羅生金

利用FecB多胎基因?qū)肱嘤_克羊多羔類(lèi)型的研究

羅生金

（新疆哈密地區(qū)畜牧工作站，新疆 哈密 839000）

以小尾寒羊和湖羊及寒哈F1羊、湖哈F1羊、橫交F2羊共計(jì)296只，用FecB基因?yàn)楹蜻x基因,采用PCR-RFLP方法檢測(cè)湖（寒）哈雜交F1及橫交F2羊群中存在3種基因型：BB型、B+型、++型。雜交F1代166只含等位基因B頻率為0.58，含等位基因+頻率為0.42；橫交F2代檢測(cè)64只含等位基因B頻率為0.41，含等位基因+頻率為0.59。對(duì)FecB 基因在 4 個(gè)不同類(lèi)型綿羊中分布差異的卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)，結(jié)果表明：小尾寒羊、湖羊與湖（寒）哈雜交F1及橫交F2兩個(gè)類(lèi)型綿羊相互之間分布差異極顯著（P0.01），湖羊與小尾寒羊之間分布差異不顯著（P>0.05）。 湖（寒）哈雜交及橫交F2羊基因型頻率差異不顯著（P>0.05）。說(shuō)明含F(xiàn)ecB基因羊與哈薩克母羊雜交后，F(xiàn)ecB基因顯性效果好，遺傳性能較為穩(wěn)定。對(duì)F1羊跟蹤調(diào)查，41只母羊產(chǎn)羔率為159%（64/41）,繁殖成活率為146%（60/41），其中BB基因型1只產(chǎn)羔2只，產(chǎn)羔率為200%；B+基因型29只產(chǎn)羔50只，產(chǎn)羔率為172%；++基因型11只產(chǎn)羔12只，產(chǎn)羔率為109%；B+基因型與野生型（++）相比較提高了63個(gè)百分點(diǎn)，差異極顯著(P0.01)。進(jìn)一步說(shuō)明FecB基因是高繁殖率主效基因，可有效提高F1羊產(chǎn)羔數(shù)。

綿羊；FecB基因；PCR- RFLP；產(chǎn)羔數(shù)

在國(guó)外采用分子標(biāo)記育種技術(shù)開(kāi)展新品種（品系）培育已取得突破性進(jìn)展。1919年澳大利亞的B Seear從新南威爾士州毛用型美利奴羊群中選出一只高繁殖力母羊，到1959年B Seear的羊群已經(jīng)具有很高的繁殖力，平均產(chǎn)羔1.94只，育成了多胎的Booroola Merino高產(chǎn)群[1]。Wilion等[2]發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生BMPR-IB基因編碼區(qū)發(fā)生一處突變（A746G），導(dǎo)致了該受體激酶結(jié)構(gòu)域的第249位氨基酸由谷氨酰胺突變?yōu)榫彼幔≦→R），揭示了Booroola Merino綿羊排卵數(shù)增加的原因。1989年該基因被綿、山羊遺傳命名委員會(huì)正式定名為FecB 基因。在我國(guó)，王根林等[3]利用限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR 技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)湖羊和小尾寒羊存在FecB 基因，與Booroola Merino綿羊的多胎主效基因FecB的表現(xiàn)型基本相同。兩者產(chǎn)羔率分別為228.92%和270.00%。柳淑芳等[4]利用FecB基因?qū)?guó)內(nèi)多胎品種進(jìn)行基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析，進(jìn)一步確認(rèn)了我國(guó)的湖羊、小尾寒羊等少數(shù)品種攜帶有多胎性能主基因。

自2012年實(shí)施的自治區(qū)高技術(shù)項(xiàng)目“新疆

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

綿羊血樣、1.5 mL離心管、采用酚-氯仿法提取綿羊基因組DNA、超純水、PCR引物、限制性?xún)?nèi)切酶AvaⅡ、瓊脂糖、高速離心機(jī)、恒溫?fù)u床、PCR儀、電泳槽、電泳儀、凝膠自動(dòng)成像儀、自動(dòng)滅菌鍋、電子天平、干熱滅菌箱、移液槍。

