何 亞，劉曉穎，鄧慶華，鄭小紅，蔣紅艷，蘇湲 淇

（1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，重慶 401120； 2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 400030）

·實驗研究·

丙泊酚與水合氯醛對亞低溫大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響比較*

何 亞1，劉曉穎2△，鄧慶華2，鄭小紅2，蔣紅艷2，蘇湲 淇2

（1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，重慶 401120； 2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 400030）

目的比較丙泊酚和水合氯醛對亞低溫大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用，促進(jìn)丙泊酚在臨床低溫麻醉手術(shù)中的合理應(yīng)用。方法 選擇健康雄性SD大鼠30只，隨機分為水合氯醛常溫組（A組）、丙泊酚低溫組（B組）、水合氯醛低溫組（C組），各10只。A組保持正常體溫，B組和C兩組低溫干預(yù)30 min，各組進(jìn)行心臟灌注，斷頭取腦，制備大鼠海馬神經(jīng)元組織樣本，分別進(jìn)行凋亡標(biāo)志物Caspase-3檢測及透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察，對比丙泊酚與水合氯醛對亞低溫所致大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響。結(jié)果 用平均光密度（AOD）值半定量Caspase-3蛋白的表達(dá)，結(jié)果水合氯醛低溫組表達(dá)明顯低于其常溫組，但高于丙泊酚低溫組（P＜0.01）；透射電鏡結(jié)果顯示，水合氯醛常溫組海馬區(qū)神經(jīng)元有明顯的凋亡小體形成，而水合氯醛低溫組也有不同程度的凋亡趨勢，只有丙泊酚低溫組凋亡現(xiàn)象最輕。結(jié)論 大鼠亞低溫狀態(tài)海馬神經(jīng)元仍存在一定的凋亡現(xiàn)象，而丙泊酚可減少亞低溫狀態(tài)下海馬神經(jīng)元的凋亡，同等條件下水合氯醛對海馬神經(jīng)元的凋亡則無明顯的干預(yù)作用。

丙泊酚；水合氯醛；亞低溫；海馬神經(jīng)元；凋亡

近年來，丙泊酚的腦保護(hù)作用已被研究證實，其機制可能與抗自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、抑制細(xì)胞內(nèi)的鈣超載、抑制γ-氨基丁酸（GABA）再攝取、拮抗Na+內(nèi)流、抑制經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（ACh）和兒茶酚胺類的突觸傳遞、拮抗內(nèi)皮素等多個環(huán)節(jié)有關(guān)[1-3]。也有研究表明，丙泊酚能減輕高溫引起的神經(jīng)元損傷[4]，但關(guān)于其對機體亞低溫狀態(tài)神經(jīng)細(xì)胞的影響卻少有報道。為此，本研究中選用水合氯醛作對照，采用免疫組化法檢測大鼠在全身亞低溫狀態(tài)下海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白的表達(dá)，用透射電鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，對比丙泊酚和水合氯醛對全身亞低溫大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響，以使丙泊酚在臨床低溫麻醉手術(shù)中得到更好地應(yīng)用。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試藥與儀器

動物：健康雄性SD大鼠30只，2個月月齡，清潔級，體質(zhì)量150～200 g。由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，動物合格證號為SCXK（渝）2014-0001。自由飲食、飲水，常溫下飼養(yǎng)1周，動物實驗按國際通用實驗室動物使用指南進(jìn)行，符合動物實驗倫理原則。

試藥：丙泊酚注射液（西安力邦制藥有限公司，批號為1107292，規(guī)格為每支10 mL∶100 mg）；水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司，批號為20141001），使用前用蒸餾水將其配制成 10% 溶液；一抗（Caspase-3）、二抗（即用型試劑，購自Dako公司）；DAB顯色試劑盒（美國Sigma公司）；PBS和TBS緩沖液。

儀器：RM2145型切片機，HI1210型展片機，HI1220型烤片機（德國Leica公司）；Philips TECNAI-10型透射電子顯微鏡（第三軍醫(yī)大學(xué)生物測試分析中心）；冰袋。

1.2 方法

將大鼠隨機分為水合氯醛常溫組（A組）、丙泊酚低溫組（B組）、水合氯醛低溫組（C組），各10只。每組中6只大鼠用于測定海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白的表達(dá)，4只用于觀察海馬神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)變化。A組用10%水合氯醛按大鼠體質(zhì)量以0.3 mL／100 g的劑量腹腔麻醉后保持正常體溫；B組和C組分別用1%的丙泊酚按15 mg／100 g和 10%水合氯醛 0.3 mL／100 g腹腔麻醉，然后用冰袋置大鼠頭部、頸部、肩部和軀干兩側(cè)[5]，使大鼠肛溫逐步降至32℃并保持30 min，低溫過程中用微量泵以16 mL／（kg·h）的速率腹腔補平衡鹽溶液，并觀察大鼠生理機能狀況。

