邱秀文，周桂香，3，*，王慧娟，楊麗麗

(1.九江學院 鄱陽湖生態(tài)經(jīng)濟研究中心，江西 九江 332005； 2.九江市流域管理與生態(tài)保護重點實驗室(九江學院)， 江西 九江 332005； 3.土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室/中國科學院 南京土壤研究所，江蘇 南京 210008； 4.九江學院 化學與環(huán)境工程學院，江西 九江 332005)

纖維素分解菌的分離篩選及其對秸稈的分解特性

邱秀文1，2，周桂香1，2，3，*，王慧娟4，楊麗麗4

(1.九江學院 鄱陽湖生態(tài)經(jīng)濟研究中心，江西 九江 332005； 2.九江市流域管理與生態(tài)保護重點實驗室(九江學院)， 江西 九江 332005； 3.土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室/中國科學院 南京土壤研究所，江蘇 南京 210008； 4.九江學院 化學與環(huán)境工程學院，江西 九江 332005)

從秸稈還田土壤中分離純化出1株高效纖維素分解菌JJU-A，經(jīng)形態(tài)觀察和ITS分子序列分析，鑒定該菌為白耙齒菌(Irpexlacteus)。將JJU-A接種至玉米秸稈培養(yǎng)30、60、90 d后測定秸稈化學組成及官能團變化。結(jié)果表明，JJU-A菌對玉米秸稈中纖維素、半纖維素及可溶性糖的分解利用率遠高于木質(zhì)素，其中，纖維素、半纖維素和可溶性糖的降解率分別達53.60%、58.89%和76.03%，而木質(zhì)素的降解率僅為28.61%。采用傅里葉紅外光譜法(FTIR)分析秸稈中主要化學官能團的變化。由光譜數(shù)據(jù)分析可知，隨著降解的進行，秸稈樣品在1 046、1 245、1 335、1 603、2 900和3 383 cm-1吸收峰信號強度明顯降低，秸稈中C=C、C=O、—CH3、—CH的含量逐漸降低，暗示纖維素、半纖維素、糖類及脂肪族化合物被大量分解。以上結(jié)果說明，白耙齒菌JJU-A可以有效提高秸稈的降解效率，加快秸稈資源化利用。

紅外光譜；降解過程；玉米秸稈；纖維素

我國每年產(chǎn)生的農(nóng)作物秸稈近9億t，其中玉米秸稈2.2億t[1]。農(nóng)作物秸稈是自然界蘊藏最豐富的有機資源，可作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的肥料來源[2-4]。秸稈還田是綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)的重要措施，能有效增加土壤有機質(zhì)含量，提升土壤地力，對于維持農(nóng)田肥力和減少化肥施用具有積極作用[5-7]。同時，秸稈還田是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)的重要組成部分，秸稈的利用方式影響著農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)土壤碳儲量[8]。秸稈降解研究已成為當前土壤學和地球化學等領域的熱點之一。

秸稈中的主要有機成分包括木質(zhì)素、可溶性糖、纖維素、半纖維素及脂類等[9]。土壤微生物是秸稈降解的主要驅(qū)動者，在降解過程中發(fā)揮了重要作用[10-11]。有研究表明，纖維素分解菌對農(nóng)田秸稈降解過程及降解速率有直接影響[12-13]。在自然狀態(tài)下，秸稈中纖維素類物質(zhì)的降解率不高，如何利用纖維素分解菌加速其降解過程成為當前亟待解決的問題。本研究從長期玉米秸稈還田的土壤中篩選出1株高效纖維素降解真菌，對其進行形態(tài)學及分子生物學鑒定，并對其降解秸稈的效果進行研究，以期為提高玉米秸稈利用率提供優(yōu)質(zhì)的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土壤樣品采集于中國科學院封丘農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗站，采集的土壤樣品置于4 ℃冰箱條件下保存，備用。

以夏玉米秸稈為底物。秸稈采自中國科學院封丘農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗站，秸稈采樣時間為2015年10月。試驗前將秸稈用蒸餾水清洗3次，于80 ℃條件下烘干至質(zhì)量恒定，剪成1～2 cm小段備用。

富集培養(yǎng)基： KCl 0.5 g、NaNO30.5 g、Fe2(SO4)3·7H2O(先配成1%的母液，然后再取1 mL)、K2HPO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蒸餾水1 000 mL。

