張 靜 李海娜 李麗娜 范盎然 于 雪 劉保秀 王萍萍 暢洪昇

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京，100102； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

培元解郁方對急性應(yīng)激BALB/c小鼠的抗抑郁作用及TRP-KYN代謝途徑的調(diào)節(jié)

張 靜1李海娜1李麗娜2范盎然2于 雪2劉保秀1王萍萍1暢洪昇1

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京，100102； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

目的：研究培元解郁方的抗抑郁作用及其對色氨酸(Tryptophan，TRP)-犬尿氨酸(Kynurenine，KYN)途徑的調(diào)節(jié)。方法：急性應(yīng)激造成小鼠抑郁模型，采用Noldus EthoVision XT9系統(tǒng)采集分析小鼠強迫游泳不動時間，采用HPLC-MS/MS技術(shù)檢測腦組織色氨酸、犬尿氨酸含量，實時熒光定量PCR檢測肝組織中色氨酸2,3-雙加氧酶(Tryptophan 2,3-dioxygenaes，TDO)的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：急性應(yīng)激可以引起小鼠不動時間延長，肝組織TDO活性增高，TDO mRNA表達(dá)增多。天絲飲、培元解郁方能縮短小鼠不動時間(P<0.05)，降低TDOmRNA表達(dá)數(shù)量，天絲飲尚有明顯的抑制喹啉酸(Quinolinic acid，Q)作用。結(jié)論：天絲飲、培元解郁方具有抗抑郁藥物樣作用，這一作用可能與減少急性應(yīng)激后血清皮質(zhì)酮(Corticosterone，C)的含量，降低TDOmRNA的表達(dá)有關(guān)；天絲飲表現(xiàn)出明顯的抑制神經(jīng)毒性的作用可能與調(diào)節(jié)KYN代謝產(chǎn)物有關(guān)。

培元解郁方；抗抑郁；TRP-KYN代謝途徑

四逆散出自《傷寒論》，是經(jīng)典的疏肝解郁祖方[1]。四逆散的抗抑郁作用可能與5-HT能神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)、海馬神經(jīng)元發(fā)生等有關(guān)[2]，并有補腎元、定神志的功效。有研究表明，天絲飲中巴戟天有效成分是巴戟天寡糖，有較好的抗抑郁作用，具有與氟西汀相似的效應(yīng)[3-4]。本實驗將四逆散、天絲飲進(jìn)行合方，組成培元解郁方，采用急性應(yīng)激BALB/c小鼠抑郁模型，對三方的抗抑郁作用進(jìn)行了觀察，并就其對TRY-KYN代謝途徑及其關(guān)鍵TDO含量的影響進(jìn)行了研究，以明確3者的抗抑郁效應(yīng)和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性BALB/C小鼠50只，體質(zhì)量22～25 g，購自北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司，許可證編號：SCXK(京)2011-0004。

1.1.2 藥物 丙咪嗪(批號：20140302A)，由上海信誼九福藥業(yè)有限公司提供。培元解郁方由制巴戟天(批號：15001781)、炙甘草(批號：13002752)、北柴胡(批號：13002303)、鹽菟絲子(批號：15004252)、白芍(批號：13002773)、麩炒枳實(批號：120601)組成。天絲飲配方顆粒由制巴戟天、鹽菟絲子組成。四逆散配方顆粒由柴胡、白芍、炙甘草、枳實組成。上述藥材顆粒均由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供。

1.1.3 試劑與儀器 皮質(zhì)酮(Corticosterone，貨號C0388，TCI)，DL-犬尿氨酸(貨號61250，Sigma)，犬尿喹啉酸(貨號K3375，Sigma)，喹啉酸(貨號A11414，Alfa Aesar)，色氨酸(貨號T103480，Aladdin)，5-HT(貨號111656-200401，中檢所)，甲醇、已腈等均購自Fisher公司。TRIZOL REAGENT(貨號15596026，invitrogen)，SYBR Green PCR Mixture試劑盒(貨號CW0957A)，HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號CW0744)，均由Cwbio公司提供。

