張成玲，孫厚俊，楊冬靜，徐 振，趙永強(qiáng)，謝逸萍

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所， 農(nóng)業(yè)部甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州221131)

中國(guó)甘薯雙生病毒外殼蛋白基因分子變異及遺傳多樣性分析

張成玲，孫厚俊，楊冬靜，徐 振，趙永強(qiáng)，謝逸萍*

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所， 農(nóng)業(yè)部甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州221131)

甘薯雙生病毒是中國(guó)甘薯上一類重要病毒，其外殼蛋白(coat protein，CP)基因具有介體傳毒、基因包被等多功能。揭示其分子變異，可以為病毒防治及育種工作提供理論依據(jù)。利用PCR方法擴(kuò)增獲得了24個(gè)甘薯雙生病毒分離物的cp基因，采用SDT、DnaSP、RDP3、MEGA等軟件對(duì)其進(jìn)行分子變異分析。結(jié)果表明：24個(gè)分離物核苷酸序列均為765個(gè)堿基，一致率為88.3%～100%，編碼254個(gè)氨基酸，一致率為94.5%～100%。中國(guó)甘薯雙生病毒分離物系統(tǒng)進(jìn)化樹分為2個(gè)組，組I包括大部分分離物及本研究獲得的22個(gè)分離物，又分為了2個(gè)亞組；組Ⅱ含有29個(gè)分離物，包括本研究中的XU8_2和XU8_3，這2個(gè)分離物與其他分離物可能為不同的種。非同義突變與同義突變比值大于1，說明cp基因處于正向選擇即多樣化選擇。錯(cuò)配分布圖除亞組1相對(duì)比較平滑外，其余組或亞組分離物均為多峰鋸齒狀，表明除亞組1種群呈突然暴發(fā)的狀態(tài)外，其他組或亞種群已經(jīng)存在很長(zhǎng)時(shí)間，處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。

甘薯雙生病毒；外殼蛋白基因；分子變異；遺傳多樣性

甘薯雙生病毒(Sweetpovirus)可在全球多個(gè)國(guó)家甘薯種植區(qū)發(fā)生危害，尤其是甘薯卷葉病毒(Sweetpotatoleafcurlvirus，SPLCV)[1-4]，是近幾年中國(guó)甘薯的一種重要病毒[5]。甘薯雙生病毒可引起甘薯葉片上卷、黃化等癥狀，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植株矮化，造成甘薯產(chǎn)量損失20%～80%[6]。甘薯雙生病毒基因組多為單組分、環(huán)狀DNA分子，約2.8 kb，編碼6個(gè)開放閱讀框架(ORF)，其中，病毒鏈上2個(gè)，分別為V1和V2，互補(bǔ)鏈上4個(gè)，分別為C1、C2、C3和C4。V1開放閱讀框編碼的蛋白即為病毒的外殼蛋白(coat protein，CP)，約為29.4 ku，位于植物細(xì)胞核內(nèi)[7]，是多功能蛋白，參與了病毒DNA組分包裝、病毒介體傳毒及病毒運(yùn)動(dòng)等[8-10]，常用來進(jìn)行雙生病毒種類鑒定[11]。研究cp基因分子變異及遺傳多樣性，可以為有針對(duì)性地為甘薯雙生病毒檢測(cè)和防治提供理論依據(jù)。目前，已有大量有關(guān)甘薯雙生病毒發(fā)生、基因組分子特性分析、抗體制備等的報(bào)道[5，12-15]。Reynoso[13]通過在大腸埃希菌中表達(dá)SPLCV外殼蛋白，制備了抗體，并利用質(zhì)譜進(jìn)行驗(yàn)證。Arkorful等[15-16]通過觀察病毒侵染甘薯后的癥狀，利用不同分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和PCR技術(shù)檢測(cè)了SPLCV的發(fā)生及危害，并通過莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)獲得了甘薯脫毒苗。Zhang等[17]通過滾環(huán)PCR方法獲得了52個(gè)甘薯雙生病毒全基因組，分為10個(gè)基因型，其中8個(gè)基因型50個(gè)分離物屬于SPLCV；重組分析發(fā)現(xiàn)，SPLCV有2個(gè)重組熱點(diǎn)，分別在復(fù)制起始點(diǎn)和C2與C4 2個(gè)基因之間。Albuquerque等[18]通過對(duì)巴西甘薯雙生病毒遺傳多樣性及重組分析發(fā)現(xiàn)，雙生病毒的重組熱點(diǎn)是在基因間隔區(qū)(intergenic region，IR)和C1開放閱讀框中間區(qū)域，病毒通過重組可產(chǎn)生適應(yīng)性更強(qiáng)的新病毒種類或株系。

