張玉琛, 吳海珍, 鞠 誠, 祁雙雙, 葉 江, 張惠展(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

Streptomycessp.Tü 4128中新型抗生素bagremycins抗性基因bagJ的研究

張玉琛, 吳海珍, 鞠 誠, 祁雙雙, 葉 江, 張惠展
(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

通過框內(nèi)敲除鑒定了鏈霉菌Streptomycessp.Tü 4128中基因bagJ的功能。HPLC結(jié)果表明,敲除基因bagJ導(dǎo)致抗生素生產(chǎn)水平大幅降低;回補(bǔ)菌株恢復(fù)了抗生素的生產(chǎn);過表達(dá)菌株大幅提高了抗生素的產(chǎn)量,證明基因bagJ在新型抗生素bagremycins的生物合成中必不可少。抑菌圈實(shí)驗(yàn)表明基因bagJ敲除菌株較野生菌株對bagremycins更加敏感;BagJ在StreptomyceslividansTK64中異源表達(dá)后使該菌株對bagremycins的耐受性增強(qiáng),證明bagJ是新型抗生素bagremycins的抗性基因。掃描電鏡的結(jié)果證明了BagJ異源表達(dá)后導(dǎo)致StreptomycesTK64的菌絲形態(tài)發(fā)生了改變。其他抗生素的敏感性實(shí)驗(yàn)表明,BagJ可能是一個(gè)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

bagremycins;Streptomycessp.Tü 4128;bagJ; MFS家族; 抗性基因

從印度尼西亞土壤中分離得到的Streptomycessp.Tü 4128 (S. sp. Tü 4128)菌株可以生產(chǎn)兩種新型的反式香豆酸衍生類抗生素bagremycin A和bagremycin B。bagremycin A和bagremycin B對多種革蘭氏陽性菌、真菌以及一種人類腺癌細(xì)胞系具有相當(dāng)可觀的生物學(xué)活性。其中bagremycin A對SaccharomycescerevisiaeATCC9080和Candidaalbicans具有活性,而bagremycin B能作用于Botrytiscinerea和人類腺癌細(xì)胞[1-2]。這兩種抗生素在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

與bagremycins生物合成相關(guān)的基因在菌株S. sp.Tü 4128的染色體上成簇排列。在前期的研究中,本課題組成功克隆并鑒定了bagA,bagB,bagC,bagE和bagI等結(jié)構(gòu)基因,但至今仍未發(fā)現(xiàn)該生產(chǎn)菌的抗性基因[3-5]。作為抗生素的生產(chǎn)者,除了有一些菌株對自身產(chǎn)生的抗生素不敏感,大多數(shù)微生物都需要一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)的抗性基因來維持抗生素生產(chǎn)的能力,同時(shí)抵抗自身產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物[6-8]。這種抵抗作用主要包括以下幾種機(jī)理:抗生素失活[9-10]、修飾抗生素作用的靶點(diǎn)[11-12]以及改變抗生素的轉(zhuǎn)運(yùn)量和外膜的通透性等[13-16]。

為了維持細(xì)胞的長期穩(wěn)定,微生物進(jìn)化出了多種通道系統(tǒng)以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白用于轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子和親水分子等。在細(xì)菌中主要存在3種轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制:初級轉(zhuǎn)運(yùn)、次級轉(zhuǎn)運(yùn)和基團(tuán)移位系統(tǒng)。主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的超家族(Major facilitator superfamily,MFS)屬于次級多重藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,并且是這一類型中最大的超家族[17-18]。這種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過“Rocker-switch”機(jī)制實(shí)現(xiàn)底物轉(zhuǎn)運(yùn)[19]。MFS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是一個(gè)典型的多特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,因?yàn)榫哂卸喙δ艿牡孜锝Y(jié)合疏水腔,使得不同結(jié)構(gòu)的底物分子可以穿膜[20-21]。一般來說,MFS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)包含12個(gè)或14個(gè)跨膜片段(transmembrane segment,TMS)[22-23]。典型的MFS家族成員可以分為3類:(1)單一轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白:只能運(yùn)輸1個(gè)底物;(2)同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白:同時(shí)同向運(yùn)輸2個(gè)以上底物;(3)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白:同時(shí)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)2個(gè)以上底物[19]。

