0.05)。

3 討論

肝臟是人體代謝最活躍的合成和分解代謝器官之一，肝臟對糖、脂、蛋白的代謝均有直接的影響。以往研究表明，高脂喂養(yǎng)后可致使小鼠肝臟內(nèi)脂質沉積和肝臟胰島素抵抗的發(fā)生，同時伴有各種肝細胞內(nèi)事件的發(fā)生，如線粒體脂肪酸氧化功能障礙[10]、脂質從頭合成增加[11]、內(nèi)質網(wǎng)應激[12–13]和炎癥通路激活[14]等，但脂肪肝發(fā)生的始動機制、各種肝內(nèi)細胞事件的發(fā)生順序及其與脂肪肝發(fā)生的關系均尚未闡明。本文通過PA刺激肝細胞產(chǎn)生過量脂滴，采用高脂飲食誘導小鼠產(chǎn)生脂肪肝，檢測NACOS處理與否時小鼠機體及其肝臟的生理、病理學改變，全面評價了NACOS對早期脂肪肝形成的抑制作用及潛在的分子作用機制。

圖7 NACOS處理對脂代謝紊亂小鼠肝臟組織MAPKs及PI3K/Akt通路的影響 (*P<0.05或P<0.01，vs NCD組；#P<0.05或##P<0.01，vs HFD組)

不健康的飲食習慣可導致脂肪肝的發(fā)生，其中脂類的過量攝入是飲食因素中導致脂肪肝的最常見原因[15]。臨床和動物研究已證明，過量飽和脂肪酸攝入將引起肝內(nèi)的脂質沉積[15–16]。本研究通過體外構建肝細胞脂肪變性模型，以PA刺激模擬高脂飲食下脂肪蓄積對肝細胞的損傷作用，以NACOS作為干預因素，考察NACOS對肝脂代謝紊亂的預防作用。通過油紅染色，從形態(tài)學上觀察到，在PA誘導損傷的HepG2細胞中，有大量脂滴產(chǎn)生，而NACOS預處理則可有效降低細胞內(nèi)脂滴的聚集程度。體內(nèi)實驗進一步發(fā)現(xiàn)，NACOS處理可抑制高脂飲食所致的C57BL/6小鼠的體重增加及脂代謝紊亂的發(fā)生。

肝臟的一個重要功能是維持正常機體血漿葡萄糖濃度的穩(wěn)態(tài)，當機體攝入能量過剩時，過多的葡萄糖可通過脂質從頭合成途徑轉化為脂肪貯存在肝臟，內(nèi)源性糖異生形成的葡萄糖或外源的果糖等在肝細胞中首先轉化為乙酰輔酶A羧化酶ACC1，后者是肝臟脂質從頭合成的關鍵酶。生理狀態(tài)下肝內(nèi)脂質僅有5%來源于內(nèi)源性脂質從頭合成途徑[13]，然而在病理狀態(tài)下肝內(nèi)源性脂質從頭合成途徑將成為肝內(nèi)脂質沉積的重要來源。另外，ACC1基因敲除或表達減少均可減少高脂飲食誘導的肝臟脂質沉積[17]。本實驗中，在HepG2細胞及小鼠肝臟內(nèi)，PA及高脂飲食均能導致脂質合成酶ACC1的顯著增高 (<0.05)，而NACOS處理則可不同程度地下調(diào)ACC1在轉錄水平的增加。

