邱福南， 李 蕾， 張昳博， 林天生， 任 杰， 田毅峰

原發(fā)性肝細(xì)胞癌中內(nèi)源性大麻素的含量變化及其意義

邱福南1， 李 蕾2， 張昳博2， 林天生1， 任 杰2， 田毅峰1

目的 檢測并比較臨床肝癌組織與相應(yīng)癌旁組織中內(nèi)源性大麻素及其相關(guān)受體、合成代謝酶的含量變化，為尋找肝癌新型標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。 方法 采用HPLC-MS檢測47例肝癌組織以及相應(yīng)癌旁組織的內(nèi)源性大麻素含量，采用RT-PCR和Western-blot法檢測相關(guān)受體及合成代謝酶的mRNA、蛋白表達(dá)。 結(jié)果 在肝癌組織中，內(nèi)源性大麻素2-花生四烯酰甘油酯(2-AG)含量最高，且顯著高于癌旁組織(P<0.01)；內(nèi)源性大麻素花生四烯酰乙醇胺(AEA)的含量最低，且顯著低于癌旁組織(P<0.05)。類內(nèi)源性大麻素油酰乙醇胺(OEA)和棕櫚酰乙醇胺(PEA)的含量在肝癌組織與癌旁組織中未檢測到顯著差異。肝癌組織中2-AG受體CB2的表達(dá)較癌旁組織顯著上升(P<0.05)；AEA受體CB1的表達(dá)則呈顯著下降趨勢(P<0.05)。 結(jié)論 肝癌組織中內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)發(fā)生了顯著變化，提示2-AG高表達(dá)和AEA低表達(dá)可能對原發(fā)性肝細(xì)胞癌的形成和發(fā)展具有重要作用。

癌，肝細(xì)胞； 內(nèi)源性大麻酚類； 受體，大麻酚； 水解酶類

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是肝臟主要的惡性腫瘤，癌癥初期癥狀不明顯且癌變發(fā)展迅速。雖然手術(shù)切除、移植、化療、放療以及化學(xué)藥物的聯(lián)合使用等一系列療法提高了HCC患者的生存率，但是進(jìn)一步探索其腫瘤生成機(jī)制，尋找新的腫瘤標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)仍是研究的重中之重。

近年來，隨著對內(nèi)源性脂質(zhì)代謝與癌癥相關(guān)性研究的深入，人們逐步發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-4]。內(nèi)源性大麻素花生四烯酰乙醇胺(anandamine, AEA)和2-花生四烯酰甘油酯(2-arachidonoylglycerol, 2-AG)分別是大麻素受體1和2(canabinoid receptors 1 and 2, CB1和CB2)的天然受體，與大麻中的主要活性成分四氫大麻酚具有類似的藥理作用。在乳腺癌、前列腺癌、直腸癌及腦膠質(zhì)瘤等腫瘤細(xì)胞中均可觀察到內(nèi)源性大麻素通過激活大麻素受體誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[1-4]。大麻素系統(tǒng)可能成為抗腫瘤藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)之一。

目前關(guān)于內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在肝癌中的調(diào)節(jié)及其可能的作用機(jī)制尚不完全明確。筆者回顧性分析2013年6月-2015年6月47例肝癌患者的臨床病理資料，檢測上述臨床肝癌組織以及相應(yīng)癌旁組織的內(nèi)源性大麻素含量，同時檢測相關(guān)受體和合成代謝酶的表達(dá)，分析內(nèi)源性大麻素表達(dá)差異的原因，并探索其在HCC中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌組織及癌旁組織均來自筆者醫(yī)院肝膽外科，經(jīng)過病理學(xué)驗證為HCC。手術(shù)后分離部分組織，在液氮中速凍為冰凍樣本后在-80 ℃冰箱中長期保存。共計47人94份組織，包括肝癌組織47份，對應(yīng)癌旁組織47份，基本資料見表1，2。