HPLC-MS/MS(美國戴安Ultimate3000-美國ABI公司3200 Q TRAP)，Noldus EthoVision XT9(荷蘭Noldus公司)，熒光定量PCR儀(美國CFX96)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將小鼠分為5組，每組10只：模型組、天絲飲組、四逆散組、培元解郁組和丙咪嗪組。將小鼠置于高度25 cm，直徑10 cm，水深10 cm的玻璃缸中，水溫25 ℃，每缸一只，實驗數(shù)據(jù)通過Noldus EthoVision XT9采集。

1.2.2 給藥方法 急性模型于強迫游泳前4 h灌胃給藥，隨即進(jìn)行強迫游泳試驗。給藥劑量參照前期實驗[5-6]，天絲飲的給藥量為1.5 g/kg，四逆散的給藥量為0.8 g/kg，培元解郁給藥量為2.3 g/kg，丙咪嗪給藥量為50 mg/kg。急性應(yīng)激小鼠于末次應(yīng)激后進(jìn)行行為學(xué)檢測，并取材，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 血清TRP、犬尿氨酸(Kynurenine，KYN)、犬尿烯酸(Kynurenic Acid，KA)、喹啉酸(Quinolinicacid，Q)、皮質(zhì)酮(Corticosterone，C)含量的檢測 摘眼球取血，靜置于4 ℃冰箱，等待凝血后，置于離心機內(nèi)，4 ℃、2 500 r/min離心15 min，取上清液100 μL置于-20 ℃凍存。用HPLC-MS/MS檢測KYN、TRP、KA、Q、C含量，以血清TRP/KYN比值表示TDO活性，KYN/KA反映神經(jīng)保護(hù)作用，KYN/Q比值反映神經(jīng)毒性作用。

液相條件：色譜柱SLab HP-C18(150×4.6 mm 5 μm)，流動相A水相：水，B有機相：乙腈，進(jìn)樣量：20 μL，柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min。梯度洗脫：0～1 min，流動相B體積分?jǐn)?shù)95%；1～8 min，流動相B體積分?jǐn)?shù)95%～40%；8～8.1 min，流動相B體積分?jǐn)?shù)40%～0%；8.1～10 min，流動相B體積分?jǐn)?shù)0%；10～10.1 min，流動相B體積分?jǐn)?shù)0%～95%；0.1～15 min，流動相B體積分?jǐn)?shù)95%[5]。質(zhì)譜條件：掃描方式：MRM多反應(yīng)監(jiān)測；離子源：+ESI電噴霧離子源，正離子方式；TEM:500 ℃(霧化溫度)；EP:10(射入電壓)；IS：+5 500V(噴霧電壓)；CXP:2.0(碰撞室射出電壓)；GS1:55 psi(霧化氣)；CAD：Medium(碰撞氣)；GS2：60 psi(輔助氣)；CUR：20 psi(氣簾氣)。

肝TDO含量檢測:將肝臟置于液氮內(nèi)速凍，采用一步法抽提肝臟總RNA，取1 μL的RNA用1%的瓊脂糖凝膠測電泳，最后用試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，此過程產(chǎn)品說明書進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄后采用熒光定量PCR方法檢測其含量，用SYBR PCR Mixture進(jìn)行擴增。目的基因引物序列：TDO F為AAGGATTCAGGCTAAAACCGACT，TDO R為TGCACGGTATGACAGTCGTC，擴增產(chǎn)物的大小為146 bp，最后用2-△△ct的方法對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析。

2 結(jié)果

2.1 對強迫游泳不動時間的影響 在強迫游泳實驗中，丙咪嗪、天絲飲、培元解郁方均能縮短小鼠急性應(yīng)激不動時間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 對小鼠強迫游泳行為的影響±s，例數(shù)=10)