本研究鑒定了一個(gè)MFS家族的新成員BagJ,該蛋白在菌株S.sp. Tü 4128中具有逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。就目前的數(shù)據(jù)所知[1-5],bagJ是第一個(gè)在S.sp. Tü 4128中鑒定出的bagremycins抗性基因,這為進(jìn)一步研究bagremycins的抗性機(jī)制以及生產(chǎn)菌S.sp. Tü 4128轉(zhuǎn)運(yùn)代謝物的途徑提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌株,質(zhì)粒及生長條件

表1列出了本文涉及到的所有菌株和質(zhì)粒,Escherichiacoli和Streptomyces的培養(yǎng)條件參照本實(shí)驗(yàn)室前期研究中的標(biāo)準(zhǔn)流程[5]。

表1 本文中所用的菌株和質(zhì)粒

1.2 基因的敲除、回補(bǔ)、過表達(dá)及異源表達(dá)

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期所建立的流程[3],將基因bagJ的上游691 bp和下游640 bp同源臂克隆至穿梭質(zhì)粒pOJ260-neo上,利用同源重組的方式,對基因bagJ進(jìn)行框內(nèi)敲除。在含有萘啶酮酸的SMA(Soybean Mannitol Agar)平板上,通過卡那霉素抗性篩選陽性克隆并進(jìn)行測序驗(yàn)證。在回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中,將基因bagJ的ORF(Open Reading Fram)克隆至質(zhì)粒pIB139的啟動子PermE*下游構(gòu)建回補(bǔ)質(zhì)粒pIB139-bagJ,并分別將該質(zhì)粒導(dǎo)入bagJ敲除菌株ΔbagJ、野生菌株WT以及S.lividansTK64中,從而實(shí)現(xiàn)回補(bǔ)菌株bagJ+、過表達(dá)菌株bagJ++以及異源表達(dá)菌株S. lividans TK64/bagJ的構(gòu)建。

1.3 發(fā)酵及發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析

發(fā)酵產(chǎn)物的提取以及HPLC分析方法在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中已有詳細(xì)說明[5]。

1.4 掃描電鏡方法

將S.lividansTK64和S.lividansTK64/bagJ在YEME (Yeast Extract-Malt Extract)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d。收集1.5 mL菌液,用雙蒸水和0.1 mol/L PBS緩沖液分別洗滌1次。洗滌好的細(xì)胞用新鮮配制的φ=25%戊二醛溶液固定過夜。此后,用0.1 mol/L PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次,并用雙蒸水洗滌1次。用體積分?jǐn)?shù)分別為30%,50%,70%,90%和100%的乙醇進(jìn)行梯度脫水。在自然風(fēng)干后,將樣品進(jìn)行黏臺和噴金,隨后用JSM-6360LV掃描電鏡進(jìn)行檢測。

1.5 抑菌圈實(shí)驗(yàn)

本文通過抑菌圈實(shí)驗(yàn)檢測了野生菌株WT、敲除菌株ΔbagJ、回補(bǔ)菌株bagJ+、S.lividansTK64和異源表達(dá)菌株S.lividansTK64/bagJ對不同濃度bagremycins粗提物及其溶劑甲醇的敏感性。在培養(yǎng)了5 d的SMA平板上,收集上述菌株的孢子并測定濃度。在每個(gè)平板上,放置4個(gè)鋼圈,每個(gè)鋼圈內(nèi)包含特定濃度的bagremycins。另外,用150 μg卡那霉素(KAN)、500 μg壯觀霉素(SP)、100 μg氯霉素(C)、40 μg四環(huán)素(TC)以及400 μg氨芐青霉素(AMP)檢測S.lividansTK64和S.lividansTK64/bagJ對不同抗生素的敏感性。與此同時(shí),將配制上述抗生素時(shí)使用到的特殊溶劑DMSO (Dimethyl sulfoxide)以及乙醇作為空白對照。上述抑菌圈實(shí)驗(yàn)用到的平板在28 ℃孵育4 d,最后取出鋼圈觀察抑菌圈大小。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 BagJ的生物信息學(xué)分析