1.2 試驗(yàn)步驟

綿羊多胎主效基因FecB基因，通過(guò)PCRRFLP法進(jìn)行檢測(cè)。分為3步：第1步，提取綿羊基因組DNA，通過(guò)酚－氯仿法從綿羊全血或者組織提取DNA；第2步，進(jìn)行PCR擴(kuò)增FecB基因特異片段，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增包含突變位點(diǎn)的片段；第3步，PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切和結(jié)果判定。根據(jù)突變位點(diǎn)選擇特異性限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)電泳凝膠上DNA片段大小不同判定結(jié)果。檢測(cè)過(guò)程中，需要添加陰陽(yáng)性對(duì)照以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.1 綿羊DNA提取

將1ml抗凝血轉(zhuǎn)移至1.5 ml Eppendorf管；10 000 r/min離心10 min；棄去上清。加入1 ml紅細(xì)胞裂解液；充分混勻，棄去上清液；10 000 r/min離心10 min，重復(fù)上述步驟至上清液透明、沉淀呈淡白色。加入白細(xì)胞裂解液500 μl，加蛋白酶 κ至12μL（20 mg/ml）并混勻；RNase A 12μl（2mg/ ml）55 ℃過(guò)夜，顛倒混勻2次。將反應(yīng)液冷卻至室溫；加 Tris-飽和酚 600μL；溫和搖動(dòng)離心管10 min使其充分混勻； 10 000 r/min離心 10 min；將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5 ml離心管中。加1∶1的Tris-飽和酚/氯仿 600μL；充分混勻 10 min；10 000 r/min 離心 10 min；將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5 ml離心管中。加氯仿600μL ；充分混勻10 min；10 000 r/min離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5 ml離心管中。加 2倍體積的冰冷的無(wú)水乙醇，混合轉(zhuǎn)動(dòng)離心管直至白色的絮狀沉淀析出；-20 ℃保存 20 min。13 000 r/min 離心10 min；棄去上清液，用70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀1次。3 000 r/min離心2 min；棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。干燥后的DNA溶于50～100μL的水中；4℃保存直至DNA完全溶解, -20 ℃保存。

1.2.2 FecB基因的PCR擴(kuò)增

20μl反應(yīng)體系組成：TAQ DNA聚合酶（5 u/μl）0.12μl，10×PCR緩沖液2μl，MgCl2（25 mmol/L）2μl，DNTP（2.5mmoL/L）2μl，基因組DNA（稀釋后）1μl（50 ng左右），上游引物（10 pmol/ml）1.0μl，下游引物（10 pmol/ml）1.0μl，加水至 20μl。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)

用1×TAE電泳緩沖液配制2%的瓊脂糖凝膠（含0.5μg/ml EB）。取PCR產(chǎn)物4μl，混合1μl 5×Loading Buffer上樣，以50 bp PCR Maker進(jìn)行分子量對(duì)照。以1×TAE電泳緩沖液，電泳55 V（5V/cm）40 min。

凝膠自動(dòng)成像儀或紫外透射儀下觀(guān)察結(jié)果，檢測(cè)目的條帶純度及亮度。

1.2.4 酶切反應(yīng)體系

AvaⅡ0.4μl，10×M Buffer 2μl，滅菌水10μl，PCR產(chǎn)物 8μl，總量 20μl，37℃水浴4 h。

1.2.5 酶切產(chǎn)物的檢測(cè)

用1×TAE電泳緩沖液配制3.3%的瓊脂糖凝膠（含0.5μg/ml EB）。取酶切產(chǎn)物10μl，混合1μl 5×Loading Buffer上樣，以50 bp PCR Maker進(jìn)行分子量對(duì)照。以1×TAE電泳緩沖液，電泳55 V（5V/cm）40 min。

凝膠自動(dòng)成像儀或紫外透射儀下觀(guān)察結(jié)果，檢測(cè)目的條帶純度及亮度。

1.3 分析

1.3.1 PCR產(chǎn)物分析

對(duì)綿羊基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)140 bp 的特異性條帶。

圖1 綿羊FecB基因PCR結(jié)果（1-21為PCR擴(kuò)增條帶，M為50 bp的DNA Marker）

1.3.2 酶切產(chǎn)物分析

用AvaⅡ內(nèi)切酶對(duì)BMPR突變引物所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物（140 bp）進(jìn)行酶切，用瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。電泳后顯色結(jié)果清晰，突變純合子只有110 bp帶，突變雜合子有兩條帶（140 bp、110 bp)，野生型的只有140 bp的帶。

