韓 斌 葛東梅 劉培燕 馮智慧

?個例報告?

ABO抗體缺失致血型鑒定困難1例*

韓 斌 葛東梅 劉培燕 馮智慧

ABO血型 抗體缺失 血型血清學(xué) 基因分型

ABO抗體是人類最重要的天然抗體，是一些類似A或B抗原的非特異抗細菌物質(zhì)和免疫系統(tǒng)自我調(diào)節(jié)的產(chǎn)物[1]。在臨床常規(guī)ABO血型鑒定過程中，正、反定型不符造成血型鑒定困難的案例時有報道，ABO抗體減弱或缺失為原因之一。近期對1例血標本進行血型鑒定時，發(fā)現(xiàn)正、反定型不符，最終證實是由ABO抗體缺失所致，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

1 病例簡介 男性，44歲，否認既往輸血史，因咽部腫物于醫(yī)院耳鼻喉科就診，臨床輸血科手術(shù)備血時發(fā)現(xiàn)ABO正、反定型不符，遂送至本實驗室進一步鑒定。

2 試劑與儀器 單克隆抗-A與抗-B（荷蘭Sanquin，批號8000176548，8000169003）； ABO反定型試劑紅細胞（上海血液醫(yī)藥生物有限責(zé)任公司，批號20145337）；人源多克隆抗-A、抗-B（效價128，成都協(xié)和生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號20140714）；DNA提取試劑盒（Invirtrogen公司）；ABO 基因分型試劑盒（天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；Exon6、7直接測序引物由TaKaRa公司合成。全自動DNA序列分析儀（3100-Avant，ABI公司），電泳儀（PAC300，Bio-Rad公司），離心機（KA2200，KUBOTA公司），PCR擴增儀（C1000，Bio-Rad公司）。

3 血清學(xué)試驗 ABO正、反定型采用試管法。

4 吸收放散試驗 患者紅細胞洗滌后制備紅細胞壓積，與等量人源抗-B血清混合，4℃充分吸收，吸收后的紅細胞用4℃生理鹽水洗滌3次，置56℃放散。放散液與標準試劑B細胞未發(fā)生凝集及溶血反應(yīng)，提示患者紅細胞無B抗原存在。

5 DNA提取 采用DNA提取試劑盒，按照說明書進行DNA提取。

6 ABO基因分型 按照天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供的ABO-SSP試劑盒說明書進行操作。

7 ABO基因第6、7外顯子直接測序 引物序列參考Olsson ML等設(shè)計的引物[2]：

Exon6：Forward：5'-CGGAATTCACTCGCCACTG CCTG G GTCTC-3'；Reverse5'-CGGGATCCATGTGGGTGGC ACCCT GCCA-3'；Exon7：Forward：5'-CGGGATCCCCGTCCGCCTG CTTG CAG-3'；Reverse：5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3'。

PCR擴增反應(yīng)體系：dNTP 各400 μmol/L，模板DNA 500 ng，每條引物0.1 μmol/L，Taq酶3 U，Mg2+2.5 μmol/L，最終反應(yīng)體系為50 μl。

PCR擴增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；94℃ 60 s、63℃ 90 s、72℃ 60 s，進行10個循環(huán)；94℃ 60 s、61℃90 s、72℃ 60 s，進行25個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，對目的片段進行純化，使用ABI3100-AvantDNA序列分析儀進行序列分析。

結(jié) 果

1 血清學(xué)檢測結(jié)果見表1。經(jīng)血清學(xué)試驗（試管法）發(fā)現(xiàn)，在室溫及4℃時，肉眼及顯微鏡觀察均顯示其ABO正定型均

為O型，反定型為B型。血清加倍后，與ABO試劑紅細胞反應(yīng)，ABO反定型結(jié)果仍為B型。標本紅細胞吸收人源抗-B血清后進行放散，放散液與試劑B細胞仍呈陰性反應(yīng)。

2 ABO基因分型結(jié)果 基因分型檢測結(jié)果顯示，此例標本為基因型為O2/O2。見圖1。

3 直接測序分析 此例標本Exon 6表現(xiàn)為261G缺失、297G/G，Exon7表現(xiàn)為646A/A、681A/A、771T/T、829A/ A，完全符合O102/O102序列特征。