表2的數(shù)據(jù)表明,在Uniprot數(shù)據(jù)庫中,通過在線BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)比對,發(fā)現(xiàn)BagJ和其他放線菌屬中已經(jīng)確認(rèn)的MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或預(yù)測具有MFS轉(zhuǎn)運(yùn)功能的蛋白非常類似。

表2 S.sp.Tü 4128中BagJ蛋白與其他放線菌屬蛋白序列相似性分析

NCBI(National Center for Biotechnology Informaion)生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,在BagJ第33～444個(gè)氨基酸之間存在一個(gè)MFS特征保守結(jié)構(gòu)域(MFS superfamily [cl21472])。此外,通過3個(gè)不同的在線平臺(TMHMM Server v.2.0:Prediction of transmembrane helices in proteins,TopPred0.01:Topology prediction of membrane proteins and SACS HMMTOP Transmembrane)預(yù)測BagJ存在14個(gè)潛在的TMS,預(yù)測結(jié)果見圖1。圖1(a)預(yù)測了BagJ的跨膜螺旋結(jié)構(gòu);圖1(b)預(yù)測了BagJ的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),其中14個(gè)明顯的疏水峰用圖頂端的垂直線條標(biāo)出。2條水平線之間的面積用于識別潛在的TMS,橫、縱坐標(biāo)分別代表了氨基酸的位置及相對的疏水性;圖1(c)所示為BagJ二維模型及膜定位的分析。這種構(gòu)象與MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的14-TMS典型結(jié)構(gòu)一致。綜合上述信息生物學(xué)分析的結(jié)果,本文推測BagJ是一個(gè)具有14個(gè)TMS的疏水蛋白,并且作為MFS家族的一個(gè)成員定位在細(xì)胞膜上。

圖1 BagJ的生物信息學(xué)分析

2.2 基因bagJ對bagremycins產(chǎn)量的影響

為了探究bagJ的功能,本文用框內(nèi)敲除的方法構(gòu)建了基因bagJ的單敲除菌株ΔbagJ。圖2(b)顯示當(dāng)基因bagJ缺失時(shí),ΔbagJ的發(fā)酵產(chǎn)物中檢測不到bagremycin A,這表明基因bagJ與抗生素的合成和(或)外排密切相關(guān)。為了進(jìn)一步證明基因bagJ的缺失是導(dǎo)致bagremycin A不產(chǎn)生的原因,本文構(gòu)建了基因bagJ的回補(bǔ)菌株bagJ+和過表達(dá)菌株bagJ++。HPLC的結(jié)果顯示bagJ+恢復(fù)了生產(chǎn)bagremycin A的能力,但產(chǎn)量并沒有恢復(fù)到WT的水平。此外,bagJ++的bagremycin A和bagremycin B產(chǎn)量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于WT的水平,其結(jié)果如圖2(c)和2(d)表示。從上述結(jié)果可以得出結(jié)論,敲除菌株ΔbagJ生產(chǎn)bagremycin A能力的喪失是由基因bagJ的缺失造成的。

2.3 基因bagJ的過表達(dá)對bagremycin產(chǎn)量的影響

為了進(jìn)一步證明基因bagJ的過表達(dá)會影響bagremycins的產(chǎn)量,本文對WT和bagJ++進(jìn)行了大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)。提取第3,5,7,9,11,13,15,17,19天的發(fā)酵上清液,過濾后通過HPLC的方法分析bagremycins的產(chǎn)量。在bagJ++中的bagremycins產(chǎn)量遠(yuǎn)大于WT,其中bagremycin A的產(chǎn)量增加了7倍,bagremycin B的產(chǎn)量增加了28倍,如圖3所示。這與前文推測的BagJ是一個(gè)MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,并能將bagremycins轉(zhuǎn)運(yùn)到S.sp.Tü 4128胞外一致。同時(shí),基因bagJ的過表達(dá)也為新型抗生素bagremycins的高產(chǎn)提供了新的策略。