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。

表2 對血清皮質(zhì)酮含量的影響±s，例數(shù)=8)

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。

表3 對TRP-KYN代謝產(chǎn)物的影響，例數(shù)=8)

注：與模型組相比，**P<0.01。

2.2 對TRP-KYN代謝產(chǎn)物及血清皮質(zhì)酮含量的影響 丙咪嗪、天絲飲、培元解郁組均能減少急性應(yīng)激后血清皮質(zhì)酮的含量。治療各組對KYN/TRP、KYN/KA比值無明顯影響，天絲飲能提高KYN/Q比值，表現(xiàn)出抑制喹啉酸作用，與模型組比較，P<0.05。見表2、表3。

2.3 對肝臟TDOmRNA表達(dá)的影響 天絲飲、培元解郁均能降低TDOmRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 對TDOmRNA含量的影響，例數(shù)=8)

注：與模型組相比，*P<0.05。

3 討論

關(guān)于抗抑郁中藥復(fù)方的研究已經(jīng)有不少報道，大致包括：補益心脾、調(diào)和肝脾、化痰解郁、疏肝解郁、寧心安神、養(yǎng)陰降火、活血化瘀、補益肝腎等系列[5]。其中，如復(fù)方還少丹、滋水清肝飲、歸脾湯，單味中藥如巴戟天、刺五加、何首烏、淫羊藿、甘草等，很多補虛方藥具有確切的抗抑郁作用[7-9]。中醫(yī)郁證學(xué)說提出虛郁相關(guān)并重的治療思想，并強調(diào)培元解郁的治療方法[10]。本實驗基于上述基礎(chǔ)，對培元解郁方的抗抑郁作用和特點進(jìn)行了比較研究。

自從20世紀(jì)70年代，強迫游泳實驗作為一種簡便、快速、可信度高的動物模型，被廣泛應(yīng)用于抗抑郁藥的評價和篩選以及抑郁癥機制的研究中，小鼠被放置于一個相對局限的空間游泳，從不斷掙扎想要逃脫到漂浮不動放棄逃脫(即“行為絕望”)，在一定時間內(nèi)經(jīng)歷了這種類似于人類抑郁癥臨床表現(xiàn)的外顯行為。因此，本實驗采用急性應(yīng)激Balb/c小鼠抑郁模型，將Balb/c小鼠置于高度25 cm，直徑10 cm，水深10 cm的玻璃缸中，觀察小鼠6 min內(nèi)游泳情況，記錄下小鼠后4 cm內(nèi)的累計不動時間，水溫25 ℃時敏感性、可靠性最高[11]，可以作為評價抗抑郁藥效的有效模型。本試驗中，天絲飲與培元解郁方都能夠縮短小鼠急性應(yīng)激后累計不動時間，表現(xiàn)出較強的抗抑郁藥物作用，效應(yīng)與丙咪嗪相近。

抑郁癥的病因機制非常復(fù)雜，它的發(fā)病涉及到體內(nèi)多種系統(tǒng)的失衡，僅從一方面研究不能完整的闡明其發(fā)病機制[12-13]。研究表明，TRP-KYN代謝異常與抑郁癥發(fā)病的可能關(guān)聯(lián)如下：首先，犬尿氨酸的神經(jīng)元活性代謝產(chǎn)物增多，造成了N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)過度激活與自由基的產(chǎn)生，引起神經(jīng)元變性；其次，色氨酸耗竭，造成了5-HT能神經(jīng)元功能的障礙?，F(xiàn)已經(jīng)證實，以上機制參與了抑郁癥的發(fā)生，抗抑郁藥物新的研究熱點已經(jīng)轉(zhuǎn)向TRP-KYN代謝途徑以及相關(guān)代謝酶和代謝產(chǎn)物[14-15]。

