楊細(xì)鳳,李仲娟,余福恒,李 茉

(1湖北理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435003；2黃石市東方社區(qū)服務(wù)中心，湖北 黃石 435000)

教學(xué)實(shí)驗(yàn)用阿米巴原蟲培養(yǎng)方法的篩選與評(píng)價(jià)

楊細(xì)鳳1,李仲娟1,余福恒2*,李 茉1

(1湖北理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435003；2黃石市東方社區(qū)服務(wù)中心，湖北 黃石 435000)

為滿足醫(yī)學(xué)寄生蟲課原蟲教學(xué)實(shí)驗(yàn)所需，篩選來源于自然界的阿米巴原蟲進(jìn)行培養(yǎng)，以便找到更有效、便捷、經(jīng)濟(jì)且能滿足臨床教學(xué)所需阿米巴原蟲的培養(yǎng)方法。采用1640細(xì)胞培養(yǎng)液、洛氏培養(yǎng)液、青菜水培養(yǎng)液培養(yǎng)來源于自然界的阿米巴原蟲，觀察其生長狀態(tài)，分別比對(duì)阿米巴原蟲到達(dá)包囊期和滋養(yǎng)體期所需的培養(yǎng)時(shí)間及不同時(shí)間復(fù)蘇時(shí)的成活率。結(jié)果為： 青菜水培養(yǎng)液方法對(duì)自然界的阿米巴原蟲培養(yǎng)效果最佳,青菜水和1640培養(yǎng)液到達(dá)包囊階段時(shí)間分別為(16±0.35) h、(18±0.50) h，與洛氏培養(yǎng)液到達(dá)包囊時(shí)間(22±1.2) h相比均有顯著性差別(P<0.05)；青菜水和1640培養(yǎng)液到達(dá)滋養(yǎng)體的時(shí)間分別為(22±2.24) h、(26±3.45) h，與洛氏培養(yǎng)液到達(dá)滋養(yǎng)體時(shí)間(30±2.5) h相比均有顯著性差別(P<0.01)；青菜水培養(yǎng)液和1640培養(yǎng)液6個(gè)月后再次復(fù)蘇成活率分別為88%、78%，與洛氏培養(yǎng)液的62%相比均有顯著性差別(P<0.01)。青菜水培養(yǎng)液法可作為自然界的阿米巴原蟲培養(yǎng)的首選方法，培養(yǎng)原蟲時(shí)間較短、復(fù)蘇成活率高，且經(jīng)濟(jì)安全，培養(yǎng)的原蟲可作為人體寄生蟲學(xué)實(shí)踐教學(xué)用樣本的替代品。

教學(xué)實(shí)驗(yàn)；原蟲；培養(yǎng)液；阿米巴原蟲

阿米巴病分腸道阿米巴病和腸外阿米巴病，寄生于結(jié)腸引起阿米巴痢疾的致病性原蟲是寄生蟲學(xué)教材中的重點(diǎn)章節(jié)。臨床上腸道阿米巴病的診斷仍以糞便中發(fā)現(xiàn)阿米巴原蟲為可靠依據(jù)。目前也有學(xué)者使用分子生物學(xué)方法鑒定阿米巴原蟲[1]，但由于成本和操作等原因，臨床上腸道阿米巴病的診斷仍以糞便中發(fā)現(xiàn)阿米巴原蟲為可靠依據(jù)[2]。由于存在下面幾種因素：①病人發(fā)病時(shí)分散；②患者多在發(fā)病的初期就進(jìn)行了早期檢查，糞便樣本中原蟲數(shù)量通常不多；③原蟲在常溫下難以成活；④糞便樣本的采集和保存均不規(guī)范等，故而實(shí)驗(yàn)檢查陽性率比較低，易造成臨床誤診或漏診。因此，強(qiáng)化醫(yī)學(xué)生的實(shí)踐課教學(xué)非常必要。然而在實(shí)踐教學(xué)實(shí)施過程中，也正是因?yàn)榘⒚装筒≡x標(biāo)本來源較少，且接觸致病性原蟲還存在被感染的危險(xiǎn)，給臨床實(shí)踐教學(xué)的開展帶來了極大困難。據(jù)國外文獻(xiàn)報(bào)道可以從自然界土壤或水中分離福氏耐格里阿米巴原蟲、雙核勻變?cè)x或狒狒巴拉姆希阿米巴原蟲[3-4]等自由生活致病性阿米巴原蟲。考慮到致病性阿米巴會(huì)帶來安全隱患，本研究旨在從稻草中分離、培養(yǎng)非致病性阿米巴原蟲，用于開展醫(yī)學(xué)寄生蟲課阿米巴原蟲實(shí)踐教學(xué)。