圖2 抗生素bagremycins產(chǎn)量的HPLC分析

2.4 基因bagJ與菌株對bagremycins敏感性的關(guān)系

抗生素bagremycins會抑制生產(chǎn)菌S.sp.Tü 4128的生長,為了進(jìn)一步評估BagJ是否與該菌株對bagremycins的耐受性相關(guān),本文測試了菌株WT、ΔbagJ和bagJ+對不同濃度bagremycins粗提物的耐受性。圖4中左上角的圈中包含了甲醇(空白對照),平板上順時(shí)針方向粗提液的體積依次為50、100、200 μL(圖4(a)～圖4(e))。菌株ΔbagJ相比于WT,在相同濃度的抗生素作用下,抑菌圈直徑更大(圖4(a)和圖4(b))。此外,bagJ+恢復(fù)了對bagremycins的耐受性(圖4(c))。在用溶劑甲醇作對照的情況下,3株菌株均生長正常,并且抑菌圈狀態(tài)相似。以上結(jié)果表明基因bagJ與生產(chǎn)菌S.sp.Tü 4128對bagremycins的敏感性有關(guān),推測這種現(xiàn)象是BagJ通過將抗生素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外來實(shí)現(xiàn)的。

圖3 WT和bagJ++中bagremycins產(chǎn)量的定量分析

2.5bagJ異源表達(dá)菌株對bagremycins敏感性的驗(yàn)證

為了證明bagJ是S.sp.Tü 4128中bagremycins的抗性基因,本研究將質(zhì)粒pIB139-bagJ導(dǎo)入S.lividansTK64中,使其異源表達(dá)基因bagJ,并在不同的bagremycins粗提物的濃度下,對S.lividansTK64和S.lividansTK64/bagJ進(jìn)行了抑菌圈實(shí)驗(yàn)。圖4(d)和4(e)表明,在相同濃度的bagremycins作用下,異源表達(dá)菌株的抑菌圈半徑遠(yuǎn)小于TK64的抑菌圈半徑。2種菌株在對照組甲醇的作用下均正常生長。綜上所述,bagJ是S.sp.Tü 4128的抗性基因。

2.6 異源表達(dá)bagJ對S.lividansTK64菌絲形態(tài)的影響

抑菌圈實(shí)驗(yàn)觀察到S.lividansTK64/bagJ的菌絲形態(tài)與S.lividansTK64明顯不同。為了探究基因bagJ是否與菌絲形態(tài)的改變相關(guān),分別在3塊SMA培養(yǎng)基上涂布了S.lividansTK64、S.lividansTK64/bagJ和S.lividansTK64/pIB139的新鮮孢懸液。培養(yǎng)3 d之后發(fā)現(xiàn)三者的生長形態(tài)出現(xiàn)了一定的差異,其中,S.lividansTK64/bagJ的菌絲呈現(xiàn)明顯的皺縮狀態(tài)。為了進(jìn)一步確定這種宏觀的變化是否由菌絲形態(tài)的改變造成,本研究通過掃描電鏡(SEM)對上述3個(gè)菌株的菌絲形態(tài)進(jìn)行了深入分析。圖5中掃描電鏡的結(jié)果表明,S.lividansTK64/bagJ的氣生菌絲比對照組的S.lividansTK64/pIB139粗壯,而S.lividansTK64/pIB139和S.lividansTK64的菌絲體粗細(xì)一致,這暗示由于BagJ在細(xì)胞膜上的定位導(dǎo)致異源表達(dá)菌株S.lividansTK64/bagJ的菌絲體表面積增加,從而增加了該菌株向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)bagremycins的幾率。掃描電鏡的結(jié)果和上述的推斷進(jìn)一步解釋了S.lividansTK64/bagJ對bagremycins的敏感性小于S.lividansTK64的現(xiàn)象。

(a～e):Sensitivity tests of different strains to bagremycins:(a) WT,(b) ΔbagJ,(c)bagJ+,(d)S.lividansTK64,(e) Heterologously express strainS.lividansTK64/bagJ；(f) Sensitivity ofS.lividansTK64 (f1) andS.lividansTK64/bagJ (f2) to kanamycin,ampicillin,spectinomycin and DMSO；(g) Sensitivity ofS.lividansTK64 (g1) andS.lividansTK64/bagJ (g2) to ethanol,chloromycetin and tetracycline.