各組大鼠觀察 24 h后分別進(jìn)行腹腔注射麻醉，迅速開胸暴露心臟，經(jīng)胸深主動脈插管，用生理鹽水250 mL、4℃ 4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液250 mL灌注后斷頭取腦[6]，將固定6 h后的海馬組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋處理，制作成石蠟塊，連續(xù)冠狀切片，采用免疫組化法檢測Caspase-3。按說明書操作，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，光鏡下觀察，陽性產(chǎn)物為棕黃色或棕褐色，背景為藍(lán)色。各組每張選取3個不重復(fù)視野照相（×400），用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定陽性細(xì)胞的平均光密度（average optical density，AOD）值半定量Caspase-3蛋白的表達(dá)，AOD值越大，表示Caspase-3蛋白表達(dá)越強，反之表達(dá)越弱。計算出 3個視野×3的AOD平均值，代表該組神經(jīng)元的平均值。

各組隨機選擇4只大鼠，取小塊海馬組織，快速用PBS沖洗組織周圍的血液等污物后立刻放入2.5%的戊二醛固定液；2～3 min后修整樣品為1 mm3，并放入新鮮的3%戊二醛固定液。按常規(guī)透射電鏡樣品制備方法漂洗、OsO4固定、漂洗、脫水、浸透、Spon812包埋，上機，拍照[7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用隨機分組設(shè)計，應(yīng)用JMTJFX簡明統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白表達(dá)

A組海馬神經(jīng)元可見細(xì)胞膜和胞漿中有棕黃色或棕褐色顆粒，即有明顯的Caspase-3蛋白表達(dá)（圖1a）；其AOD值高于B組（P＜0.01）和C組（P＜0.05），B組與 C組 Caspase-3陽性顆粒均較少（圖 1b、圖 1c）；而B組Caspase-3陽性顆粒最少，AOD值低于C組（P＜0.01），3組Caspase-3 AOD值排列順序依次為A組＞C組＞B組（見表1）。

表1 3組海馬神經(jīng)元Caspase-3平均光密度值比較（±s）

表1 3組海馬神經(jīng)元Caspase-3平均光密度值比較（±s）

注：與A組比較，αP＜0.01，αP＜0.05；與B組比較，＃P＜0.01。

組別水合氯醛常溫組（A組）丙泊酚低溫組（B組）水合氯醛低溫組（C組）平均光密度值0.129±0.024 0.081±0.015α0.114±0.011α＃P值0.00 0.00 0.00

2.2 海馬神經(jīng)元凋亡情況

B組大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷較輕，細(xì)胞大小

圖1 3組海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白的表達(dá)（×400）

圖2 3組海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化

正常，細(xì)胞膜完整，核圓，核仁居中，各種細(xì)胞器豐富，排列整齊無水腫（圖2b）；A組與C組超微結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變，尤其是A組細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯，可見細(xì)胞皺縮、核固縮、核內(nèi)染色質(zhì)分布欠均勻，核仁消失，細(xì)胞質(zhì)濃縮。細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體（圖2a）；C組神經(jīng)元也可見破壞，細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、不均勻、邊緣化（圖2c）。

3 討論

水合氯醛為安全且臨床常用的鎮(zhèn)靜劑及輔助麻醉藥物，已有百年的應(yīng)用歷史。目前，其仍常用于兒科的高熱驚厥輔助治療，磁共振成像（MRI）和超聲心電圖的輔助操作中也有使用，并在許多國家被用于動物實驗的麻醉。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，水合氯醛可誘發(fā)RAW 264.7巨噬細(xì)胞凋亡[8-9]，但對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響未見報道。

細(xì)胞凋亡是受各種基因調(diào)控的程序化死亡過程，Caspase-3蛋白是Caspase蛋白激酶家族中的代表性成員，是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核心蛋白酶，參與DNA斷裂和核固縮現(xiàn)象的發(fā)生，在凋亡中起決定性的調(diào)控作用。Caspase-3是腦組織中表達(dá)較高的促凋亡蛋白，為凋亡途徑的最終執(zhí)行者[10]。因此，大鼠海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白的表達(dá)可反映細(xì)胞的凋亡情況。

本試驗中免疫組化法結(jié)果顯示，水合氯醛常溫組（A組）有明顯的Caspase-3陽性表達(dá)，但不排除水合氯醛有誘發(fā)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的可能，即水合氯醛對腦細(xì)胞無明顯保護(hù)作用。因此，臨床使用本藥時應(yīng)嚴(yán)格掌握適應(yīng)證，注意用藥劑量與用藥時間，以減少不良反應(yīng)的發(fā)生。