1 材料與方法

1.1 材料

當(dāng)季稻草和新鮮菜葉，采集于大冶市陳貴鎮(zhèn)；洛氏培養(yǎng)液用通心菜和生菜購于超市，由湖北理工學(xué)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室制備;改良型RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液購自武漢大學(xué)試劑中心；日本OLYMPUS CKX41倒置生物顯微鏡；上海新苗醫(yī)療器械電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9272BS-III；蘇州凈化二級(jí)生物安全柜BHC-1300IIB2；6孔培養(yǎng)板和細(xì)胞培養(yǎng)用的吸頭購自美國Costar公司；二甲基亞砜購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 蟲種來源

將稻草剪成2～3 cm小段，使用3種培養(yǎng)液在培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，分別經(jīng)16～48 h即可分離獲取自然界生活的阿米巴滋養(yǎng)體及原蟲。本實(shí)驗(yàn)分離獲取的自然界阿米巴包囊樣本保存在實(shí)驗(yàn)室，已連續(xù)反復(fù)使用了3年(2013.9 —2016.9)。

1.2.2 培養(yǎng)液制備

洛氏培養(yǎng)液采用通心菜水和生菜水制備[4]。 考慮到阿米巴蟲種來源的實(shí)際環(huán)境，我們實(shí)驗(yàn)室青菜水培養(yǎng)液的制備是將小白菜葉與田野采集的野菜(面條菜、馬蘭頭、苦菜等)分別洗凈，加入適量自來水于燒杯中煮沸5～8 min , 冷卻后過濾。再將小白菜葉水與野菜水按6∶4的比例裝入無菌玻璃瓶中，4 ℃冰箱保存使用。

1.2.3 蟲種的保存和復(fù)蘇

將實(shí)驗(yàn)教學(xué)所用的培養(yǎng)自然界生活阿米巴原蟲的培養(yǎng)皿用PBS液洗滌2次，倒掉上清液，試管加蓋，4 ℃冰箱保存。再次復(fù)蘇時(shí)直接加入相應(yīng)培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)48 h換液傳代即可。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 3種培養(yǎng)液對(duì)原蟲生長的影響

1)稻草來源的原蟲初次培養(yǎng)約15～23 h可見到包囊期原蟲。 1640細(xì)胞培養(yǎng)液使用加入2%的小牛血清，原蟲在培養(yǎng)時(shí)使用6孔培養(yǎng)板在生物安全柜中進(jìn)行操作；青菜水培養(yǎng)液和洛氏培養(yǎng)液同法制備后4 ℃無菌保存。當(dāng)季稻草在 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)約18 h后可以發(fā)現(xiàn)包囊期原蟲，低倍鏡下原蟲多為圓形透明，包核明顯(圖1a)；當(dāng)季稻草在洛氏培養(yǎng)液中約22 h后可以發(fā)現(xiàn)包囊期原蟲，原蟲多為橢圓形，包核不明顯(圖1b)；當(dāng)季稻草在青菜水培養(yǎng)液中培養(yǎng)約16 h后可以發(fā)現(xiàn)包囊期原蟲，包囊期原蟲多為橢圓形，較其他2種培養(yǎng)液中的原蟲大，內(nèi)有明顯的空泡(圖1c)。

2)分別加入3種培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)后,顯微鏡下可觀察包囊開始漲大,出現(xiàn)亮黃色的生物折光,囊壁變薄、內(nèi)呈空泡可見胞核。繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h后可見活動(dòng)的含吞噬物的滋養(yǎng)體。1640培養(yǎng)液中原蟲在200倍鏡下多為圓形透明，內(nèi)含少量吞噬物，運(yùn)動(dòng)緩慢(圖2a)；洛氏培養(yǎng)液中原蟲多為指狀偽足，吞噬物較多，呈不定向運(yùn)動(dòng)(圖2b)；青菜水培養(yǎng)液中原蟲多為橢圓形，吞噬物呈塊狀，運(yùn)動(dòng)活潑(圖2c)。

2.2 3種培養(yǎng)液中原蟲不同生長階段培養(yǎng)所需時(shí)間的比較

3種培養(yǎng)液中原蟲不同生長階段培養(yǎng)所需時(shí)間的比較結(jié)果見表1。

表1 3種培養(yǎng)液中原蟲不同生長階段培養(yǎng)所需的時(shí)間(±s, n=20)