圖4 敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Fig.4 Results of sensitivity tests

2.7 BagJ是一個(gè)新型的MFS家族逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

為了進(jìn)一步確認(rèn)BagJ屬于MFS家族中的哪一類型,本課題組進(jìn)一步對S.lividansTK64和S.lividansTK64/bagJ進(jìn)行了抑菌圈實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)選擇了氨基糖苷類的卡那霉素(溶于雙蒸水)、壯觀霉素(溶于DMSO)、胺酰醇類的氯霉素(溶于乙醇)、β-內(nèi)酰胺類的氨芐青霉素(溶于雙蒸水)以及四環(huán)素(溶于乙醇)。在進(jìn)行一系列嘗試后,選定了使抑菌圈邊界最清晰的抗生素劑量進(jìn)行抑菌圈實(shí)驗(yàn),即卡那霉素150 μg,氨芐青霉素300 μg,壯觀霉素50 μg,氯霉素100 μg以及四環(huán)素50 μg。其中DMSO和乙醇分別作為對照。

圖4(f)和圖4(g)表明,菌株S.lividansTK64菌對乙醇不敏感,這說明氯霉素和四環(huán)素造成的抑菌圈沒有受到乙醇的影響。然而,DMSO對S.lividansTK64具有一定的抑制作用。DMSO被稱為“萬能溶劑”,常用來促進(jìn)藥物的吸收,而高濃度的DMSO會結(jié)合蛋白質(zhì)疏水基團(tuán),從而引起蛋白的變性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,四環(huán)素和氨芐青霉素在菌株S.lividansTK64和S.lividansTK64/bagJ中產(chǎn)生的抑菌圈并沒有顯著差異。在氯霉素和卡那霉素的作用下,S.lividansTK64/bagJ中產(chǎn)生的抑菌圈均大于S.lividansTK64的抑菌圈,這可能是由于BagJ能夠?qū)⑦@兩種抗生素轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的原因。此外,上述結(jié)果還表明BagJ能夠增強(qiáng)S.lividansTK64/bagJ將DMSO轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外的能力。排除DMSO的影響,壯觀霉素造成的抑菌圈并不顯著。結(jié)合BagJ能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)的bagremycins運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外這一結(jié)果,本文認(rèn)為BagJ所轉(zhuǎn)運(yùn)的底物并不具有特異性,推測BagJ屬于逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

圖5 BagJ對S.lividans TK64菌絲形態(tài)的影響

3 討 論

隨著細(xì)菌耐藥性的廣泛存在,病原菌對人類的威脅日益嚴(yán)重。WHO認(rèn)為這種趨勢會使“后抗生素時(shí)代”提前到來。因此,對于新型抗生素及其抗性基因和耐藥機(jī)理的研究十分緊迫。

多種抗性基因都是膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。其中,原核生物已知的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中,有25%屬于MFS家族[24]。MFS家族蛋白可以實(shí)現(xiàn)不同底物的跨膜運(yùn)輸從而維持胞內(nèi)滲透壓的平衡及細(xì)胞本身的穩(wěn)定性。MFS家族的成員不僅能從外環(huán)境中攝取營養(yǎng)物質(zhì)及必需分子,還能將有毒的代謝產(chǎn)物排出細(xì)胞。此外,MFS家族還與藥物分子的轉(zhuǎn)運(yùn)和耐藥性密切相關(guān)。典型的MFS家族蛋白包含400～600個(gè)氨基酸[19],且其中的大部分成員包含12個(gè)或14個(gè)TMS。在S.lincolnensis中,lmrA是一個(gè)具有14個(gè)TMS的MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,并可以賦予林可霉素敏感菌株S.lividansTK23相應(yīng)的抗性。此外,S.coelicolor的次甲霉素抗性基因與Staphylococcusaureus的QacA編碼基因有著類似的功能[25]。

本研究鑒定出一個(gè)在bagremycins生物合成中必不可少的抗性基因bagJ。BagJ具有452個(gè)氨基酸,與Kibdelosporangiumsp.MJ126-NF4中MFS家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A0A0B7CV45有著55.8%的一致性。此外,序列比對和二級結(jié)構(gòu)分析表明,BagJ具有MFS家族特征保守結(jié)構(gòu)域以及典型的14-TMS結(jié)構(gòu)。這些數(shù)據(jù)均為BagJ在S.sp.Tü 4128中的膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能和bagremycins抗性基因作用提供了依據(jù)。