丙泊酚是短效靜脈麻醉藥，因其起效快，作用時間短，患者蘇醒迅速而完全，不良反應(yīng)少，持續(xù)輸液后無蓄積作用，具有抗氧化及腦保護(hù)作用等特點，已被廣泛應(yīng)用于臨床各科的手術(shù)麻醉[11-12]，包括頭顱手術(shù)、體外循環(huán)疾病、慢性氣道炎癥和（或）哮喘患者的麻醉、新生兒靜脈麻醉、胃腸鏡檢查及人工流產(chǎn)的診療，丙泊酚的腦保護(hù)作用也得到越來越多的研究證實[13-14]。

本研究中，水合氯醛低溫組和丙泊酚低溫組海馬神經(jīng)元凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)均減少，尤其是丙泊酚低溫組表達(dá)最少，表明亞低溫可減輕神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，丙泊酚則可干預(yù)亞低溫大鼠神經(jīng)元的凋亡。這并不代表低溫對腦細(xì)胞毫無損害，在透射電鏡檢查中發(fā)現(xiàn)，水合氯醛低溫組大鼠海馬神經(jīng)元也出現(xiàn)了不同程度的細(xì)胞凋亡趨勢，即細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、邊聚，附著于核膜內(nèi)表面，因此，低溫給神經(jīng)細(xì)胞帶來的損傷作用仍不可忽視。而水合氯醛常溫組海馬神經(jīng)元的凋亡現(xiàn)象十分明顯，可見到典型的凋亡小體，說明水合氯醛并不能抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加之沒有低溫的保護(hù)作用，故神經(jīng)細(xì)胞損害最重。只有丙泊酚低溫組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)最完整，無明顯的凋亡小體出現(xiàn)，損傷最輕，較好地表現(xiàn)出丙泊酚能增強亞低溫狀態(tài)下的神經(jīng)元保護(hù)作用。

綜上所述，在亞低溫實現(xiàn)其神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的同時，也應(yīng)注意細(xì)胞凋亡帶來的不良反應(yīng)，而丙泊酚可減少亞低溫狀態(tài)下海馬神經(jīng)元的凋亡，在同等條件下，水合氯醛對海馬神經(jīng)元的凋亡無明顯干預(yù)作用。因此，在某些臨床手術(shù)中采用丙泊酚進(jìn)行亞低溫麻醉，不但可降低機體的基礎(chǔ)代謝率，減少心臟做功，減少腦組織耗氧量[15]，而且也可減少因細(xì)胞凋亡所致的不良反應(yīng)，增加手術(shù)的成功率。

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Effect Comparison of Propofol and Chloral Hydrate on the Apoptosis of Hippocampal Neurons in M ild Hypothermia Rats

He Ya1，Liu Xiaoying2，Deng Qinghua2，Zheng Xiaohong2，Jiang Hongyan2，Su Yuanqi2
（1.Department of Anesthesiology，Chongqing Yubei District People′s Hospital，Chongqing，China 401120； 2.Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing，China 400030）

Objective To compare the intervention effect of Propofol and Chloral Hydrate on the apoptosis of nerve cells in mild hypothermia rats，in order to promote Propofol better applied in clinical hypothermic anesthesia surgery.M ethods Totally 30 health SD rats were selected and randomly divided into normal temperature group of chloral hydrate（group A），low temperature group of propofol group（group B）and low temperature group of chloral hydrate（group C），10 cases in each group.The body temperature of group A was maintained normal，and those of group B and group C were under low-temperature intervention for 30 min，each group underwent heart perfusion，the brains were taken after decapitation to prepare the rat hippocampal neuronal tissue samples，and then apoptosis marker Caspase-3 was detected and the ultra-microstructure was observed by transmission electron microscopy to compare the influence of Propofol and Chloral Hydrate on the apoptosis of nerve cells in mild hypothermia rats.Results The semi-quantification was carried out on the expressions of Caspase-3 protein by average optical density(AOD).The result showed that the expression of Caspase-3 protein in group C was significantly lower than that in group A，but higher than that in group B（P＜0.01）；The results of the transmission electron microscopy showed that there were obvious apoptotic bodies formed in the hippocampal neurons in group A，while there were also different degreesof apoptotic tendency in group C，and the apoptosisphenomenon wasonly not seriousin group B.Conclusion There are certain of apoptosis phenomena in the hippocampal neurons in hypothermia rats，while the Propofol can reduce the apoptosis of hippocampal neurons under hypochromic condition，and the Chloral Hydrate has no obvious intervention effect on the apoptosis of hippocampal neurons at the same condition.

Propofol；Chloral Hydrate；hypothermia；hippocampal neuron；apoptosis

R965.2;R971.2

A

1006-4931(2017)06-0012-04

2016-11-24)

10.3969／j.issn.1006-4931.2017.06.004

重慶市教育委員會科學(xué)技術(shù)研究項目[KJ112502]。

何亞，主治醫(yī)師，研究方向為臨床麻醉學(xué)，（電話）023-61802500。

△通訊作者：劉曉穎，教授，研究方向為臨床藥理學(xué)，（電子信箱）liuxaoying＠163.com。