劉家軍 吳 松 李龍珠 敖金波

(1 湖北省十堰市中醫(yī)醫(yī)院消化科,十堰,442012; 2 十堰市太和醫(yī)院康復(fù)中心,十堰,442000)

丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對(duì)兔心肌缺血預(yù)處理后血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用

劉家軍1吳 松2李龍珠1敖金波2

(1 湖北省十堰市中醫(yī)醫(yī)院消化科,十堰,442012; 2 十堰市太和醫(yī)院康復(fù)中心,十堰,442000)

目的:通過建立兔急性心肌缺血/再灌注損傷動(dòng)物模型,觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌缺血預(yù)處理后血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用及其對(duì)兔心肌酶譜的影響,探討丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對(duì)心功能潛在的影響機(jī)制。方法:取24只健康兔隨機(jī)分為缺血/再灌注組、缺血預(yù)處理A組、缺血預(yù)處理B組,其中其中缺血預(yù)處理A組按2.5 mL/(kg·d)、缺血預(yù)處理B組按5 mL/(kg·d)耳緣靜脈注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液進(jìn)行缺血前預(yù)處理,缺血/再灌注組注射1 mL生理鹽水,預(yù)處理1周后3組動(dòng)物均采用手術(shù)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支30 min后復(fù)灌30 min,并反復(fù)缺血/再灌注3次的方法造成動(dòng)物急性心肌缺血/再灌注損傷動(dòng)物模,另取8只不做任何處理作為對(duì)照組。采用雙抗體夾心法測(cè)定兔缺血預(yù)處理前、后血清血管內(nèi)皮因子(Vsculr Endothelil Growthfctor,VEGF)及VEGFmRNA表達(dá);酶聯(lián)免疫吸附法檢驗(yàn)(ELIS)兔血清血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)及心肌丙二醛(MDA)。籍此評(píng)價(jià)丹參酮Ⅱ磺酸鈉注射液對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌缺血預(yù)處理后血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用及其對(duì)兔心肌酶譜的影響。結(jié)果:4組動(dòng)物在缺血預(yù)處理前各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),在使用丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液缺血預(yù)處理后能明顯增強(qiáng)缺血預(yù)處理A、B 2組兔VEGF及mRNA表達(dá),明顯提高缺血預(yù)處理A組、B 2組T-SOD、LDH及CK-MB酶的活性,降低2組動(dòng)物心肌酶譜的MD釋放,與缺血/再灌注組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。缺血預(yù)處理A組、B 2組組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。結(jié)論:心肌缺血/再灌注損傷兔在經(jīng)丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液缺血預(yù)處理后,明顯提高VEGF分泌及氧自由基清除酶的活性,加快缺血心肌血管內(nèi)皮新生,抑制心肌缺血/再灌注損傷時(shí)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而減輕心肌血管內(nèi)皮炎性反應(yīng),進(jìn)而改善缺血/再灌注損傷后受損血管內(nèi)皮功能,對(duì)兔急性心肌缺血/再灌注損傷有明確的保護(hù)作用。

丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液;心肌缺血/再灌注損傷預(yù)處理;血管內(nèi)皮生長因子;心肌酶譜

丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(Danshen ketone A Sulfonic Acid Sodium Injection)是從中草藥丹參塊莖中純化分離出的二萜醌類化合物經(jīng)磺化反應(yīng)而制成的滅菌注射液,主要藥理成份有丹參酮甲酯、丹參酚酸及丹參酮ⅡA等。中醫(yī)典籍《吳普本草》中記載其味辛性涼、具涼血消癰、活血通經(jīng)之功效[1],《本草便讀》謂丹參功同四物,能祛瘀以生新為調(diào)理血分之首藥[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)其中的丹參素及丹參酮ⅡA具有降低血液黏稠度、清除氧自由基,擴(kuò)張心肌血管、增加缺血心肌組織血液流量,抑制缺血區(qū)組織細(xì)胞內(nèi)鈣超載而發(fā)揮組織保護(hù)作用[3],對(duì)急性心肌缺血時(shí)可明顯擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈,增強(qiáng)心肌收縮力,提高機(jī)體耐缺氧能力的作用[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí),心肌缺血預(yù)處理可明顯提高心肌缺血患者對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的耐受性,減少嚴(yán)重不良事件發(fā)生。而丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對(duì)心肌缺血/再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用,但以往對(duì)丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液的研究多局限在離體實(shí)驗(yàn)或臨床應(yīng)用方面,而對(duì)整體動(dòng)物心肌缺血/再灌注損傷時(shí)血管再生及心肌酶譜的影響、特別是心肌缺血預(yù)處理的影響及作用機(jī)制卻鮮有研究,本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對(duì)心肌缺血預(yù)處理后血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用及其對(duì)兔心肌酶譜的影響,研究藥物作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供可靠實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與分組 取40只日本大耳白兔,體質(zhì)量(1.5～1.8)kg,隨機(jī)分為對(duì)照組、缺血/再灌注組、缺血預(yù)處理A、B組共4組。動(dòng)物房溫度18～25 ℃,濕度50%～75%,動(dòng)物分籠飼養(yǎng),自然光照,自由覓食飲水。