表1 血清學(xué)檢測結(jié)果

圖1 ABO-基因PCR-SSP電泳圖

討 論

ABO血型系統(tǒng)的抗體屬于天然抗體，一般情況下，ABO系統(tǒng)中的抗-A、抗-B最早可以在3個月大的嬰兒體內(nèi)檢出，以后效價持續(xù)增高，約5～10歲時達到成人水平，老年人體內(nèi)抗-A、抗-B水平較青年時期低[3]。ABO抗體的存在具有一定的規(guī)律，即幾乎所有缺乏某種抗原的個體，其血清中必然存在針對所缺乏抗原的抗體[4]。在某些疾病狀態(tài)，如低丙種球蛋白血癥、惡性腫瘤、造血干細胞移植、長期接受免疫抑制劑以及大量輸液等情況下，會出現(xiàn)ABO抗體減弱或消失，導(dǎo)致血型鑒定困難。

本例標本的血清學(xué)試驗結(jié)果顯示，正定型時患者紅細胞與抗-A、抗-B均不凝集，反定型時患者血清與試劑A細胞發(fā)生強凝集，與試劑B細胞不凝集。首先考慮紅細胞上抗原減弱，為此進行了B抗原的吸收放散試驗，結(jié)果未檢出B抗原。其次考慮血清中抗體減弱，遂將反定型中血清加倍并置于4℃，但結(jié)果未發(fā)現(xiàn)患者血清與試劑B細胞有凝集。為確定此例標本的ABO血型，我們進行了深入的分子生物學(xué)研究，通過ABO基因分型及測序試驗，結(jié)合血清學(xué)的試驗結(jié)果，考慮此例標本為抗-B抗體缺失，確定其ABO血型為O型。據(jù)文獻報道，在ABO抗體減弱的患者中，抗-B減弱比抗-A減弱者多1倍以上，這可能是由于紅細胞上B抗原相對A抗原更弱所致[5]。

綜上所述，在臨床進行ABO血型鑒定時，必須嚴格進行正、反定型。當出現(xiàn)正、反定型不符時，要判斷是ABO亞型還是由于疾病導(dǎo)致的抗原、抗體減弱，必要時需進行進一步的分子生物學(xué)試驗，正確定型，保證臨床輸血安全。

1 喻瓊，蘇宇清，梁延連，等.天然ABO抗體缺失的分子機制研究[J]. 國際輸血及血液學(xué)雜志，2010，33（6）：492-495.

2 Olsson ML，Irshaid NM，Hossein-manf B，et al. Genomic analysis of clinical samples with serologic ABO blood grouping discrepancies： identification of 15 novel A and B subgroup alleles[J]. Blood，2001，98（5）：1585.

3 杰夫?丹尼爾. 人類血型[M]. 第2版. 北京：科學(xué)出版社，2007：59-60.

4 遲曉云，譚海艷，馮智慧，等. ABO疑難血型3步分析法鑒定抗體極度減弱致血型鑒定困難1例[J]. 中國輸血雜志，2013，26（10）：1036-1037.

5 金沙，向東，劉曦，等. 疾病導(dǎo)致ABO 血型抗原及抗體減弱的分析[J]. 臨床輸血與檢驗，2010，12（1）：61-62.

R457.1+1 R392.11

B

1671-2587（2017）02-0201-02

2016-08-29）

（本文編輯：姚萍）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.02.032

*本課題受山東省青島市市南區(qū)科技發(fā)展資金項目（No.2013-13-013-YY）和青島醫(yī)療衛(wèi)生優(yōu)秀人才培養(yǎng)項目資助。

266071 山東省青島市中心血站輸血醫(yī)學(xué)研究所（韓斌，劉培燕，馮智慧）；青島大學(xué)附屬醫(yī)院輸血科（葛東梅）

韓斌（1985–）男，山東平度人，技師，碩士，主要從事血液免疫學(xué)及輸血技術(shù)學(xué)工作，（E-mail）qdhanb@163.com。

馮智慧，碩士，主要從事免疫血液學(xué)及免疫遺傳學(xué)研究，（E-mail）qd_hla@163.com。