管凇+周漢林+侯冠彧

摘 要 為探索GDF-8基因在山羊不同生長(zhǎng)階段的肝臟、心臟、腎臟、脂肪和骨骼肌中mRNA表達(dá)發(fā)育性變換規(guī)律，采用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)2月齡、3月齡和4月齡的海南本地山羊進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，GDF-8基因在3月齡的心臟組織中mRNA表達(dá)量最高，其次是腎臟和骨骼?。辉?月齡和4月齡時(shí)5種組織中GDF-8基因表達(dá)量較低，尤其是在心臟組織中幾乎不表達(dá)；在肝臟和脂肪中的表達(dá)依次為4月齡>2月齡>3月齡，且各月齡之間表達(dá)差異極顯著（p<0.01）；心臟、腎臟和骨骼肌的表達(dá)依次為3月齡>4月齡>2月齡，其中，腎臟在不同月齡段表達(dá)差異極顯著（p<0.01），而心臟和骨骼肌在2月齡和4月齡之間表達(dá)差異不顯著（p>0.05）。

關(guān)鍵詞 GDF-8基因 ；mRNA表達(dá) ；熒光實(shí)時(shí)定量PCR ；山羊

中圖分類號(hào) S827

Abstract In order to explore the mRNA expression differences and developmental changes of GDF-8 gene in liver， heart， kidney， fat， and skeletal muscle of goat in different growth stages， in this paper， using SYBR Green real-time fluorescent quantitative PCR technology for 2 months， 3 months and 4 months age of Hainan native goat for testing， The results showed that， the GDF-8 gene mRNA expression level in heart was the highest in months 3， and then in liver. The expression level of the five tissues in months 2 and months 4 was very low， especially， the heart tissue in months 2 and months 4 almost have no expression. The expression pattern of liver and fat in the three stage was： months 4>months 2>months 3， the expression differences among the three stages was very significantly（P<0.05）. The expression pattern of heart， kidney and skeletal muscle in the three stages was： months 3> months 4>months 2， the expression differences of kidney among the three stages was very significantly（P<0.05）， the expression differences of heart and skeletal muscle was not significant between months 2 and months 4.

Key words GDF-8 ；mRNA expression ；SYBR green real-time PCR ；goat

動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育是受基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜過程，取決于相關(guān)基因在不同發(fā)育階段、不同肌肉組織細(xì)胞中的特異性差異表達(dá)。肉質(zhì)性狀是畜禽動(dòng)物的重要經(jīng)濟(jì)性狀， 而GDF-8基因是與動(dòng)物的肉質(zhì)性狀密切相關(guān)的候選基因，對(duì)肌肉的生長(zhǎng)起負(fù)調(diào)控作用，又被命名為肌肉生長(zhǎng)抑制素基因。近年來的研究結(jié)果表明，GDF-8基因除了對(duì)肌肉生長(zhǎng)具有負(fù)調(diào)控作用外，對(duì)其他的生理功能具有一定的調(diào)理作用，如對(duì)動(dòng)物的脂肪沉積、肌蛋白的合成與分解、骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育等都具有一定的調(diào)控。Kambadur等[1]發(fā)現(xiàn)該基因的突變導(dǎo)致處于同一條件下飼養(yǎng)的雙肌牛和普通牛，兩者的肉質(zhì)差異非常大，前者肉質(zhì)要比后者好1.3倍。whittemore等[2]將GDF-8抗體注射到成年鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)該成年鼠的骨骼肌出現(xiàn)驟增的情況。GDF-8基因作為一種肌肉生長(zhǎng)負(fù)調(diào)控因子，在畜牧生產(chǎn)中具有一定的實(shí)踐意義，研究GDF-8基因的表達(dá)或影響其表達(dá)產(chǎn)物活性等，對(duì)畜禽肌肉生長(zhǎng)的調(diào)控、肌肉品質(zhì)改善等具有重要意義，可大大提高畜禽的瘦肉產(chǎn)量，提高經(jīng)濟(jì)效益。海南黑山羊是中國(guó)熱帶地區(qū)優(yōu)良的地方山羊品種，長(zhǎng)期經(jīng)熱帶地區(qū)自然生態(tài)環(huán)境的影響，形成獨(dú)特的品種特性和生態(tài)特性，在海南各市縣均有分布。其肉用性能好、耐高溫高濕、抗病力強(qiáng)、耐粗飼、是中國(guó)熱區(qū)規(guī)?；】叼B(yǎng)殖的寶貴品種資源。筆者以同等條件下飼養(yǎng)的海南黑山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，探索GDF-8基因在山羊肝臟、心臟、腎臟、脂肪和骨骼肌中的表達(dá)規(guī)律，不僅為GDF-8基因在山羊不同組織中的表達(dá)規(guī)律提供科學(xué)的遺傳學(xué)資料，同時(shí)，對(duì)海南黑山羊的良種保留與繁育以及肉品質(zhì)的改善提供一定的借鑒依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所實(shí)驗(yàn)羊場(chǎng)的海南黑山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，選擇在相同營(yíng)養(yǎng)水平，相同飼養(yǎng)環(huán)境下喂養(yǎng)的2月齡、3月齡和4月齡的公羊各3只屠宰，屠宰后取肝臟、心臟、腎、脂肪和骨骼肌，用錫紙包好投入液氮中待用。