圖2 綿羊FecB基因PCR-RFLP結(jié)果

1.4 育種技術(shù)方案

含F(xiàn)ecB純合子小尾寒羊（湖羊）種公羊10只與 哈薩克羊500只，進(jìn)行雜交選配。按一定比例對(duì)母羔采血進(jìn)行多胎基因測(cè)定，初步建立了F1代、F2代公、母后備羊群，做好數(shù)據(jù)整理。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0、Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因子方差分析進(jìn)行平均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算，并進(jìn)行Duncan氏多重比較檢驗(yàn)。結(jié)果用平均值(X)±標(biāo)準(zhǔn)差(S)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 FecB基因在雜交類(lèi)群中分布統(tǒng)計(jì)分析

在湖（寒）哈雜交F1及橫交F2羊群中存在3種基因型：BB型、B+型、++型。雜交F1代166只含等位基因B頻率為0.58，含等位基因+頻率為0.42；橫交F2代檢測(cè)64只含等位基因B頻率為0.41，含等位基因+頻率為0.59。對(duì)FecB基因在 4 個(gè)不同類(lèi)型綿羊中分布差異的卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)（表 2）。由表2可知，小尾寒羊、湖羊與湖（寒）哈雜交F1及橫交F2兩個(gè)類(lèi)型綿羊相互之間分布差異極顯著（P0.01）；湖羊與小尾寒羊之間分布差異不顯著（P>0.05）；湖（寒）哈雜交及橫交F2羊基因型頻率差異不顯著（P>0.05）。說(shuō)明含F(xiàn)ecB基因羊與哈薩克母羊雜交后，F(xiàn)ecB基因顯性效果好，遺傳性能較為穩(wěn)定。

表1 成羊及雜交羔羊FecB基因頻率和基因型頻率分布

表2 不同綿羊群體之間基因型分布差異檢驗(yàn)

2.2 橫交固定FecB基因?qū)Τ醍a(chǎn)母羊產(chǎn)羔數(shù)的影響

應(yīng)用FecB基因標(biāo)記技術(shù)提高產(chǎn)羔率，選擇5只F1代理想型B+基因型公羊與無(wú)親緣關(guān)系的攜帶不同基因型母羊136只配種，對(duì)41只母羊產(chǎn)羔情況跟蹤觀(guān)察。由表3可知，41只母羊產(chǎn)羔64只，產(chǎn)羔率為156%，其中BB基因型1只產(chǎn)羔2只，產(chǎn)羔率為200%；B+基因型29只產(chǎn)羔50只，產(chǎn)羔率為172%；++基因型11只產(chǎn)羔12只，產(chǎn)羔率為109%；B+基因型與野生型（++）相比較提高了63個(gè)百分點(diǎn)，差異極顯著(P0.01)。以上研究表明，多胎基因FecB分子標(biāo)記技術(shù)，可有效提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)。因此，在開(kāi)展橫交固定及選育過(guò)程中，應(yīng)優(yōu)先選擇攜帶多胎基因的公、母羊配種，以利于增加哈薩克羊新類(lèi)型的多胎型。

2.3 哈薩克羊新類(lèi)型繁殖性能

表3 橫交組合FecB基因型對(duì)初產(chǎn)母羊產(chǎn)羔率的影響

表4 橫交組合F1代羔羊成活情況

3 討論與小結(jié)

3.1 據(jù)文獻(xiàn)記載，綿羊多胎基因（FecB）的位點(diǎn)被定位在第6號(hào)染色體上，F(xiàn)ecB基因是綿羊高繁殖力BMPR-IB基因突變的結(jié)果，具有提高排卵和產(chǎn)羔的生物學(xué)作用。本實(shí)驗(yàn)選用10只FecB中基因突變BB基因公羊與本地哈薩克母羊配種。檢測(cè)結(jié)果表明：含F(xiàn)ecB基因羊與哈薩克母羊雜交后，F(xiàn)ecB基因顯性效果好，遺傳性能較為穩(wěn)定，導(dǎo)入效果十分顯著。

3.2 哈薩克多胎新類(lèi)型創(chuàng)制項(xiàng)目采用小尾寒羊或湖羊種公羊與哈薩克羊雜交選育。研究數(shù)據(jù)表明：不同基因型羔羊初生重、6月齡體重、育成羊體尺差異不顯著（P>0.05）[9]。在體型外貌、生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖性能等方面有了不同的提高。建立在較好的營(yíng)養(yǎng)條件下，精細(xì)管理才能充分發(fā)揮各個(gè)方面的性能，而在低營(yíng)養(yǎng)及粗放管理狀態(tài)常常表現(xiàn)為生長(zhǎng)速度緩慢、異食癖從而導(dǎo)致抗病力差等問(wèn)題，選育時(shí)值得注意。