注:1640培養(yǎng)液、青菜水培養(yǎng)液在包囊期培養(yǎng)所需時(shí)間分別與洛氏培養(yǎng)液比較，◆P均小于0.05；1640培養(yǎng)液、青菜水培養(yǎng)液在滋養(yǎng)體期培養(yǎng)所需時(shí)間分別與洛氏培養(yǎng)液比較，◆◆P均小于0.01。

2.3 3種培養(yǎng)液對(duì)原蟲保存與復(fù)蘇的影響

原蟲的保存有2種方法，4 ℃冰箱保存和-20℃以下的冰凍保存，教學(xué)使用的醫(yī)學(xué)原蟲一般采用4 ℃冰箱保存。本次分別觀察了3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月和24個(gè)月保存后原蟲復(fù)蘇的成活率。由于教學(xué)中原蟲使用周期為3～6個(gè)月，因此重點(diǎn)對(duì)3個(gè)月和6個(gè)月的原蟲復(fù)蘇成活率進(jìn)行比較分析。3個(gè)月1640培養(yǎng)液中原蟲復(fù)蘇成活率為(90±2.1)%，青菜水培養(yǎng)液為(92±0.31)%，洛氏培養(yǎng)液為(91±0.12)%。1640培養(yǎng)液、青菜水培養(yǎng)液分別與洛氏培養(yǎng)液的原蟲復(fù)蘇成活率比較無顯著性差別，P>0.05。6個(gè)月1640培養(yǎng)液原蟲復(fù)蘇成活率為(78±1.26)%，青菜水培養(yǎng)液為(88±0.36)%，洛氏培養(yǎng)液為(62±2.21)%。1640培養(yǎng)液、青菜水培養(yǎng)液分別與洛氏培養(yǎng)液的原蟲復(fù)蘇成活率比較有顯著性差別，P<0.01。原蟲復(fù)蘇成活率比較結(jié)果如圖1所示。

3 討論

湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室承擔(dān)了臨床醫(yī)學(xué)、護(hù)理學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等專業(yè)的人體寄生蟲學(xué)課程的實(shí)驗(yàn)教學(xué)任務(wù)，醫(yī)學(xué)原蟲部分占該課程1/4的學(xué)時(shí)，以往實(shí)踐性教學(xué)環(huán)節(jié)一直是從醫(yī)院中尋找病人樣本用于教學(xué)。受樣本數(shù)量及保存條件的影響，該章節(jié)的實(shí)踐教學(xué)僅限于原蟲的形態(tài)學(xué)觀察，原蟲包囊期和滋養(yǎng)體期很少見到，嚴(yán)重影響實(shí)踐教學(xué)效果。在2013年初，本實(shí)驗(yàn)室通過自然界土壤分離到福氏耐格里阿米巴原蟲用于教學(xué)[5]，由于該方法存在致病性風(fēng)險(xiǎn)，缺乏安全保障，且冰凍保存后復(fù)蘇成活率低，不太適用于教學(xué)。于是從2013年9月開始，分別采用3種培養(yǎng)液對(duì)當(dāng)季小段稻草進(jìn)行分離培養(yǎng)試驗(yàn)，成功培養(yǎng)出了非致病性阿米巴原蟲，其包囊期原蟲在4 ℃冰箱可以保存3個(gè)月以上，經(jīng)過后期大量的培養(yǎng)，非致病性阿米巴原蟲的運(yùn)動(dòng)狀況、原蟲包囊期的染色鑒定和原蟲滋養(yǎng)體期的吞噬現(xiàn)象都可以讓學(xué)生進(jìn)行實(shí)際操作，學(xué)生切身了解接近了自然，提高了學(xué)生的動(dòng)手操作能力和學(xué)習(xí)興趣，非常適合不同學(xué)期中人體寄生蟲學(xué)課程實(shí)踐教學(xué)的開展。

從3種培養(yǎng)液分離原蟲結(jié)果來看，青菜水培養(yǎng)液可作為培養(yǎng)無致病性阿米巴原蟲的首選。雖然洛氏培養(yǎng)液也被很多實(shí)驗(yàn)室使用，但其培養(yǎng)結(jié)果顯示，包囊期原蟲培養(yǎng)時(shí)間、滋養(yǎng)體期原蟲的吞噬現(xiàn)象和原蟲的保存復(fù)活率都與本實(shí)驗(yàn)室自制青菜水培養(yǎng)液有顯著差別。1640培養(yǎng)方法分離的原蟲在運(yùn)動(dòng)、吞噬現(xiàn)象及保存復(fù)活率等方面與青菜水培養(yǎng)方法比較均存在很大不足，同時(shí)培養(yǎng)成本較高。