1.1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒（Maxwell 16 Total RNA Purification Kit）購(gòu)自普洛麥格公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自大連寶生物有限公司，移液槍、槍頭、瓊脂糖和Marker2000等購(gòu)自?？诠馔镉邢薰?。核酸提取儀Maxwell 16（Promega公司），eppendorf實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（?？诠馔镉邢薰荆?，B-iometra PCR儀（德國(guó)德國(guó) Biometra公司），凝膠成像系統(tǒng)（法國(guó)Vilber）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

各組織總RNA按照試劑盒說明進(jìn)行。提取的RNA分別利用濃度為0.8 %的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度和濃度，再將其稀釋，4 ℃保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄體系為：Oligo dT Primer（50 pmol/L）1.0 μL，終濃度20 pmol，5×prime ScriptTM Buffer（實(shí)時(shí)）20 μL，終濃度1 pmol，Prime ScriptTM RT Enzyme Mix I 1 μL， Random 6 mers （0.1 mm）1 μL，終濃度0.05 nmol，Total RNA 1 μL，Rnase Free ddH2O到15 μL。反應(yīng)條件：37 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85 ℃反轉(zhuǎn)錄5 s。反應(yīng)結(jié)束后，加入70 μL的RNaseFree ddH2O，混合，-30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物合成

在GenBank查詢已知的序列為參照，用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件優(yōu)化生成評(píng)分最高的引物序列送至上海生物工程科技有限公司進(jìn)行合成，引物序列詳見表1。

1.2.3 定量PCR反應(yīng)

反應(yīng)體系24 μL，其中SYBR Premix Ex TaqTM12 μL、引物（10 umol/L）1 μL、cDNA模板2 μL、ddH2O 10 μL，95℃預(yù)熱30 s，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性5 s；56.8 ℃退火20 s；72 ℃ 15 min，43個(gè)循環(huán)。最后以擴(kuò)增曲線和溶解曲線為依據(jù)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用2-△△Ct度量法對(duì)GDF-8基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算，參照Winer等[3]的方法。將β-Actin作為內(nèi)參基因，針對(duì)目的基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校準(zhǔn)。再依托SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 GDF-8基因在不同月齡階段5種組織中的表達(dá)差異

GDF-8基因在山羊不同生長(zhǎng)時(shí)期5種組織中的mRNA表達(dá)變化見圖1。結(jié)果顯示，在2月齡山羊肝臟、心臟、骨骼肌等部位中，GDF-8基因的mRNA表達(dá)量處于低水平狀態(tài)，且各種組織間的表達(dá)量差異極顯著（p<0.01），表達(dá)模式為：肝臟>腎臟>骨骼肌>脂肪>心臟，該基因在2月齡的心臟組織中幾乎不表達(dá)。3月齡時(shí)，該基因在腎臟、心臟和骨骼肌里的表達(dá)量極顯著升高，且3月齡時(shí)，該基因在心臟里的表達(dá)量最高，其次是腎臟和骨骼肌，在肝臟和脂肪組織中表達(dá)量極低，幾乎不表達(dá)，表達(dá)模式為：心臟>腎臟>骨骼肌>肝臟>脂肪。4月齡時(shí)，該基因在各種組織中的表達(dá)量又極顯著下降，特別是心臟組織中的表達(dá)量又下降到最低水平，幾乎不表達(dá)，但是在脂肪和肝臟組織中的表達(dá)量卻明顯上升，骨骼肌和腎臟組織中的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，表達(dá)模式為：脂肪>骨骼肌>腎臟>肝臟>心臟。