盡管已有大量甘薯雙生病毒遺傳多樣性的報(bào)道，但有關(guān)中國(guó)甘薯雙生病毒具體分布及變異情況還不是很清楚，尤其是單個(gè)功能基因如cp基因的分子變異研究較少。本試驗(yàn)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了中國(guó)甘薯雙生病毒分離物的外殼蛋白基因序列，通過一系列分子生物學(xué)軟件，分析了中國(guó)甘薯雙生病毒外殼蛋白基因分子變異及遺傳多樣性，為有針對(duì)性地檢測(cè)和防治甘薯雙生病毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2013—2015年，從江蘇徐州甘薯研究中心品種資源庫及育種苗床隨機(jī)采集葉片上卷、黃化、植株矮化等癥狀的甘薯苗樣品。稱取1 g葉片組織放到2 mL滅菌離心管中，每個(gè)樣品稱取2～3份，編號(hào)后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)Genbank登錄的序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增SPLCV接近全長(zhǎng)基因序列的引物，由生工生物(上海)有限公司合成；DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；TaqDNA聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 基因克隆

利用DNA提取試劑盒提取甘薯樣品總DNA。以總DNA為模板，利用DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系50 μL: 10 × PCR buffer 5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mix 1.5 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O定容到50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，分離回收目的片段，并連接到pMD18-T載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定[19]。陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，每個(gè)分離物選取3～5個(gè)重組子進(jìn)行序列測(cè)定，確定其核苷酸序列。

1.3 數(shù)據(jù)處理

獲得的序列利用SDT(http://web.cbio.uct.ac.za/～brejnev/)及DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)，獲得序列一致率。在NCBI上將獲得的序列進(jìn)行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，并下載相關(guān)序列，利用重組分析軟件RDP3(包含7個(gè)軟件，分別是RDP、GENECONV、BOOTSCAN、MAXCHI、CHIMAERA、3SEQ及SISCAN)進(jìn)行重組分析。利用MEGA 6.0(http://www.megasoftware.net)中的最大簡(jiǎn)約法(maximum likelihood，ML)和鄰接法(neighbour-joining，NJ)對(duì)中國(guó)甘薯雙生病毒構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并分組。利用DnaSP軟件及Composite maximum-likelihood(CML)法[20-21]進(jìn)行多態(tài)性及選擇壓力分析，根據(jù)ω值(非同義突變dN和同義突變dS的比率dN/dS)判斷選擇方向，ω>1，說明為正向(多樣性)選擇，反之，ω<1，為負(fù)向(純化)選擇，ω=1，為中性選擇。

2 結(jié)果與分析

2.1 外殼蛋白基因的克隆

PCR擴(kuò)增后共獲得24個(gè)甘薯雙生病毒分離物，分別為：XU1-3、XU2-1、XU2-3、XU3-1、XU3-17、XU3-18、XU4-2、XU5-3、XU7-2、XU7-3、XU8-2、XU8-3、XU9-1、XU9-2、XU10-6、XU10-11、XU10-12、XU11-2、XU11-3、XU12-2、XU12-4、XU13-1、XU14-2、XU17-5。其完整的外殼蛋白基因核苷酸長(zhǎng)度均為765 bp，編碼254個(gè)氨基酸。SDT及DNAMAN核苷酸兩兩比對(duì)結(jié)果(圖1)表明，24個(gè)分離物的核苷酸一致率為88.3%～100%；氨基酸一致率為94.5%～100%。其中，XU8_3與XU8_2核苷酸和氨基酸一致率最高，均為100%，XU10_6與XU8_3、XU8_2核苷酸和氨基酸一致率最低，分別為88.3%和94.5%。