正因如此，本實(shí)驗(yàn)室已連續(xù)3年使用青菜水培養(yǎng)方法保存包囊階段的阿米巴原蟲并擴(kuò)大培養(yǎng)，這樣不僅為該課程實(shí)踐教學(xué)提供了理想的樣本，同時(shí)還降低了實(shí)驗(yàn)室購買耗材的成本。今后我們將進(jìn)一步創(chuàng)新青菜水培養(yǎng)方法擴(kuò)大培養(yǎng)，指導(dǎo)學(xué)生用阿米巴原蟲活體微培養(yǎng)技術(shù)[6]進(jìn)行實(shí)際操作，讓學(xué)生能更好地理解和掌握理論教學(xué)內(nèi)容。

[1] 盧艷，陳家旭，張永年,等.FTA-巢式PCR方法鑒定溶組織內(nèi)阿米巴原蟲的初步研究[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2016，32(2):128-132.

[2] 張小萍，何艷燕，王真瑜,等.上海市綜合性醫(yī)院腹瀉患者中溶組織內(nèi)阿米巴感染現(xiàn)狀調(diào)查[J].中國血吸蟲病防治雜志,2015，27(6):600-603.

[3] GS Visvesvara,H Moura，F(xiàn)L Schuster.Pathogenic and opportunistic free-living amoebae:Acanthamoeba spp.,Balamuthia mandrillaris,Naegleria fowleri,and Sappinia diploidea[J].Fems Immunology & Medical Microbiology,2011,50(1):707-713.

[4] Gianinazzi C,Schild M,Wüthrich F,et al.Potentially human pathogenic Acanthamoeba isolated from a heated indoor swimming pool in Switzerland[J].Experimental Parasitology,2009,121(2)：180-186.

[5] 彭恒，朱淮民.致病性自由生活阿米巴的培養(yǎng)[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2009，27(4):361-363.

[6] 陳洪友,姜慶五,李勤學(xué),等.阿米巴活體微培養(yǎng)法[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2005，23(6):453-455.

(責(zé)任編輯 吳鴻霞)

Screening and Evaluation of Amoeba Cultivation for Teaching and Experiment

YangXifeng1,LiZhongjuan1,YuFuheng2*,LiMo1

(1School of Medicine,Hubei Polytechnic University,Huangshi Hubei 435003;2Huangshi Dong Fang Community Service Center,Huangshi Hubei 435000)

Objective： To establish a sound,easy and economic culturing system for the cultivation of amoeba protozoa from natural sources in order to meet the need for protozoa experimental teaching of hospitals.Methods:Amoeba protozoa were cultured with 1640 cell culture media,Rockwell culture medium and vegetables water culture medium respectively.Growth status,development times of cysts and trophozoites and the survival rate at different recovering time were compared among the 3 groups.Results:The cysts stage time for amoeba protozoa culture with vegetables water culture medium and 1640 cell culture medium were (16±0.35) h and (18±0.50) h which had significant difference(P<0.05)from that with Rockwell culture medium,(22±1.2) h.The nourish body stage time for amoeba protozoa culture with vegetables water culture medium and 1640 cell culture medium were (22±2.24) h and (26±3.45) h,which also had extremely significant difference(P<0.01) from that with Rockwell culture medium(30±2.5) h.Recovering survival rate for amoeba protozoa culture with vegetables water culture medium and 1 640 cell culture medium after 6 months were as high as 88% and 78%, which had extremely significant difference(P<0.01) from that with Rockwell culture medium,62%.Conclusion:The culture time of amoeba protozoa from natural sources with vegetables water culture medium is short and its recovering survival rate is high.So,vegetables water culture medium can be used as a preferred medium for the culture of amoeba protozoa from natural sources and can be a substitute for the test sample of Human Parasitology teaching practice.

experimental teaching；protozoa；culture medium；amoeba protozoa

2017-02-10

楊細(xì)鳳,實(shí)驗(yàn)師,本科。

10.3969/j.issn.2095-4565.2017.02.013

R382.1

A

2095-4565(2017)02-0059-04

*通訊作者:余福恒,主管技師，本科。