1.2 試劑 (類)內(nèi)源性大麻素標(biāo)準(zhǔn)品AEA,2-AG，油酰乙醇胺(oleylethanolamide，OEA)和棕櫚酰乙醇胺(palmitoylethanolamide，PEA)(美國Sigma公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Toyobo公司);蛋白酶抑制劑(瑞士Roche公司);BCA蛋白定量試劑(美國Thermo公司);5×蛋白上樣液(美國Thermo公司);Tris-HCl(中國索萊寶公司);BSA(中國索萊寶公司);脫脂奶粉(中國伊利乳業(yè));Marker蛋白(美國Thermo公司);Hybond PVDF膜(美國Bio-rad公司);柱層析硅膠(中國黃海化學(xué)試劑公司);甲醇(美國Sigma 公司，色譜純);氯仿(中國西隴化工有限公司)，CB1及CB2一抗(英國Abcam公司)，抗兔二抗(美國Thermo公司)，β-actin抗體(美國Cayman公司)，ECL試劑(A+B)(美國Advansta公司)。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)源性脂質(zhì)檢測 精密稱取50 mg組織于8 mL圓底玻璃瓶中，加入含1 nmoL內(nèi)參17∶1脂肪?；掖及?fatty acid ethanolamides，F(xiàn)AE)的裂解液2 mL，勻漿混勻。每管取出50 μL，BCA法測定蛋白濃度，剩余液每管加入3 mL氯仿，渦旋5 min，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min。轉(zhuǎn)移下層液體至干凈尖底玻璃離心管中，氮?dú)獯蹈?，加? mL氯仿復(fù)溶。將氯仿溶液轉(zhuǎn)移至硅膠柱，1 mL氯仿洗脫，合并收集洗脫液，氮?dú)獯蹈?。加?00 μL溶劑(甲醇∶氯仿=3∶1)溶解，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，-80 ℃保存。

表1 47例肝癌病例的臨床病理特點(diǎn)

AFP：甲胎蛋白； ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶； AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶.

表2 臨床樣本資料

HBV：乙型肝炎病毒.

使用安捷倫1200 HPLC串聯(lián)AB 3200 Q-Trap MS檢測內(nèi)源性大麻素含量，色譜柱為Agilent公司XDS-C18，4.6×5.0 mm，1.8 μm。梯度洗脫條件為：0～3 min，15% A相(純水)和85% B相(甲醇)；3～5 min，B相由85%勻速上升為100%；5～20 min，100% B相作為流動相；20～22 min，100% B相勻速下降為85%，A相由0上升為15%。多離子反應(yīng)監(jiān)控模式檢測內(nèi)源性脂質(zhì)含量，離子對分別為：AEA(348.0，62.0)，2-AG(379.3，287.3)，OEA(326.1，62)，PEA(300.2，62)，17∶1 FAE(313.0，62)。

標(biāo)準(zhǔn)品加入至裂解液中稀釋成終濃度為20,10,5,2.5,1.25,0.625和0.312 5 nmol/L共7個濃度點(diǎn)，和上述脂質(zhì)提取分析方法一致，經(jīng)過萃取，吹干，復(fù)溶等步驟，與樣品同時檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 RT-PCR檢測 稱取20 mg左右的組織樣本于2 mL EP管中，加入1 mL Trizol裂解液，在冰上勻漿為混懸液，于無核酶條件下采用RNA提取試劑盒提取總RNA。測定RNA濃度，按照TOYOBO逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。

利用Primerpremier 5.0軟件設(shè)計相關(guān)受體及合成代謝酶的引物，由上海生工生物工程公司合成，引物序列：

h18S基因

上游:5’-GTGCATGGCCGTTCTTAGTT-3’

下游:5’-CGGACATCTAAGGGCATCAC-3’

hFAAH基因

上游:5’-GAACTGCAGCACGAGATCGA-3’

下游:5’-CCCTCCACTGGCAATCA-3’

hNAPE-PLD基因

上游:5’-AATCCGTGGCCAACATGGA-3’

下游:5’-TTGGACCCATGTACCTGCGATG-3’

hMAGL基因

上游:5’-CAAGGCCCTCATCTTTGTGT-3’

下游:5’-CAAGGCCCTCATCTTTGTGT-3’

hDGL基因

上游:5’-TGCTCTTCGGCCTGGTCTAT-3’

下游:5’-CGCATGCTCAGCCAGATGAT-3’

hCB1基因

上游:5’-CCACTCCCGCAGCCTCCG-3’

下游:5’--ATCAGGCAAAACGCCACCAC-3’

hCB2基因

上游:5’-GGTGACAGAGATAGCCAATG-3’

下游:5’-GCCAATGAACAGGTATGAGG-3’

1.3.3 蛋白檢測 稱取約50 mg左右的組織，放置于2 mL EP管，PBS清洗，加入RIPA裂解液500 μL(用時加入蛋白酶抑制劑)，在冰上充分勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。取20 μL蛋白樣品，通過電轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶常溫封閉1 h后加入1∶500～1∶1 000的一抗，4 ℃搖動孵育過夜；TBST洗膜后加入稀釋濃度為1∶10 000的二抗，37 ℃搖床孵育1 h，加入ECL顯色劑后，使用凝膠成像系統(tǒng)掃描光密度值，Quantity One軟件分析不同蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)源性大麻素的表達(dá) 不同內(nèi)源性大麻素在組織中含量相差很大，以每mg蛋白為單位，2-AG含量最高(約為100 pmol/mg)，OEA和PEA的含量約為1 pmol/mg，而AEA在外周的含量最低，僅為0.1 pmol/mg。與癌旁組織比較，腫瘤組織中AEA的含量略有降低(P<0.05，圖1)，2-AG顯著上升(P<0.01)；而類內(nèi)源性大麻素OEA和PEA表達(dá)無顯著性差異(P>0.05，圖1)。