1.1.2 藥物 丹參酮ⅡA磺酸鈉(菏澤步長制藥有限公司,批號(hào)Z20027877)。

1.1.3 試劑與儀器 戊巴比妥鈉(Sodium Amytal,北京化學(xué)試劑公司,批號(hào)071222);T-SOD、LDH、CK-MB、MDA測(cè)試盒(上海信裕生物技技有限公司,批號(hào)XY-A003-1);大鼠組織因子(VEGF)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號(hào)ml068523),VEGFmRNA反轉(zhuǎn)錄試劑(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號(hào)ml074536);BL-420F生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟電子有限公司,型號(hào):BL-420F);小動(dòng)物呼吸機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,型號(hào):RWD407)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備與缺血預(yù)處理方法 在建立兔急性心肌缺血/再灌注損傷動(dòng)物模型動(dòng)物模型前,缺血預(yù)處理A組按2.5 mL/(kg·d)、缺血預(yù)處理B組按5 mL/(kg·d)耳緣靜脈注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液,1次/d,連續(xù)耳緣靜脈注射7 d,另2組耳緣靜脈注射等體積生理鹽水7 d。1周后缺血/再灌注組、缺血預(yù)處理A組,缺血預(yù)處理B組3組動(dòng)物[5],麻醉時(shí)用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射(1 mL/kg),固定時(shí)腹部向上并接肢導(dǎo)聯(lián)電極,兔Ⅱ?qū)?lián)心電圖采用BL-420F生物信號(hào)采集系統(tǒng)及軟件記錄。手術(shù)時(shí)用碘伏消毒兔胸部,接小動(dòng)物呼吸機(jī),于胸骨5～7肋開胸,暴露心臟后用眼科剪剪開心包,找到兔冠狀動(dòng)脈左側(cè)前降支后,在心臟上放一自制氣囊,用小園針從前降支下穿過并結(jié)扎絲線,然后用10 mL注射器向氣囊加壓,使氣囊壓迫前降支冠狀動(dòng)脈造成兔急性心肌缺血,30 min后放出氣囊減壓復(fù)灌30 min,這種3次缺血/再灌注的方法可造成動(dòng)物急性心肌缺血/再灌注損傷動(dòng)物模,一般在第1次缺血/再灌注均會(huì)出現(xiàn)明顯的T波高聳、ST段上抬及期前收縮等心律失常性心電圖即模型成功標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組不做任何手術(shù)處理,僅作為空白對(duì)照。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)與方法 4組兔分別于缺血預(yù)處理前及缺血預(yù)處理后經(jīng)耳緣靜脈取靜脈血(1 mL),在-30 ℃條件下暫存以備VEGF蛋白分析[6]。檢測(cè)時(shí)采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELIS)測(cè)定動(dòng)物VEGF蛋白表達(dá)的光密度(Opticl density,OD)OD值。取靜脈血標(biāo)本3 000 r/min離心30 min后取上清液(待測(cè)樣本),將標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本加入到預(yù)先包被的VEGF單克隆抗體透明酶標(biāo)包被板中,37 ℃溫育30 min,洗滌后再加入酶標(biāo)工作液,再于37 ℃下溫育30 min后洗滌除去未結(jié)合的成分,依次加入底物,用SP-Mx 3500FL型多功能熒光酶標(biāo)儀于450 nm波長下測(cè)定VEGF的OD值,FLK-1及HIF-1蛋白表達(dá)的OD值檢測(cè)時(shí)分別用FLK-1及HIF-1試劑盒檢測(cè),方法及步驟同VEGF。VEGF-mRNA測(cè)定方法[7]:4組兔VEGF-mRNA均采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Trnscription Polymerse Chin Rection,RT-PCR)進(jìn)行RNA提取后測(cè)定。兔靜脈血清T-SOD、CK-MB、LDH、MDA等采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELIS)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對(duì)兔血清缺血預(yù)處理后T-SOD、LDH活性的影響 4組動(dòng)物在缺血預(yù)處理前血清T-SOD及LDH活性比較(P>0.05),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組T-SOD、LDH活性在缺血預(yù)處理前后無明顯變化(P>0.05);缺血/再灌注組血清T-SOD、LDH水平在缺血預(yù)處理后明顯降低,與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示缺血/再灌注組心肌損傷嚴(yán)重,造模成功。在缺血預(yù)處理后,缺血預(yù)處理A、B組T-SOD、LDH含量均明顯增高,與缺血/再灌注組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但缺血預(yù)處理A、B 2組組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對(duì)兔缺血預(yù)處理后心肌酶譜的影響 4組動(dòng)物在缺血預(yù)處理前心肌酶譜MD及CK-MB含量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組缺血預(yù)處理前后無明顯變化(P>0.05);缺血/再灌注組MD釋放明顯升高,CK-MB活性降低,與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示缺血/再灌注組急性心肌缺血/再灌注損傷造模成功且心肌損傷嚴(yán)重。缺血預(yù)處理A、B 2組缺血預(yù)處理后CK-MB活性升高、MD血清釋放明顯減少,與缺血/再灌注組比較(P<0.05),但缺血預(yù)處理A、B 2組組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對(duì)兔缺血預(yù)處理后VEGF、VEGFmRNA表達(dá)的影響 4組動(dòng)物在缺血預(yù)處理前VEGF及VEGFmRNA表達(dá)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組VEGF、VEGFmRNA表達(dá)在缺血預(yù)處理前后無明顯變化,缺血/再灌注組VEGF、VEGFmRNA表達(dá)在缺血預(yù)處理后均出現(xiàn)一定程度升高,與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),此時(shí)兔心肌酶譜嚴(yán)重?fù)p傷,提示心肌缺血/再灌注可促進(jìn)VEGF及VEGFmRNA表達(dá)。在經(jīng)過丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液進(jìn)行缺血預(yù)處理后,缺血預(yù)處理A、B 2組VEGF及VEGFmRNA表達(dá)均較缺血/再灌注組進(jìn)一步升高,且與缺血/再灌注組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。缺血預(yù)處理A、B 2組組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表1 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對(duì)日本血清大耳白兔缺血預(yù)處理后T-SOD、LDH活性的影響±s,n=10)

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05;與缺血/再灌注組比較,△P<0.05。

表2 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對(duì)兔缺血預(yù)處理后心肌酶譜的影響±s,n=10)

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05;與缺血/再灌注組比較,△P<0.05。

表3 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對(duì)兔缺血預(yù)處理后VEGF、VEGFmRNA表達(dá)的影響