線粒體是真核細胞能量代謝的中心，也是脂肪酸氧化的細胞場所，肝內(nèi)線粒體脂肪酸氧化的改變以及功能的異常與肥胖等代謝疾病的發(fā)生發(fā)展相關，如線粒體脂肪酸氧化的減少，可出現(xiàn)脂質堆積[18]。PGC-1α表達于骨骼肌、心肌、肝臟、棕色脂肪組織等能量代謝活躍的組織[19]，可調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生、調(diào)控適應性產(chǎn)熱、調(diào)控骨骼肌細胞內(nèi)脂肪氧化累積等生理過程[20]。研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α基因敲除后，小鼠的脂肪酸氧化基因表達下調(diào)[21]。此外，MCAD是中鏈脂肪酸β氧化第一步的關鍵酶，在脂肪酸氧化中起著重要作用，而PGC-1α可以調(diào)控MCAD的表達水平[22]。本實驗從轉錄水平檢測了線粒體生成和代謝等相關因子，包括PGC1α、MCAD及Cox5b，以對脂肪肝發(fā)生早期時的線粒體功能改變進行評估。本實驗中，體外與體內(nèi)實驗均表明，脂肪酸的過量攝入將導致線粒體合成的上游因子PGC1α及細胞色素氧化酶Cox5b的轉錄表達水平上調(diào) (<0.01)，而NACOS處理則可顯著抑制其上調(diào) (<0.01)。上述結果提示，在脂肪肝發(fā)生的早期存在肝臟線粒體功能障礙和脂肪酸氧化功能障礙，而NACOS則可能通過逆轉線粒體氧化功能損傷，進而增加脂肪酸分解代謝，以阻斷肝細胞脂質的沉積。

過多的脂肪在體內(nèi)聚集不但會干擾體內(nèi)脂肪的代謝，還會引起代謝和免疫反應通路的異常[7]。伴隨肝臟脂肪組織的聚集，炎癥細胞的浸潤及炎性反應的發(fā)生亦隨之出現(xiàn)。多項研究表明，肥胖機體內(nèi)存在一種慢性、低度的炎癥狀態(tài)，學者稱之為代謝性炎癥[8]。慢性炎癥反應在脂肪肝的形成和發(fā)展過程中起到了關鍵作用，但其發(fā)生的分子機制至今尚不明了。最近有觀點認為，肝臟也是肥胖機體炎癥通路激活的重要器官，肝臟的炎癥反應同樣可通過器官的交互作用引起系統(tǒng)性炎癥和代謝紊亂[9]。因此，本研究重點檢測了炎癥相關因子IL-1β在HepG2細胞及小鼠肝臟內(nèi)的表達變化，結果表明，PA及高脂飲食均能導致IL-1β轉錄的顯著增加(<0.01或0.05)，而NACOS共處理則能明顯降低其表達水平(<0.01或0.05)。

研究證明，脂肪肝與炎癥通路相關。MAPKs信號通路存在于大多數(shù)細胞內(nèi)，是細胞膜表面受體與決定性基因表達間起連接作用的重要調(diào)節(jié)酶，可以將細胞外刺激信號傳遞給細胞核，是細胞應激及損傷反應的主要信號通路之一，能被多種炎性刺激激活，在炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要的調(diào)控作用。其中主要有p38分裂原激活蛋白激酶 (p38 MAPK)、c-Jun氨基末端激酶 (c-jun-N-terminal kinases，JNK) 和細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶 (Extracellular signal- regulated protein kinase，ERK) 三條途徑。其中，p38 MAPK通路和JNK通路主要對炎性細胞因子和多種類型的細胞應激信號進行轉導，而ERK通路主要對細胞的生長、分裂和分化信號進行轉導。本實驗表明，PA及高脂飲食可明顯增加p38或/和ERK1/2的磷酸化水平 (<0.05)，而NACOS能顯著抑制兩種激酶的磷酸化發(fā)生(<0.05)，提示NACOS可能通過抑制MAPKs通路的激活而下調(diào)了炎癥反應的發(fā)生。

機體內(nèi)葡萄糖的代謝主要通過胰島素依賴的PI3K/AKT信號通路進行。胰島素受體通過酪氨酸的磷酸化激活其受體激酶，與胰島素受體底物 (IRS) 發(fā)生作用。磷酸化的IRS與PI3K發(fā)生作用，促進其活化和Akt的磷酸化，隨后通過激活葡萄糖轉運載體-4 (GLUT4) 的跨膜轉運，完成對葡萄糖的吸收和利用。當出現(xiàn)胰島素抵抗時，此通路受到抑制，胰島素作用出現(xiàn)障礙，使其無法發(fā)揮正常生物學功能。本實驗表明，無論PA誘導所致的HepG2細胞抑或發(fā)生脂代謝紊亂的小鼠肝臟組織，其增加的Akt磷酸化均可被NACOS有效地抑制 (<0.05或0.01)，提示NACOS將可能通過PI3K/AKT信號通路抑制胰島素抵抗的發(fā)生。