AEA：花生四烯酰乙醇胺； 2-AG：2-花生四烯?；鶈胃视王?； OEA：油酰乙醇胺； PEA：棕櫚酰乙醇胺. N：癌旁肝組織；C：原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織. A:AEA; B:2-AG; C:OEA; D:PEA. 與癌旁肝組織比較，☆：P<0.05；☆☆：P<0.01.圖1 HPLC-MS檢測內(nèi)源性脂質(zhì)在原發(fā)性肝癌腫瘤組織和癌旁肝組織中的表達(dá)結(jié)果Fig 1 The expression of endogenous lipids in HCC tissues and adjacent tissues was detected by HPLC-MS

2.2 AEA和2-AG的合成、分解酶的表達(dá) 通過熒光實時定量PCR分別檢測AEA和2-AG的合成、分解酶的表達(dá)，結(jié)果表明，AEA合成酶(N-acetylphosphatidylethanolamine-hydrolysing phospholipase D, NPLD)的mRNA表達(dá)無明顯變化(P>0.05)，而其降解酶(fatty acid amide hydrolase, FAAH)的mRNA表達(dá)明顯上升(P<0.05，圖2)。RT-PCR檢測結(jié)果還顯示，另一種重要的內(nèi)源性大麻素2-AG合成酶(diacylglycerol lipase, DGL)的mRNA水平顯著升高(P<0.001)，而其水解酶(monoacylglycerol lipase, MAGL)的mRNA也略有升高(P<0.05，圖2)。

N：癌旁肝組織； C：原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織； NPLD：N-乙酰磷脂酰乙醇胺水解磷脂酶D； FAAH：脂肪酰胺水解酶； DGL：二?；视椭久福?MAGL：單?；视椭久? A:NPLD; B:FAAH; C:DGL; D:MAGL. 與癌旁肝組織比較，☆：P<0.05；☆☆：P<0.001.圖2 內(nèi)源性大麻素合成、代謝酶在原發(fā)性肝癌腫瘤組織和癌旁肝組織中的mRNA表達(dá)Fig 2 mRNA expression of endocannabinoids synthetase and hydrolase in HCC tissues and adjacent tissues

2.3 大麻素受體的表達(dá) AEA在外周表達(dá)較低，其主要作用受體為CB1；而2-AG在外周表達(dá)較高，其主要作用受體為CB2。CB1在腫瘤組織中較癌旁組織略有下降(P<0.05)，而CB2受體在腫瘤組織中有所上升(P<0.05，圖3)，說明在腫瘤組織中，2-AG可能通過激活CB2受體發(fā)揮作用，影響腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展。

N：癌旁肝組織； C：原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織； CB：大麻素受體.A:CB1; B:CB2. 與癌旁肝組織比較，☆：P<0.05.圖3 內(nèi)源性大麻素受體在原發(fā)性肝癌腫瘤組織和癌旁肝組織中的mRNA表達(dá)Fig 3 mRNA expression of cannabinoid receptors in HCC tissues and adjacent tissues

3 討 論

在多種腫瘤組織中，都可觀察到AEA和2-AG表達(dá)較對應(yīng)的癌旁組織有較大幅度的提高，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌和子宮內(nèi)膜肉瘤等[5-9]。文獻(xiàn)顯示，在正常的腸癌組織中，AEA的含量約為75 nmol/L，但在結(jié)腸癌組織中，約提高2～3倍[9]。許國旺等通過HPLC/MS檢測HCC患者血清中內(nèi)源性脂質(zhì)含量，提示HCC患者血清AEA水平較健康對照者顯著升高[10]。本研究中，HCC患者肝癌樣本中AEA水平較癌旁組織略有降低，與文獻(xiàn)報道相反。筆者認(rèn)為可能有以下原因：(1)樣本來源不一致，文獻(xiàn)使用的是HCC患者的血清。血清中的內(nèi)源性脂質(zhì)水平并不能完全代表肝臟的表達(dá)量。本研究使用的是肝癌組織樣本，更能客觀地反映肝癌病變過程中內(nèi)源性脂質(zhì)變化；(2)文獻(xiàn)是HCC患者與健康人群進(jìn)行對比，反映的是疾病發(fā)生過程中人體系統(tǒng)環(huán)境中AEA的改變，可能會受到其他并發(fā)癥或者機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響，而本研究所反映的結(jié)果顯示局部病變環(huán)境AEA的改變，針對性更強(qiáng)。