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05;與缺血/再灌注組比較,△P<0.05。

3 討論

急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,MI),中醫(yī)屬心痛、胸痹范疇,其發(fā)病主要機(jī)制是氣虛血瘀,而西藥認(rèn)為在冠狀動(dòng)脈病變?nèi)缰鄻佑不?、梗阻的病理基礎(chǔ)上導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈血供急劇減少或中斷,使缺血區(qū)心肌嚴(yán)重而持久地急性缺血[8]。流行病學(xué)調(diào)查顯示急性心肌梗死近年來發(fā)病率明顯升高,是造成死亡的主要病因[9],而造成心肌缺血/再灌注損傷主要病因是心肌缺血再灌注,其中又以心肌梗死再通手術(shù),冠狀動(dòng)脈溶栓治療及手術(shù)、冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)等最為嚴(yán)重[10],故缺血前預(yù)處理在減輕手術(shù)后心肌缺血/再灌注損傷的風(fēng)險(xiǎn)方面可能起到極積預(yù)防作用。研究表明,VEGF具有促使血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)缺血冠狀動(dòng)脈血管新生并增加血管通透性的作用[11]。而中藥制劑丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液可擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管、增強(qiáng)組織耐缺氧,對(duì)缺血/再灌注損傷有明確的保護(hù)作用[12]。為探討丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對(duì)急性心肌缺血/再灌注損傷預(yù)處理后VEGF表達(dá)及心肌酶譜等的影響,我們從兔耳緣靜脈注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液7 d的方法進(jìn)行缺血預(yù)處理來研究其作用機(jī)制。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí),在正常生理代謝狀態(tài)下,機(jī)體中氧自由基生成與清除及血管內(nèi)皮功能均維持著動(dòng)態(tài)平衡,當(dāng)機(jī)體發(fā)生病理改變?nèi)缧募〗M織由于缺血/再灌注時(shí),組織缺血缺氧會(huì)造成清除自由基的酶(總超氧化物歧化酶)活性下降,脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加劇造成血管內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷,此時(shí)心肌酶譜明顯異常,如血清T-SOD、LDH及CK-MB水平在缺血預(yù)處理后明顯降低,MDA大量釋放于血液而導(dǎo)致異常增高,是診斷心肌敏感度和特異度較高“金標(biāo)準(zhǔn)”[13-14]。在缺血/再灌注中,VEGF作為一種高度特異性的促血管生長因子也因缺血刺激而出現(xiàn)增高以彌補(bǔ)心肌缺血缺氧。由于VEGF具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移再生、誘導(dǎo)多種血管活性物質(zhì)合成,在MI時(shí)可能參與缺血心臟冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮新生,促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的形成方面起到極積作用,故MI時(shí)VEGF可作為反映血管內(nèi)皮生長及代謝功能的重要檢測(cè)指標(biāo)之一。在本實(shí)驗(yàn)中,4組動(dòng)物在缺血預(yù)處理前各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),缺血/再灌注組VEGF蛋白質(zhì)及mRNA表達(dá)增強(qiáng),LDH、T-SOD、CK-MB酶的活性下降,MDA合成明顯增多,說明急性心肌缺血/再灌注損傷、缺氧是促進(jìn)VEGF分泌的最主要因素,血管內(nèi)皮遭受氧自由基破壞而嚴(yán)重受損。在使用丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液缺血預(yù)處理后能明顯增強(qiáng)缺血預(yù)處理A、B 2組兔VEGF及mRNA表達(dá),明顯提高缺血預(yù)處理A、B 2組T-SOD、LDH及CK-MB酶的活性,降低缺血預(yù)處理A、B 2組動(dòng)物心肌酶譜的MD釋放。提示參酮ⅡA磺酸鈉注射液能明顯抑制MDA合成與釋放,降低急性心肌缺血/再灌注損傷后氧自由基的產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。同時(shí)還通過增加缺血心肌VEGF分秘來誘導(dǎo)缺血冠狀動(dòng)脈血管新生,從而達(dá)到促進(jìn)重建側(cè)枝循環(huán)、降低缺血/再灌注損傷的目的。這種作用可能與丹參酮ⅡA恢復(fù)Ca2+-ATP酶活性,抑制過度Na-Ca2+交換造成的心肌細(xì)胞鈣超載導(dǎo)致的急性心肌梗死有關(guān)[15-16]。同時(shí),丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液的主要有效果成分丹參酮具有活血化瘀的藥理作用,可明顯降低血黏度,改善微循環(huán),擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈增加血流量,增加缺血心肌供氧及能量代謝而起到缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用[17-18]。總之,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔在造成心肌缺血/再灌注損傷前,在經(jīng)丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液進(jìn)行缺血預(yù)處理,可明顯提高VEGF分泌及氧自由基清除酶的活性,加快缺血心肌血管內(nèi)皮新生,促進(jìn)血管新生,抑制心肌缺血/再灌注損傷時(shí)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而減輕心肌血管內(nèi)皮炎性反應(yīng),進(jìn)而改善缺血/再灌注損傷后受損血管內(nèi)皮功能,對(duì)兔急性心肌缺血/再灌注損傷有明確的保護(hù)作用。