2.2 GDF-8基因在同一種組織、不同月齡段的mRNA表達(dá)發(fā)育性變化

GDF-8基因在山羊同一種組織、不同月齡段的mRNA表達(dá)變化見圖2。結(jié)果顯示，該基因在腎臟組織中的表達(dá)模式為：3月齡>4月齡>2月齡，各月齡之間表達(dá)差異顯著；在肝臟中的表達(dá)模式為：4月齡>2月齡>3月齡，各月齡之間表達(dá)差異顯著；在心臟中的表達(dá)模式為：3月齡>4月齡>2月齡，2月齡和4月齡的表達(dá)不顯著；在脂肪中的表達(dá)模式為：4月齡>2月齡>3月齡，各月齡之間表達(dá)差異顯著；在骨骼肌中的表達(dá)模式為：3月齡>4月齡>2月齡，2月齡和4月齡表達(dá)差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

GDF-8基因在哺乳動(dòng)物發(fā)育期和成年期的骨骼肌中廣泛表達(dá)。近年來，人們?cè)诓煌锓N的各種組織中也開展了廣泛的研究，Ji等[4]對(duì)豬的研究發(fā)現(xiàn)，GDF-8基因主要在骨骼肌中表達(dá)，在心臟、脂肪、骨髓、乳腺、肺、腦、舌、小腸、腎臟和肝臟中也有少量表達(dá)。在家禽中，除在骨骼肌和心肌中表達(dá)外，在腦、腸和脾臟中也有少量表達(dá)。胡蘭等[5]選取了大骨雞為研究對(duì)象，對(duì)其各組織中GDF-8基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析可知，在大骨雞所有組織中，尤以骨骼肌GDF-8基因表達(dá)水平最高，其次為腎臟、心肌等組織。但在肺臟和肝臟中卻沒有發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)。楊家大[6]等對(duì)貴州山羊的研究揭示，GDF-8基因在背最長(zhǎng)肌和心等組織中的表達(dá)處于低水平狀態(tài)；與心肌相比，半膜肌和背最長(zhǎng)肌中GDF-8基因的表達(dá)水平較高，表達(dá)模式為肝和皮下脂肪>腎和肺>半膜肌。張銳等[7]研究結(jié)果表明，在豬的所有組織中，只有骨骼肌和心肌存在GDF-8基因表達(dá)，其他組織并無發(fā)現(xiàn)。 Kubota等[8]選取了雞胚為研究對(duì)象，對(duì)其心臟、腎、骨骼肌和肝臟組織中GDF-8基因的表達(dá)進(jìn)行分析，根據(jù)其分析結(jié)果可知，前3種組織均存在GDF-8基因表達(dá)，而肝臟組織則并無發(fā)現(xiàn)。尹闊等[9]選取了綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)其各組織GDF-8基因的表達(dá)進(jìn)行分析，分析結(jié)果顯示，無論是卡拉庫(kù)爾羊還是和田羊，其心臟和肺臟均沒有發(fā)現(xiàn)GDF-8基因表達(dá)，在其心臟、腎臟等組織中均存在GDF-8基因表達(dá)。梁婧嫻等[10]選取了綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)其各組織GDF-8基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，根據(jù)其分析結(jié)果可知，在綿羊的所有組織中，只有腿肌存在GDF-8基因表達(dá)。王娜等[11]通過對(duì)雞的各個(gè)組織進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，在雞的骨骼肌中存在大量的GDF-8基因表達(dá)，在其心臟也有少量的表達(dá)，這些學(xué)者還指出，脂肪組織、肺臟、腎臟等組織中GDF-8基因的表達(dá)微乎其微。祖玲玲等[12]通過研究后發(fā)現(xiàn)，GDF-8基因在1-4月齡的哈薩克羔羊肌肉組織中mRNA表達(dá)量均無顯著性差異，略微呈上升趨勢(shì)，5月齡達(dá)到最高峰，6月齡迅速下降。管凇[13]對(duì)2月齡、3月齡、4月齡和12月齡的海南黑山羊腰肌、背肌和腿肌進(jìn)行研究結(jié)果表明，GDF-8基因在背肌里的表達(dá)量最高，腿肌里的表達(dá)量較低。潘英樹等[14]對(duì)鵝的研究結(jié)果表明，在鵝的心臟、肝臟、骨骼肌等組織中都存在GDF-8基因表達(dá)。祖玲玲[15]等通過研究后發(fā)現(xiàn)，在也木勒白羊的各個(gè)生長(zhǎng)階段中，尤以3個(gè)月大的也木勒白羊肌肉中GDF-8基因的表達(dá)水平最低，其他生長(zhǎng)階段均持平；在0月齡脂肪中表達(dá)量相對(duì)較低，表達(dá)水平會(huì)隨著生長(zhǎng)階段的遞增而提升，直到生長(zhǎng)到5月齡以后，表達(dá)量又會(huì)隨著生長(zhǎng)階段的遞增而下降。本研究結(jié)果顯示，GDF-8基因在在海南黑山羊2月齡的肝臟、心臟、腎臟、脂肪和骨骼肌中的mRNA表達(dá)量較低，且各種組織間的表達(dá)量差異顯著，在2月齡的心臟組織中幾乎不表達(dá)。3月齡時(shí)，該基因在腎臟、心臟和骨骼肌里的表達(dá)量顯著升高，且3月齡時(shí)，該基因在心臟里的表達(dá)量最高，其次是腎臟和骨骼肌，表達(dá)水平最低的是肝臟和脂肪組織，表達(dá)量微乎其微，生長(zhǎng)到4月齡時(shí)，GDF-8基因在各種組織中的表達(dá)量又顯著下降，特別是心臟組織中的表達(dá)量又下降到最低水平，幾乎不表達(dá)，但是在脂肪和肝臟組織中的表達(dá)量卻明顯上升，骨骼肌和腎臟組織中的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。目前而言，GDF-8基因在不同物種的不同組織中的表達(dá)規(guī)律參差不齊，沒有固定的模式；同一個(gè)物種也受飼養(yǎng)條件、不同生長(zhǎng)階段采集的樣品、實(shí)驗(yàn)誤差等影響，造成結(jié)論不一。關(guān)于GDF-8基因?qū)θ赓|(zhì)性狀的調(diào)控機(jī)制需要更多試驗(yàn)樣本進(jìn)行更廣泛更系統(tǒng)的研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為揭示山羊GDF-8基因更多生理功能提供一定的參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Kambadur R， Sharma M，Smith T P， et al.Mutationsin GDF-8（GDF8）in double-muscled Belgian Blue and Piedmontese cattle[J].Genome Research，1997，7（9）：910-916.