3.3 采用多胎基因FecB分子標(biāo)記技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)，組建理想型育種群。通過(guò)選育選配、橫交固定，初步培育出了哈薩克羊多胎新類(lèi)型。數(shù)據(jù)顯示該類(lèi)型羊具有較高繁殖力，在今后的新類(lèi)型培育中值得推廣。

哈薩克羊?qū)偌竟?jié)性發(fā)情。對(duì)湖（寒）哈雜交羊F1母羊跟蹤調(diào)查，41只F1母羊在春季發(fā)情配種，秋季正常產(chǎn)羔，產(chǎn)羔率為159%（64/41），繁殖成活率為146%（60/41）。初產(chǎn)母羊配種年齡較小，存在奶水不足等問(wèn)題，導(dǎo)致羔羊死亡，繁殖成活率有所下降。

[ 1 ]Souza C J, Macdougall C, Campbell B K, et al.The Booroola (FecB)phenotype is associated with a mutationin Bone morpho genetic receptor typeIB(BMPR1B)gene[ J] .En Docrinol, 2001, 169(2):1-6.

[ 2 ]Wilson T,Wu J L,et al.Highly prolific Booroola sheep have a mutation in the intracellular kinasedomain of bone morphogenetic protein IB receptor(ALK-6)that is expressed in both oocyes and granuloss cells [J] Biology of Reproduction,2001,64:1225-1235.

[ 3 ]王根林, 毛鑫智, Davis GH，等.DNA 分析發(fā)現(xiàn)我國(guó)湖羊和小尾寒羊存在Booroola(FecB)多胎基因[J] . 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 26(1):104-106.

[ 4 ]柳淑芳，姜運(yùn)良，杜立新.BM PR-IB 和BM P15 基因作為小尾寒羊多胎性能候選基因的研究[ J] .遺傳學(xué)報(bào), 2003, 30(8):755-760.

[ 5 ]儲(chǔ)明星，狄冉，葉素成，等.綿羊多胎主效基因FecB分子檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào).2009,17（1）:52-58.

[ 6 ]王鈞. 5個(gè)綿羊品種BMPR-IB基因多態(tài)性的研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2013.

[ 7 ]李達(dá)，孫偉，倪榮，等.綿羊FecB基因遺傳多樣性及其產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析[J].畜牧獸醫(yī)雜志.2012,31（2）:1-8.

[ 8 ]陳曉勇，敦偉濤，田樹(shù)軍，等.FecB基因?qū)d羊生產(chǎn)性能影響的研究進(jìn)展[J].中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué).2012,32（4）:59-63.

[ 9 ]馬春江，羅生金.綿羊BMPR-IB基因標(biāo)記導(dǎo)入哈薩克羊生長(zhǎng)狀態(tài)研究[J].畜牧與獸醫(yī).2015,47（6）:52-58.

[10]鐘發(fā)剛，王新華，李輝，等.BMPR-IB基因作為多胎性能的候選基因在肉羊多胎品種培育中的應(yīng)用研究[J].中國(guó)草食動(dòng)物.2005,25（4）:6-7.

S826.3

A

1005-2739（2017）02-0007-05地方綿羊品種多胎性類(lèi)型創(chuàng)制”的子課題“哈薩克羊多胎新類(lèi)型創(chuàng)制”，育種方法是用含F(xiàn)ecB基因純合子的湖（寒）羊公羊與本地哈薩克母羊雜交，采用PCR-RFLP方法對(duì)BMPR-BI基因進(jìn)行檢測(cè)，選育哈薩克羊多胎新類(lèi)型。本課題研究FecB基因?qū)Ξa(chǎn)羔數(shù)的影響，旨在尋找與產(chǎn)羔相關(guān)的遺傳標(biāo)記，為選育哈薩克羊多胎新類(lèi)型提供理論依據(jù)。

2016-11-03

新疆維吾爾自治區(qū)科技廳高技術(shù)項(xiàng)目（新疆地方綿羊品種多胎類(lèi)型創(chuàng)制，項(xiàng)目編號(hào)：2013110101）

羅生金（1973-），男，碩士，高級(jí)獸醫(yī)師，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師。

E-mail:1491693158@qq.com