24個(gè)分離物的氨基酸相對(duì)比較保守，254個(gè)氨基酸共有22個(gè)突變位點(diǎn)，分別為第5位的異亮氨酸I突變?yōu)榧琢虬彼酠，表示為I5M，以此類推，V6P、S8T、R9P、F11Y、R17I、V51(152)A、M53T、R55(56、57)K、V71(108、152)I、K77T、T83S、G115V、N148T、G150A、S189N(A)、I196V、Q220H。其中152(纈氨酸，V)及189(絲氨酸，S)位氨基酸突變?yōu)?種不同氨基酸，分別為異亮氨酸(I)/丙氨酸(A)及天冬氨酸(N)/丙氨酸(A)，其余位點(diǎn)均為2種氨基酸之間突變。非極性氨基酸之間突變位點(diǎn)7處，非極性氨基酸與極性氨基酸之間突變位點(diǎn)有7處，極性氨基酸之間突變位點(diǎn)9處。所有的核苷酸變異均是堿基置換，不存在堿基插入/缺失現(xiàn)象。

2.2 甘薯雙生病毒外殼蛋白基因重組及系統(tǒng)進(jìn)化

將NCBI上登錄的多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的224個(gè)及本研究獲得24個(gè)甘薯雙生病毒分離物的外殼蛋白基因，利用RDP軟件進(jìn)行重組分析，結(jié)果表明，外殼蛋白基因未發(fā)現(xiàn)明確重組，但有3個(gè)分離物出現(xiàn)“暫定的”重組位點(diǎn)，有3個(gè)軟件支持其可能性，且p<10-6，Z>3，3個(gè)分離物均為中國(guó)分離物，而本研究獲得的分離物未發(fā)生重組(表1)。

圖1 二十四個(gè)分離物核苷酸一致率分析Fig.1 Nucleotide sequence identity matrix generated from coat protein gene of 24 isolates

以番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)外殼蛋白基因?yàn)橥鈬?，利用MEGA 6.0軟件NJ及ML法將中國(guó)的101個(gè)分離物構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，甘薯雙生病毒中國(guó)分離物外殼蛋白基因分為2個(gè)組，組Ⅰ和組Ⅱ，其中組Ⅰ分離物包括中國(guó)的大部分分離物，本研究獲得的分離物有22個(gè)屬于組Ⅰ。組Ⅰ又分為2個(gè)亞組，亞組1和亞組2。組Ⅱ含有29個(gè)分離物，來自四川、河南、湖北、江蘇及廣西等地，本研究?jī)H有XU8_2和XU8_3屬于組Ⅱ(圖2)。

2.3 甘薯雙生病毒中國(guó)分離物種群多態(tài)性及選擇壓力分析

為了明確甘薯雙生病毒中國(guó)分離物外殼蛋白基因的變異及其承受的選擇壓力，我們計(jì)算了ω值。結(jié)果表明，該基因dN和dS分別為0.112(標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.008)和0.029(標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.006)，dN/dS為3.86>1，說明該基因處于多樣化選擇，即正向選擇，基因所承受的選擇壓力大。外殼蛋白基因片段的平均核苷酸距離為0.084(標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.006)，表明其多樣性值較高。

外殼蛋白基因的錯(cuò)配分布結(jié)果表明，甘薯雙生病毒分離物cp基因的組及亞組錯(cuò)配分布圖為多峰鋸齒狀(圖3-A，B，D)，表明種群或者亞種群已經(jīng)存在很長(zhǎng)時(shí)間，并非新出現(xiàn)的譜系，并且種群長(zhǎng)時(shí)間處于動(dòng)態(tài)平衡，為低頻率的多態(tài)性。但亞組1相對(duì)比較平滑，有1個(gè)單峰，說明該組的甘薯雙生病毒種群呈突然暴發(fā)的狀態(tài)(圖3-C)。