篩選培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 15.0 g、CaCl20.5 g、MgS04·7H20 0.5 mg、CoCl2·6H2O 3.7 mg、KH2PO41.0 g、尿素0.5 g、瓊脂20 g、(NH4)2SO40.5 g、MnSO4·H2O 2.5 mg、ZnSO4·7H2O 3.6 mg、FeSO4·7H2O 7.5 g、蒸餾水1 000 mL。

鑒別培養(yǎng)基(CMC-剛果紅培養(yǎng)基)：瓊脂20 g、CMC-Na 20 g、MnSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、KH2PO41.0 g、剛果紅0.4 g、(NH4)2SO42.0 g、蒸餾水1 000 mL。

秸稈固體培養(yǎng)基：將玉米秸稈自然風干，剪成長度1～2 cm的小段，按250 g·L-1的比例加入MS鹽溶液，滅菌備用。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min 后使用。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離篩選

將采集的土壤樣品混合均勻后，稱取10 g土壤樣品加入到裝有90 mL無菌水的錐形瓶中，制成懸浮液，靜置5 min，量取2 mL上清液至裝有18 mL液體富集培養(yǎng)基的試管中，將濾紙條(長6 cm，寬1 cm)也放入試管，使其稍浸入培養(yǎng)基液面，置于28 ℃的培養(yǎng)箱中富集培養(yǎng)，連續(xù)富集3次后，采用羧甲基纖維素鈉平板法和剛果紅染色法[14]篩選具有纖維素分解能力的菌株。

1.2.2 菌株鑒定

將獲得的菌株培養(yǎng)7 d，制片，在顯微鏡(400×)下觀察并拍照，觀察纖維素分解菌菌落及菌體形態(tài)特征，參照《微生物分類學》[15]對菌株作進一步鑒定，參照蘆光新等[16]對菌株進行分子鑒定。

1.2.3 秸稈分解研究

將纖維素分解菌分別接種到牛肉膏培養(yǎng)基中， 在170 r·min-1、37 ℃條件下培養(yǎng)2 d后離心(5 000 r·min-1、4 ℃)，利用PBS溶液清洗菌體多次，最后用PBS溶液調(diào)整菌體D600值至1.0。按照20 g·L-1的接種量將菌株分別接種到秸稈培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)，并注意保持固體培養(yǎng)基的含水率，分別在試驗1、2、3個月進行采樣。參照Ververis 等[17]測定秸稈樣品纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量。

1.2.4 秸稈紅外光譜分析

將玉米秸稈樣品置于65 ℃烘箱中烘干至質(zhì)量恒定，用KBr壓片法在傅里葉變換紅外光譜儀上測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素分解菌的形態(tài)

分離到的菌株的形態(tài)如圖1所示。菌落以中間接種的原菌落為中心向外蔓延，呈圓形生長。菌株整體為白色，部分呈現(xiàn)淺紫色，呈蓬松狀，濕潤，光澤性好，靠外部的菌絲較為濃密，菌絲較長，分生孢子呈圓形或橢圓形，無氣味。命名為JJU-A。

2.2 纖維素分解菌的分子生物學鑒定

以JJU-A菌株基因組DNA為模板，利用真菌ITS通用引物(ITS-1，ITS-4)進行PCR擴增，測序后，將獲得的ITS序列與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)庫序列進行Blast分析，采用Clustal軟件進行多重序列比對。選取相似序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖2)。結(jié)果顯示，JJU-A菌株與IrpexlacteusKUC9124(JX290578.1)同源性最高。通過對該菌生長狀況及形態(tài)的觀察，結(jié)合分子鑒定，確定該菌為白耙齒菌(Irpexlacteus)。

A，菌株的菌落特征；B，菌株放大400倍的顯微照片A， Colony morphology；B, Microphotograph， ×400圖1 菌株形態(tài)特征Fig.1 Morphology characteristic of strain JJU-A

圖2 菌株JJU-A的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain JJU-A

2.3 纖維素分解菌的生長曲線

由圖3可知，白耙齒菌JJU-A在接種1 d后即進入生長期，生長速率較快，菌落直徑隨時間增加直線上升，直至菌落直徑達到最大值9 cm。7 d后，菌體生長達到穩(wěn)定期，菌體直徑基本保持在9 cm。