AEA主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在外周神經(jīng)及身體各器官組織分布較少，多項研究均認(rèn)可AEA主要通過激活CB1受體等發(fā)揮抗腫瘤的作用[3,11]。本研究結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞可能通過誘導(dǎo)AEA和其受體CB1的表達(dá)下降，規(guī)避抗腫瘤作用。具體分析顯示，在肝癌組織樣本中，AEA的水解酶FAAH表達(dá)明顯升高，而合成酶NPLD沒有顯著變化，說明AEA的分解速度大于合成速度，肝癌細(xì)胞可能通過提高FAAH表達(dá)，抑制AEA-CB1的抗腫瘤作用。與肝星狀細(xì)胞比較，肝細(xì)胞通過高表達(dá)FAAH保護(hù)自身免受AEA誘導(dǎo)的傷害[12]，肝細(xì)胞癌變過程中是否通過進(jìn)一步促進(jìn)FAAH表達(dá)逃避AEA誘導(dǎo)的凋亡？CB1受體在AEA水平下降的情況下為什么沒有反饋性升高？上述問題值得進(jìn)一步深入研究。抑制FAAH、激活CB1可能作為抑制HCC發(fā)生發(fā)展的新策略[13]。

另一種主要的內(nèi)源性大麻素2-AG主要分布于外周組織中，因此肝癌組織樣本中2-AG的水平明顯高于AEA。本結(jié)果顯示，在HCC患者腫瘤樣本中，2-AG的表達(dá)較癌旁組織顯著升高，這個發(fā)現(xiàn)與在腦膠質(zhì)瘤、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌等的研究一致[4，14-15]。在肝癌組織中，2-AG的合成和代謝速度均顯著升高，但合成速度顯著優(yōu)于分解速度。

與2-AG顯著升高相一致，肝癌組織中CB2受體的表達(dá)也呈上升趨勢。2-AG可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲[8,16]，CB2受體也被認(rèn)為可以作為治療慢性肝病如肝纖維化、脂肪肝等疾病的靶標(biāo)[17-19]，但尚未見對治療肝癌的相關(guān)報道，這可能與2-AG能誘導(dǎo)活化的肝星狀細(xì)胞凋亡，但不能誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡有關(guān)[17]。2-AG/CB2體系在肝癌組織中表達(dá)顯著升高的生理和病理意義，仍需要更多的研究進(jìn)行探討。

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(編輯:張慧茹)

Alteration and Significance of Endogenous Cannabinoid System in Human Hepatocellular Carcinoma

QIU Funan1, LI Lei2, ZHANG Yibo2, LIN Tiansheng1, REN Jie2, TIAN Yifeng1

1. Department of Surgery, Provincial Clinic College of Fujian Medical University； Department of Hepatobiliary Surgery, Fujian Provincial Hospital, Fuzhou 350001, China; 2. Department of Medical Sciences, Medical College, Xiamen University, Xiamen 361102, China

Objective To detect and analyze endocannabinoids and its related enzymes and their receptors in hepatocellular carcinoma (HCC) tissue and adjacent tissues in order to identify new markers and therapeutic targets for hepatocellular carcinoma HCC. Methods Endocannabinoids levels were detected by HPLC-MS in 47 cases of HCC and adjacent tissues. RT-PCR and Western-blot were used to detect the expression of genes and proteins of the related metabolism enzymes and receptors. Results The content of 2-AG, one of the representative endocannabinoids, was the highest in HCC tissues and was significantly higher than that in the adjacent tissues (P<0.01), while the content of AEA ws the lowest and was significantly lower than that in the adjacent tissues (P<0.05). There were no significant difference in the levels of other fatty acyl ethanolamines, such as OEA and PEA, between HCC and adjacent tissues. The expression of CB2, a receptor of 2-AG, was significantly increased in HCC tissues (P<0.05), while the levels of CB1, a receptor of AEA, was observed at a decreased trend (P<0.05). Conclusion There was a notable change in endocannabinoid system in HCC, which suggests that high expression of 2-AG and low expression of AEA may play an important role in the formation and development of HCC.

carcinoma, hepatocellular；endocannabinoids；receptors, cannabinoid；hydrolases

2016-09-07

福建省自然科學(xué)基金(2013J01274；2015J01416)

1.福建醫(yī)科大學(xué) 省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建省立醫(yī)院 肝膽外科，福州 350001； 2.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，廈門 361102

邱福南，男，主任醫(yī)師，副教授，醫(yī)學(xué)碩士

田毅峰. Email:tianyifeng@medmail.com.cn

R392.114； R730.261； R735.7

A

1672-4194(2017)01-0030-05