中性檢測(cè)結(jié)果表明，組Ⅰ及其2個(gè)亞組的3個(gè)參數(shù)Tajima′s D、Fu & Li′s D和Fu & Li′s F均為負(fù)值(表2)，說明種群或亞種群處于擴(kuò)張趨勢(shì)。組Ⅱ分離物的Tajima′s D、Fu & Li′s D和Fu & Li′s F值為正值，說明種群可能處于一個(gè)收縮狀態(tài)或者選擇平衡狀態(tài)，但是P值均大于0.10，因此，結(jié)論不確定。所有組和亞組的單倍體標(biāo)本多樣性均≥0.99，核苷酸多樣性值低，但是不同的組或亞組之間的核苷酸多樣性值不同，組Ⅱ的值最高，亞組1的值最低(表2)。

3 討論

本研究獲得的24個(gè)甘薯雙生病毒分離物的外殼蛋白核苷酸和氨基酸序列一致率較高，分別在88.3%和94.5%以上。兩兩核苷酸一致率分析表明，XU8_2和XU8_3分離物與其他分離物的一致率均在90%以下，而其他分離物之間一致率較高，均在90%以上。根據(jù)ICTV及最新的分類標(biāo)準(zhǔn)[22]，XU8_2和XU8_3可能與其他分離物屬于不同的種，可補(bǔ)充與抗原反應(yīng)差別實(shí)驗(yàn)，或擴(kuò)增其全基因組序列以明確XU8_2和XU8_3的分類地位。甘薯雙生病毒中國(guó)分離物構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分為2個(gè)組，本研究的22個(gè)分離物位于組Ⅰ，只有XU8_2和XU8_3分離物位于組Ⅱ。中國(guó)各地區(qū)分離物在2個(gè)組中都有分布，因此，甘薯雙生病毒分離物沒有明確的地域相關(guān)性，可能與種質(zhì)資源交流頻繁及該病毒與種子傳毒[23]、粉虱持久性傳毒有關(guān)。

表1 甘薯雙生病毒外殼蛋白基因重組分析

Table 1 Tentative recombination sites and possible parent-like isolates of Sweetpovirus-cp

序列號(hào)GenbankNO.支持軟件Supportsoftware(p-value)主要親本Majorparent次要親本Minorparent起始位點(diǎn)Beginningbreakpoint結(jié)束位點(diǎn)EndingbreakpointZ值Z-valueKJ013578SIScan(1.2×10-12)LARD(8.5×10-12)3Seq(6.0×10-12)XU13_1KF475978104849.53KF475969SIScan(1.4×10-12)LARD(5.4×10-15)3Seq(2.0×10-13)HQ333141KF476510965179.31KF156759SIScan(1.4×10-12)LARD(5.4×10-12)3Seq(2.0×10-12)HQ333141KF476510965179.31

圖2 甘薯雙生病毒中國(guó)分離物cp基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of coat protein genes of Sweetpovirus islated from China

圖3 中國(guó)甘薯雙生病毒分離物組或亞組的核苷酸序列錯(cuò)配分布Fig.3 The frequency distribution of the number of pairwise nucleotide differences for groups or subgroups of Sweetpovirus isolates obtained from China

表2 甘薯雙生病毒種群的中性檢測(cè)、單倍體標(biāo)本和核苷酸多樣性檢測(cè)

Table 2 Neutrality tests， haplotype and nucleotide diversity of each population of Sweetpovirus

組GroupTajimasDFu&LisDFu&LisF單倍體標(biāo)本多樣性Haplotypediversity核苷酸多樣性Nucleotidediversity組ⅠGroupⅠ-0.88873-1.52548-1.518380.998(0.003)0.04532(0.00111)亞組1Subgroup1-1.13936-1.22246-1.418780.997(0.007)0.03149(0.00227)亞組2Subgroup2-0.44583-0.80749-0.810190.993(0.009)0.03679(0.00165)組ⅡGroupⅡ0.353960.448010.492800.990(0.012)0.07364(0.00329)