2.4 JJU-A的秸稈降解特性

2.4.1 秸稈降解率

將分離獲得的纖維素分解菌JJU-A接種到玉米秸稈培養(yǎng)基上，進行秸稈降解試驗。如圖4所示，接種白耙齒菌JJU-A后，秸稈降解率從接種開始至30 d呈快速上升趨勢，降解率達到30%，此后，秸稈降解率增加幅度相對減小，試驗90 d后玉米秸稈降解率為45%。

圖3 纖維素分解菌生長曲線Fig.3 Growth curve of strain JJU-A

圖4 玉米秸稈降解率動態(tài)變化Fig.4 Dynamic change of decomposition rate of maize straw

2.4.2 秸稈纖維素類及糖類物質(zhì)含量變化

在接種白耙齒菌JJU-A 30 d后，玉米秸稈中纖維素降解率達到31.48%，隨后纖維素含量緩慢降低，纖維素含量從30 d時的28.66%下降到13.28%，降解率超過50%(圖5)。

在整個降解過程中，自接種白耙齒菌JJU-A后，半纖維素的百分含量隨著降解時間的延長大幅降低：接種30 d后，半纖維素含量為34.66%；降解60 d后，半纖維素含量降至27.41%；至90 d，半纖維素含量降低至14.23%，此時半纖維素降解率達到58.89%(圖6)。

木質(zhì)素是秸稈中難降解的成分，所以玉米秸稈中木質(zhì)素的相對百分含量在整個試驗期間變化不大。玉米秸稈在接種白耙齒菌JJU-A培養(yǎng)30 d后，秸稈中木質(zhì)素的含量從11.97%降為9.73%，之后JJU-A對木質(zhì)素的降解效果減弱，至90 d，玉米秸稈中木質(zhì)素含量降至8.51%，降解率為28.61%(圖7)。

圖5 玉米秸稈纖維素含量變化Fig.5 Dynamic change of decomposition rate of cellulose

圖6 玉米秸稈半纖維素含量變化Fig.6 Dynamic change of decomposition rate of hemicellulose

圖7 玉米秸稈木質(zhì)素含量變化Fig.7 Dynamic change of decomposition rate of lignin

如圖8所示，玉米秸稈在接種白耙齒菌JJU-A培養(yǎng)30 d后，秸稈中可溶性糖的降解率接近60%?？梢钥闯?，在降解前期，白耙齒菌JJU-A對可溶性糖的分解利用遠高于其對纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的分解，這說明JJU-A在接種后可充分利用玉米秸稈中的可溶性糖作為能源物質(zhì)迅速繁殖。這有利于其在短時間內(nèi)繁殖出足夠的菌數(shù)以啟動其對纖維素類等難分解物質(zhì)的降解。

2.4.3 秸稈紅外光譜分析

圖8 玉米秸稈可溶性糖含量變化Fig.8 Dynamic change of decomposition rate of soluble saccharide

0，降解前；1，降解30 d；2，降解60 d；3，降解90 d0， Before decomposition; 1， 30 d after decomposition; 2， 60 d after decomposition; 3， 90 d after decomposition圖9 玉米秸稈紅外光譜圖Fig.9 FTIR spectrogram of maize straw degraded by strain JJU-A

3 討論

本研究從秸稈還田土壤中分離篩選出1株高效纖維素分解菌，命名為JJU-A，經(jīng)形態(tài)學鑒定和ITS分子序列分析，確定該菌株為白耙齒菌(Irpexlacteus)。通過常規(guī)化學法分別測定玉米秸稈中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和可溶性糖的含量，接種白耙齒菌JJU-A(IrpexlacteusJJU-A)降解30 d后，玉米秸稈中纖維素、半纖維素及可溶性糖的降解率遠高于木質(zhì)素，其中纖維素、半纖維素和可溶性糖的降解率分別達53.60%、58.89%和76.03%，而木質(zhì)素的降解率為28.61%。