與本研究結果相似，研究表明NACOS的去乙?；a(chǎn)物殼寡糖對高血脂的形成也具有明顯抑制效果。動物實驗發(fā)現(xiàn)，殼寡糖 (分子量為1–10 kDa) 可顯著降低大/小鼠血漿的低密度脂蛋白、膽固醇及甘油三酯，并能增加高密度脂蛋白的血漿水平，且殼寡糖的降脂效果與其聚合度呈負相關[23–24]。因此，聚合度可能是影響甲殼類寡糖抑制脂代謝紊亂的重要因素之一。此外，乙酰度的高低對該類寡糖的生物學活性是否也有較大影響，即相同聚合度的NACOS與殼寡糖之間的活性是否有差別，尚需要在將來的研究中進一步闡釋。

綜上所述，本實驗從生理功能和分子生物學機制兩方面評價了NACOS在早期脂肪肝形成時對肝內(nèi)線粒體脂肪酸氧化、脂質合成途徑及線粒體相關途徑的抑制作用，并通過抑制MAPKs炎癥信號通路和胰島素依賴的PI3K/AKT信號通路，達到調(diào)控脂代謝紊亂及炎癥激活的作用。

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(本文責編 郝麗芳)

Inhibition of chitin oligosaccharide on dyslipidemia and the potential molecular mechanism exploration

Fanqi Yi1, Junping Zheng2, Qiongyu Li2, Siming Jiao2, Yuguang Du2, Yun Ye1, and Hongtao Liu2

1,,646000,,2,,,100190,

The inhibitory effect of NACOS on dyslipidemia and potential molecular mechanisms byandexperiments were investigated. Forstudy, four experimental groups were designed by using HepG2 cells, including the control group, palmitic acid (PA) treatment alone group, NACOS treatment alone group and NACOS + PA treatment group. Forstudy, male C57BL/6 mice were divided into four groups (=5) at random including the normal control group (NCD), high fat diet (HFD) group, NACOS treatment alone group, NACOS+HFD group, which were treated for 20 weeks. The used methods in this study were as follows: the observation of lipid droplet deposition in HepG2 cells by oil red O staining, the detection of mRNA levels of lipid metabolism-related regulators and inflammatory cytokine by RT-PCR method, the monitoring of MAPKs and PI3K/Akt pathway activation by Western blotting method. Thestudy shows that, NACOS had no toxicity on the viability of HepG2 cells at 25–100 μg/mL and significantly reduced the deposition of lipid droplet. Also, based on bothandinvestigation, NACOS evidently down-regulated the expression of lipid metabolism-related regulators (PGC1α, Cox5b, Mcad) and inflammatory cytokine (IL-1β) at mRNA level (<0.05 or 0.01), and suppressed the activation of p38, ERK1/2 and Akt in HepG2 cells and lever tissues from HFD-fed mice (<0.05 or 0.01).Based on the above, NACOS may inhibit the oxidation of liver mitochondrial fatty acid and the lipid biosynthesis, block the inflammatory responses and prevent the HepG2 cells and C57BL/6 mice from lipidemia.

chitin oligosaccharides, high fat diet, fatty acid, lipidemia, inflammation

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31570801).

國家自然科學基金 (No. 31570801) 資助。

December 16, 2016; Accepted: January 23, 2017

Yun Ye. Tel: +86-830-3165750; E-mail: yeyun8622@163.com Hongtao Liu. Tel: +86-10-82545039; E-mail: liuhongtao@ipe.ac.cn

網(wǎng)絡出版時間：2017-02-16

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170216.1026.002.html