重組和突變?cè)谥参锊《局邪l(fā)生較普遍，是影響病毒變異和進(jìn)化的主要原因[17，18，24]，不同植物病毒的重組熱點(diǎn)不同。研究表明，甘薯雙生病毒重組熱點(diǎn)主要集中在C1/C2/C4及IR區(qū)域[17-18]。本研究也表明，外殼蛋白基因區(qū)域并非甘薯雙生病毒的重組熱點(diǎn)，即重組對(duì)甘薯雙生病毒cp基因分子變異及遺傳多樣性影響不大。突變才是引起cp基因分子變異的主要原因，氨基酸的非同義突變遠(yuǎn)大于同義突變，dN/dS大于1，基因所承受的選擇壓力大，處于正向(多樣化)選擇。

2006年，Luan等[14]首次報(bào)道了甘薯雙生病毒SPLCV在中國(guó)甘薯上的侵染。本研究表明，甘薯雙生病毒在中國(guó)甘薯上并不是一種新出現(xiàn)的病毒，而是已經(jīng)存在較長(zhǎng)時(shí)間，并且該病毒長(zhǎng)時(shí)間處于中性平衡模式，地域內(nèi)的分離物核苷酸多樣性高，一直處于擴(kuò)張狀態(tài)。這可能是因?yàn)镾PLCV引起的田間癥狀表現(xiàn)不明顯，隨氣溫升高，植物表現(xiàn)隱癥，未引起人們的重視。隨著研究的深入，甘薯雙生病毒逐漸引起人們的重視。本研究通過分子變異及遺傳多樣性分析，明確了其變異機(jī)制，為針對(duì)性地設(shè)計(jì)防治策略和選育抗病品種提供了理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 侯春曉)

Molecular variation and genetic diversity analysis of coat protein gene in Sweetpoviruses in China

ZHANG Chengling， SUN Houjun， YANG Dongjing， XU Zhen， ZHAO Yongqiang， XIE Yiping*

(XuzhouInstituteofAgriculturalSciencesinJiangsuXuhuaiArea，KeylaboratoryofBiologyandGeneticImprovementofSweetpotato，MinistryofAgriculture，Xuzhou221131，China)

The objectives of this study were to study the gene and gene variation of Sweetpoviruses infectingIpomoeabatatasin China. Sweetpovirus coat protein gene fragments of 24 isolates from sweet potato were amplified by PCR using the infected leaf samples randomly collected from sweet potato research center and SDT， DnaSP， RDP3， MEGA and other software were used to analysis testifies. The result showed that， the nucleotide sequences and amino acid sequences showed similarieties of 88.3%-100% and 94.5%-100%， respectively for the 24 isolates containing 765 base pairs and 254 amino acids. Phylogenetic trees constructed with all Chinese isolates revealed that the isolates were divided into 2 groups. Group I included most of the isolates collected from China， and 22 isolates obtained in this study， and divided into 2 subgroups. Group Ⅱ included only 27 isolates from Genbank and 2 isolates， XU8_2 and XU8_3 obtained in this study， so these 2 isolates might be new species. The ratio between mutations in the nonsynonymous and synonymous sites (dN/dSratio) ofcpwas>1， implying the coat protein gene was under positive selection. The shapes of mismatch distribution of Sweetpoviruses for all groups and subgroups except subgroup I were multimodal and ragged， indicating that all these population/subpopulations were long-existing ones.

Sweetpovirus; coat protein gene; molecular variation; genetic diversity

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.14

2016-11-28

江蘇省自然科學(xué)基金(BK20140230)；國(guó)家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北方病害崗位專家項(xiàng)目(CARS-11-B-09)

張成玲(1983—)，女，山東淄博人，副研究員，博士，主要從事甘薯病蟲害研究。E-mail:zhchling5291@163.com

*通信作者，謝逸萍，E-mail:xieyiping6216@163.com

S432.4+1

A

1004-1524(2017)04-0611-07

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(4): 611-617

張成玲， 孫厚俊， 楊冬靜， 等. 中國(guó)甘薯雙生病毒外殼蛋白基因分子變異及遺傳多樣性分析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2017， 29(4): 611-617.