目前，有關微生物在秸稈或凋落物降解方面的研究較多。劉海靜等[18]采用減重法測定秸稈降解率，結(jié)果表明，從接種開始至兩個月，接種糞產(chǎn)堿菌DG75B(Alcaligenesfaecalis)、蠟狀芽孢桿菌 LYZ22(Bacilluscereus)的秸稈降解率分別為31.12%、24.42%。本研究結(jié)果顯示，當接種白耙齒菌JJU-A 60 d時，秸稈降解率達38.75%，降解效果更優(yōu)。張偉等[19]采用常規(guī)質(zhì)量分析法測定了白耙齒菌(Irpexlaxteus)對沈陽地區(qū)20種常用園林樹木枝條的降解能力，結(jié)果表明，在降解90 d時，榆葉梅、稠李和桑樹等的降解率均在50%左右，與本研究結(jié)果極為相近。

在本試驗條件下，秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率最高分別可達53.60%、58.89%和28.61%，相比纖維素、半纖維素的降解率，木質(zhì)素的降解率偏低，這是因為木質(zhì)素結(jié)構(gòu)復雜，難以被降解。以往人們研究降解秸稈木質(zhì)纖維素的微生物多數(shù)局限于單個菌株的純培養(yǎng)，但在自然界中，木質(zhì)纖維素是在多種菌類的共同作用下被分解，從而進入地球碳素循環(huán)。?？×岬萚20]研究了高效纖維素分解菌復合系對稻草秸稈的降解，結(jié)果表明，發(fā)酵12 d后，秸稈中可溶性糖的降解率達到72.91%，而本研究中玉米秸稈降解30 d后可溶性糖降解率僅為55.68%。因此，本課題下一步將開展聯(lián)合菌降解秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的研究。

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(責任編輯 高 峻)

Isolation and scrcening of cellulose degrading bacterium and its decomposition characteristics of straw

QIU Xiuwen1，2， ZHOU guixiang1，2，3，*， WANG Huijuan4， YANG Lili4

(1.PoyangLakeEco-economyResearchCenter，JiujiangUniversity，Jiujiang332005，China; 2.JiujiangKeyLaboratoryofBasinManagementandEcologicalProtection，JiujiangUniversity，Jiujiang332005，China; 3.StateKeyLaboratoryofSoilandSustainableAgriculture/InstituteofSoilScience，ChineseAcademyofSciences，Nanjing210008，China; 4.SchoolofChemistryandEnvironmentalEngineering，JiujiangUniversity，Jiujiang332005，China)

A cellulose-decomposing strain， named JJU-A， was isolated from straw turnover soil. According to morphological observation， biochemical testing and rDNA-ITS gene sequence， the strain JJU-A was identified asIrpexlacteus. A 3-month experiment was carried out with JJU-A inoculated on maize straw， and the decomposition rate and the function groups of the maize straw were determined after 30， 60 and 90 d. It was shown that the decomposition rate of cellulose， hemicelluloses and soluble saccharide was higher than that of lignin， as the decomposition rates of cellulose， hemicelluloses， soluble saccharide and lignin were 53.60% 58.89% 76.03% and 28.61%， respectively. Fourier infrared spectroscopy (FTIR) was used to detect the changes of function groups of maize straw. The relative absorption intensity of 1 046， 1 245， 1 335， 1 603， 2 900 and 3 383 cm-1decreased obviously， and the percentage of C=C， C=O， —CH3， —CH decreased during the decomposition process， indicating that cellulose， hemicelluloses， saccharide and aliphatic compounds were degraded largely. In conclusion， the addition ofIrpexlaxteusJJU-A on maize straw could improve the degradation efficiency of straw and realize the resource utilization of straw.

infrared spectroscopy; decomposition process; maize straw; cellulose

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.18

2016-12-20

國家自然科學基金項目(41661068)；江西省自然科學基金項目(20161BAB214150，20161BAB214152)；土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室開放課題(Y20160010)

邱秀文(1984—)，男，江西贛州人，博士，講師，主要從事環(huán)境微生物研究。E-mail: 334260049@qq.com

*通信作者，周桂香，E-mail: zgx20053227@163.com

S154

A

1004-1524(2017)04-0637-07

浙江農(nóng)業(yè)學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(4): 637-643

邱秀文，周桂香，王慧娟，等. 纖維素分解菌的分離篩選及其對秸稈的分解特性[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報，2017，29(4)： 637-643.