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(2015-11-19收稿 責(zé)任編輯：王明)

Protective effect of Danshen A Sodium Sulfonate Injection on Vascular Endothelial Injury after Ischemic Preconditioning in Rabbits with Myocardial Ischemia Preconditioning

Liu Jiajun1,Wu Song2,Li Longzhu1,Ao JinBo2

(1ShiyanChineseMedicineHospital,Shiyan442012,China; 2ShiyanTaiheHospital,AffiliatedHospitalofHubeiMedicalCollege,Shiyan442000,China)

Objective:To observe the protective effect of Danshen A sodium sulfonate injection on myocardial ischemia and reperfusion injury in rabbit,investigate the effect of Danshen A sodium sulfonate injection on myocardial enzyme spectrum and explore its potential mechanism to heart function.Methods:Twenty-four rabbits were randomly divided into ischemia/reperfusion group,ischemic preconditioning processing group A,and ischemic preconditioning group B.Ischemic preconditioning processing group A was injected via ear vein with Danshen A sodium sulfonate injection at 2.5 mL/kg/d,while ischemic preconditioning treatment group B at 5 mL/kg/d and ischemia/reperfusion group were injected with 1 mL physiological saline.After a week preprocessing,rabbits in all groups were ligated at coronary artery and was re-perfused for 30 minutes,30 minutes after ligation.The rest 8 rabbits were fed up as control group.Vascular endothelial growth factor (VEGF) and VEGF mRN expression before and after processing were measured by double antibody sandwich EUS,and serum total superoxide dismutase (T-SOD),lactate dehydrogenase (LDH),creatine kinase isoenzyme (CK-MB) and myocardial malondialdehyde (MDA) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELIS).The protective effect of Danshen A sodium sulfonate injection on vascular endothelial injury and its effect on myocardial enzyme spectrum in rabbits after myocardial ischemia preconditioning were evaluated.Results:Differences of the four groups in ischemic preconditioning showed no significance (P>0.05),VEGF and mRN expression in both group A and B after preprocessing were significantly enhanced,and T-SOD,LDH and CK-MB of were obviously improved and the release of MD declined in the two groups with statistically significant difference compared with the ischemia/reperfusion group (P<0.05).There was no significant difference between the ischemic preconditioning group A and group B (P>0.05).Conclusion:Danshen A sodium sulfonate injection on myocardial ischemia and reperfusion injury in rabbits may significantly increase VEGF and enhance LDH activity,accelerate myocardial ischemia vascular endothelial growth,inhibit lipid peroxidation inhibition and reduce myocardial vascular endothelial inflammatory response,thereby improving impaired endothelial function due to ischemia/reperfusion injury.It has clear protective effects on rabbit experimental myocardial ischemia/reperfusion injury.

Danshen A sodium sulfonate injection; Myocardial ischemia/reperfusion injury preconditioning; Vascular endothelial growth factor; Myocardial enzyme spectrum

湖北省教育廳教育科學(xué)“十二五”規(guī)劃課題(編號(hào):2014B095)

劉家軍(1974.09—),男,大學(xué)本科,主治醫(yī)師,消化科主任,研究方向:從事中藥藥理學(xué)與心血管研究,E-mail:18772877526@163.com

敖金波(1977.02—),男,碩士,主治醫(yī)師,副主任,研究方向:從事中藥藥理學(xué)研究,E-mail:lilongzhu727@sina.cn

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.03.036