色氨酸-犬尿氨酸代謝與應(yīng)激時激素變化有密切的關(guān)系，糖皮質(zhì)激素可以誘導(dǎo)TDO活性，從而改變TRP-KYN代謝。KYN可代謝產(chǎn)生KA，并進(jìn)一步生成Q，Q是NMDA激動劑，與抑郁癥的發(fā)生有直接的關(guān)系[16-19]。研究表明，選擇性NMDA受體拮抗劑，如MK-801、GMP、CGP37849等，能縮短懸尾試驗和強迫游泳實驗中小鼠的不動時間，產(chǎn)生抗抑郁作用。而NMDA受體激活可以產(chǎn)興奮性氨基酸毒性作用，損害海馬神經(jīng)元并加重氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生，其中KYN/Q的比值常用以間接評估其神經(jīng)毒性作用[20-23]。

本實驗中，天絲飲、培元解郁方均能減少急性應(yīng)激后血清皮質(zhì)酮的含量，降低TDO mRNA的表達(dá)量。結(jié)合前期試驗，抑制皮質(zhì)酮引起的TDO表達(dá)增加和5-HT降低，可能是天絲飲、培元解郁方抗急性應(yīng)激抑郁行為的機制。同時，天絲飲能夠提高KYN/Q比值，表現(xiàn)出抑制Q，抑制NMDA受體興奮性毒性的作用，其抗抑郁樣作用可能與此機制也有關(guān)。

總之，本實驗表明，對于急性強迫游泳應(yīng)激模型，天絲飲和培元解郁方均表現(xiàn)出一定的抗抑郁作用，機制與對抗糖皮質(zhì)激素引起的TDO活性增高有關(guān)，其中天絲飲在調(diào)節(jié)KYN-Q代謝方面有獨特的作用，其機制有待進(jìn)一步研究。

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(2016-02-23收稿 責(zé)任編輯：白樺)

Anti-depressant Effect of Peiyuan Jieyu Decoction and Its Regulation on TRP-KYN Metabolic Pathway on Acute Stress BALb/c in Mice

Zhang Jing1,Li Haina1,Li Li′na2,Fan Angran2,Yu Xue2,Liu Baoxiu1,Wang Pingping1,Chang Hongsheng1

(1SchoolofChinesePharmacy,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China; 2SchoolofPreclinicalMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To study the antidepressant effects of Peiyuan Jieyu Decoction and its regulation on the tryptophan-kynurenine (TRP-KYN)pathway. Methods:The mice model was established by acute stress. The immobility time in forced swimming test was acquired and analysed by Noldus EthoVision XT9 system. The content of tryptophan and kynurenine in brain tissue were detected by HPLC-MS/MS technique. The mRNA expression level of tryptophan 2,3-dioxygenaes (TDO) in liver tissue was detected by real-time PCR. Results:Acute stess induced prolong of immobility time of Balb/c mice (P<0.05). The TDO activity in liver tissue and the TDO mRNA expression level increased (P<0.01). Tiansi Decoction and Peiyuan Jieyu Decoction could shorten the immobility time of mice (P<0.05) and reduce the TDO mRNA expression. The inhibitory effect of Quinolinic acid by Tiansi Decoction was more significant. Conclusion:Tiansi Decoction and Peiyuan Jieyu Decoction has antidepressant effect. This effect may be related to the decrease of serum corticosterone levels after acute stress and the reduction of the TDO mRNA expression. Tiansi Decoction shows obvious inhibition to neurotoxins which may be related to the regulation of KYN metabolites.

Peiyuan Jieyu Decoction; Anti-depression; Tryptophan-Kynurenine (TRP-KYN) metabolic pathway

國家自然科學(xué)基金項目(編號：81373584)

張靜(1990.02—)，女，在讀研究生，研究方向：中藥藥效及作用機制研究,E-mall：yuan900214@126.com

暢洪昇(1971.10—)，男，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥效及作用機制研究，E-mail：chs1971@sina.com

R259;R-332

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.03.038