通過敲除、回補(bǔ)以及過表達(dá)實(shí)驗(yàn),證明了基因bagJ在bagremycins抗生素生產(chǎn)中的重要作用。敲除基因bagJ使bagremycin A停止生產(chǎn),bagremycin B幾乎檢測不到?；匮a(bǔ)基因bagJ后,菌株恢復(fù)抗生素的生產(chǎn),但并未達(dá)到野生菌株水平,推測這是由于在回補(bǔ)質(zhì)粒中使用的PermE*啟動子并沒有基因bagJ自身啟動子合適。圖2顯示,過表達(dá)后抗生素的產(chǎn)量大大提升,bagremycin A與bagremycin B的產(chǎn)量分別達(dá)到了野生菌株的182%和128%。另外,在圖3的結(jié)果中,bagremycin A和bagremycin B在過表達(dá)菌株中的產(chǎn)量與野生菌株相比分別高了7倍和28倍。上述這一系列結(jié)果不僅證明了基因bagJ在bagremycins生物合成中必不可少,也為新型抗生素bagremycins的高產(chǎn)提供了新的思路,即通過過表達(dá)BagJ將更多的bagremycins轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外。

抑菌圈實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了基因bagJ的缺失使菌株對bagremycins更加敏感,而該基因在S.lividansTK64中的異源表達(dá),使得到的異源表達(dá)菌株對bagremycins存在更強(qiáng)的耐受性。掃描電鏡的結(jié)果表明在異源表達(dá)基因bagJ后S.lividansTK64菌絲表面積增大,從而使更多bagremycins轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞。

MFS家族中的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以同時(shí)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)多種底物,一般其中一種離子或分子順電化學(xué)梯度轉(zhuǎn)運(yùn),其產(chǎn)生的能量驅(qū)動其他離子或分子逆電化學(xué)梯度轉(zhuǎn)運(yùn)。例如常見的Na+/Ca2+交換蛋白便是一種逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,它可以利用儲存在Na+電化學(xué)梯度中的能量將Na+轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi),同時(shí),使Ca2+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)從而排出細(xì)胞。此蛋白是細(xì)胞外排Ca2+最重要的機(jī)制之一[27],該蛋白排出1個(gè)Ca2+的同時(shí)攝入3個(gè)Na+[28]。

逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員轉(zhuǎn)運(yùn)的底物十分多樣化,它們可以協(xié)助一些金屬離子、磷酸糖類物質(zhì)、多種藥物、神經(jīng)遞質(zhì)、氨基酸、核苷和多肽類[29]等物質(zhì)跨越胞質(zhì)及內(nèi)膜。甚至有一些該家族的蛋白對底物不具有選擇性,對多種藥物和外源性物質(zhì)均具有外排的作用[30-32]。本文選取了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)現(xiàn)有的不同種類的抗生素對S.lividansTK64和異源表達(dá)菌株S.lividanspIB139-bagJ/TK64進(jìn)行了抑菌圈實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BagJ既可以向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)bagremycins和DMSO從而減小抑菌圈的直徑,又可以向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)卡那霉素和氯霉素,使抑菌圈直徑增加。該現(xiàn)象結(jié)合生物信息學(xué)比對結(jié)果,可以推測BagJ是一個(gè)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

綜上所述,本文首次鑒定出了S. sp.Tü 4128的抗性基因bagJ,它作為MFS家族逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在于bagremycins的生物合成途徑中。當(dāng)前的研究主要集中于基因bagJ的缺失、回補(bǔ)、過表達(dá)對bagremycins產(chǎn)量和菌株敏感性的改變,以及對其他抗生素敏感性的分析。后續(xù)的研究將延伸到bagremycins的高產(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用。眾所周知,肺癌已成為中國男性發(fā)病率最高的癌癥,其中超過85%是非小細(xì)胞肺癌,腺癌占非小細(xì)胞肺癌的50%,而針對肺腺癌,由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,并沒有特效藥[26]。bagremycins抗生素對特定類型的腺癌具有一定程度的殺滅作用。隨著基因組測序技術(shù)的廣泛普及,以及蛋白質(zhì)組技術(shù)的飛速發(fā)展,肺癌的癌癥分型正在趨于明朗化,因此,如果bagremycins可以針對某一亞型的腺癌細(xì)胞具有不錯的清除作用,必將廣泛應(yīng)用于臨床,成為抗擊癌癥的一種新型藥物。

[1]BERTASSO M,HOLZENKMPFER M,ZEECK A,etal.Bagremycin A and B,novel antibiotics fromS.sp.Tü 4128 [J].Journal of Antibiotics,2001,54(9):730-736.