[2] Whittemore L A ，Song K， Li X ， et al.Inhibition at myostation in adult mice increases skeletal muscle mass and strength[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2003 ，300（4）：965-971.

[3] Winer J， Jung C K， Shackel I， et al. Development and validation of real-time quantitative reverse tran-Scriptase-polymerase chain reaction for monitoring gene expression in cardiac myocytes in vitro[J].Anal Biochem，1999，270（1）：41-49.

[4] Ji S， Losinski R L， Cornelius S G， et al. Myo-statin expression in porcine tissues： Tissuepecificity and developmental and postnatalregulation[J].American journal of physiolo-gy， 1998， 275（4）：1 265-1 273.

[5] 胡 蘭，郭東新，胡 銳，等. 大骨雞中MSTN基因表達(dá)規(guī)律性的研究[J].動(dòng)物科學(xué)，2003，11（101）：42-44.

[6] 楊家大，彭 舒. 貴州地方山羊品種肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的表達(dá)差異[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，31（2）：369-375.

[7] 張 銳，孫美榕，張紅蓮，等. 豬各組織器官內(nèi)肌生成抑制素基因mRNA表達(dá)譜的研究[J]. 中國(guó)獸藥雜志，2004，38（3）：16-18.

[8] Kubotak，Satof，Aramakis，et al.Ubiquitous expression of GDF-8 in chicken embryonic tissues： its high expression in testis and ovary[J].Comparative Biochemistry and Physiology-PartA： Molecular & Integrative Physiology，2007，148（3）：550-555.

[9] 尹 闊，任述強(qiáng)，徐國(guó)江，等. 南疆不同品種綿羊MSTN基因克隆及其組織表達(dá)譜分析[J].塔里木大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，23（2）1-7.

[10] 梁婧嫻，陳志成，鄭玉才，等. 藏系綿羊MSTN基因在不同年齡不同組織的表達(dá)定量研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（17）：10 454-10 457，10 493.

[11] 王 娜，胡 蘭，劉 梅，等.海蘭雞MSTN基因的表達(dá)檢測(cè)[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2005（2）：25-26.

[12] 祖玲玲，姚力丹，依 明，等. MSTN基因在1-6月齡哈薩克羔羊肌肉組織中表達(dá)量及其與生長(zhǎng)指標(biāo)相關(guān)性分析[J] 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2016，43（2）：487-489.

[13] 管 凇，周漢林，王東勁，等.海南黑山羊MSTN基因的表達(dá)差異與發(fā)育性變化研究[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，34（11）：15-19.

[14] 潘英樹，張永宏，郭麗君，等.朗德鵝肌生成抑制素基因組織分布研究[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2008，35（5）：45-47.

[15] 祖玲玲，吐來力江·哈木太，安外爾·熱合曼，等. 新疆也木勒白羊肌肉生長(zhǎng)抑制素基因在不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)研究[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)， 2014，12（41）：98-101.