[2]BERTASSO M,HOLZENKMPFER M,ZEECK A,etal.Bagremycins are two new para-coumaric acid derived antibiotics produced byS.sp.Tü 4128[C]//Biotechnological Advances and Applications in Bioconversion of Renewable Raw Materials.Braunschweig:BGBF and InWEnt,2004:86-91.

[3]LIU Feng,XU Dakui,ZHANG Yuchen,etal.Identification of BagI as a positive transcriptional regulator of bagremycin biosynthesis in engineeredStreptomycessp.Tü 4128 [J].Microbiological Research,2015,173:18-24.

[4]ZHU Yunxia,LIAO Siyi,YE Jiang,etal.Cloning and characterization of a novel tyrosine ammonia lyase-encoding gene involved in bagremycins biosynthesis inStreptomycessp.Tü 4128 [J].Biotechnology Letters,2012,34(2):269-274.

[5]ZHU Yunxia,XU Dakui,LIAO Siyi,etal.Cloning and characterization ofbagBandbagC,two co-transcribed genes involved in bagremycin biosynthesis inS.sp.Tü 4128 [J].Annals of Microbiology,2013,63(1):167-72.

[6]CUNDLIFFE E.How antibiotic producing organisms avoid suicide [J].Annual Review of Microbiology,1989,3(1):207-233.

[7]VECCHIONE J J,SELLO J K.Characterization of an inducible,antibiotic-resistant aminoacyl-tRNA synthetase gene inStreptomycescoelicolor[J].Journal of Bacteriology,2008,190(18):6253-6257.

[9]HOTTA K,YAMAMOTO H,OKAMI Y,etal.Resistance mechanisms of kanamycin-,neomycin-,and streptomycin- producing streptomycetes to aminoglycoside antibiotics [J].Journal of Antibiotics,1981,34(9):1175-1182.

[10]YAMAMOTO H,HOTTA K,OKAMI Y,etal.Mechanism of resistance to aminoglycoside antibiotics in nebramycin-producingStreptomycestenebrarius[J].Journal of Antibiotics,1982,35(8):1020-1025.

[11]YAMAMOTO H,HOTTA K,OKAMI Y,etal.Self-resistance of aStreptomyceswhich produces istamycins [J].Journal of Antibiotics,1981,34(7):824-829.

[12]CUNDLIFFE E.Mechanism of resistance to thiostrepton in the producing-organismStreptomycesazureus[J].Nature,1978,272(5656):792-795.

[13]SUGIYAMA M,MOCHIZUKI H,NIMI O,etal.Mechanism of protection of protein synthesis against streptomycin inhibition in a producing strain [J].Journal of Antibiotics,1981,34(9):1183-1188.

[14]WEISBLUM B.Erythromycin resistance by ribosome modification [J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1995,39(3):577-585.

[15]NAKANO M M,MASHIKO H,OGAWARA H.Cloning of the kanamycin resistance gene from a kanamycin-producingStreptomycesspecies [J].Journal of Bacteriology,1984,157(1):79-83.

[16]LOMOVSKAYA N,HONG S K,KIM S U,etal.TheStreptomycespeucetiusdrrCgene encodes a UvrA-Like protein involved in daunorubicin resistance and production [J].Journal of Bacteriology,1996,178(11):3238-3245.

[17]MATIN JF,CASQUEIRO J,LIRAS P.Secretion systems for secondary metabolites:How producer cells send out messages of intercellular communication [J].Current Opinion in Microbiology,2005,8(3):282-293.

[18]NEYFAKH A A.Mystery of multidrug transporters:The answer can be simple [J].Molecular Microbiology,2002,44(5) :1123-1130.

[19]LAW C J,MALONEY P C,WANG D N.Ins and outs of major facilitator superfamily antiporters [J].Annual Review of Microbiology,2008,62(62):289-305.

[20]FERNANDEZ-AGUADO M,MARTIN J F,RODRIGUEZ-CASTRO R,etal.New insights into the isopenicillin N transport inPenicilliumchrysogenum[J].Metabolic Engineering,2014,22(2):89-103.

[21]PAULSEN IT.Multidrug efflux pumps and resistance:Regulation and evolution [J].Current Opinion in Microbiology,2003,6(5):446-451.

[22]SUN J,BANKSTON J R,PAYANDEH J,etal.Crystal structure of the plant dual-affinity nitrate transporter NRT1.1 [J].Nature,2014,507(7490):73-77.

[23]REDDY V S,SHLYKOV M A,CASTILLO R,etal.The major facilitator superfamily (MFS) revisited [J].Febs Journal,2012,279(11) :2022-2035.

[24]SAIER J R M H,BEATTY J T,GOFFEAU A,etal.The major facilitator superfamily [J].Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology,1999,1(2):257-279.

[25]ZHANG Huizhan,SCHMIDT H,PIEPERSBERG W.Molecular cloning and characterization of two lincomycin-resistance genes,ImrAandlmrB,fromStreptomyceslincolnensls78-11 [J].Molecular Microbiology,1992,6(15):2147-2157.

[26]CHEN Zhao,FILLMORE C M,HAMMERMAN P S,etal.Non-small-cell lung cancers:A heterogeneous set of diseases [J].Nature Reviews Cancer,2014,14(8):535-546.

[27]DIPOLO R,BEAUGE L.Sodium/calcium exchanger:Influence of metabolic regulation on ion carrier interactions [J].Physiological Reviews,2006,86:155-203.

[28]YU Shanping,Choi D W.Na+-Ca2+exchange currents in cortical neurons:Concomitant forward and reverse operation and effect of glutamate [J].European Journal of Neuroscience,1997,9(6):1273-1281.

[29]DOKI S,KATO H E,SOLCAN N,etal.Structural basis for dynamic mechanism of proton-coupled symport by the peptide transporter POT [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2013,110(28):11343-11348.

[30]JIANG Daohua,ZHAO Yan,WANG Xianping,etal.Structure of the YajR transporter suggests a transport mechanism based on the conserved motif A[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2013,110(36):14664-14669.

[31]PUTMAN M,VAN VEEN H W,KONINGS W N.Molecular properties of bacterial multidrug transporters [J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2000,64(4):672-693.

[32]YIN Yong,HE Xiao,SZEWCZYK P,etal.Structure of the multidrug transporter EmrD fromEscherichiacoli[J].Science,2006,312(5774):741-744.

Identification ofbagJas A Resistant Gene for Novel Antibiotic Bagremycins inStreptomycessp.Tü 4128

ZHANG Yu-chen, WU Hai-zhen, JU Cheng, QI Shuang-shuang, YE Jiang, ZHANG Hui-zhan

(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

The function of genebagJvia in-frame deletion inStreptomycessp.Tü 4128 was identified.The result of HPLC analysis showed that the production of bagremycins was significantly decreased in the single knock-out strain ofbagJ.The production of bagremycins was recovered in the complementation strain.The overexpression of genebagJresulted in producing far more bagremycins,which indicated thatbagJwas indispensable in the biosynthesis of bagremycins.The test of inhibition zones showed that thebagJmutant was more sentitive to bagremycins than the wild type.Heterogenous expression of BagJ inStreptomyceslividansTK64 enhanced its endurance to bagremycins which suggested thatbagJmight be a resistant gene of the novel antibiotics bagremycins.SEM showed that the morphology of the mycelia was changed in the heterogenous expression strain of BagJ inS. lividams TK64.The sensitivity assays of other antibiotics showed that BagJ was probably an antiporter.

bagremycins;Streptomycessp.Tü 4128;bagJ; MFS family; resistant gene

1006-3080(2017)02-0184-09

10.14135/j.cnki.1006-3080.2017.02.006

2016-07-12

國家自然科學(xué)基金(31200026)

張玉琛(1990-),女,安徽淮南人,碩士生,研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail:zhangyuchen613@163.com

張惠展,E-mail:huizhzh@ecust.edu.cn

Q71

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