楊樹鋼， 林建安， 陳紹勤， 葉建新

共同沉默DcR3和EGFR基因?qū)Y(jié)腸癌細胞株SW480體外生長的影響

楊樹鋼， 林建安， 陳紹勤， 葉建新

目的 探討共同沉默誘騙受體3(DcR3)和表皮生長因子(EGFR)基因?qū)Y(jié)腸癌細胞株SW480生長增殖的影響和誘導凋亡作用研究。 方法 根據(jù)DcR3、EGFR的cDNA序列構(gòu)建3組針對DcR3和EGFR的siRNA，分別使用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染的方法將各個siRNA導入結(jié)腸癌細胞株SW480中，48 h后通過實時熒光定量PCR檢測各個siRNA對腫瘤靶基因mRNA表達的影響，采用Western-blot技術(shù)檢測其靶基因蛋白的表達水平，篩選出對人結(jié)腸癌SW480細胞系中DcR3和EGFR抑制效果最強的siRNA，然后單獨或聯(lián)合轉(zhuǎn)染SW480細胞，MTT法檢測轉(zhuǎn)染后對結(jié)腸癌細胞株SW480生長增殖活性的影響，流式細胞儀檢測對結(jié)腸癌細胞株SW480的誘導凋亡作用。 結(jié)果 共同沉默DcR3和EGFR基因?qū)W480細胞增殖的抑制作用優(yōu)于DcR3或EGFR單基因沉默組(P<0.05)。雙基因共沉默組、DcR3單基因沉默組、EGFR單基因沉默組轉(zhuǎn)染48 h后轉(zhuǎn)染細胞的凋亡率分別為(20.1±1.7)%，(16.5±2.2)%及(15.9±1.3)%，差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結(jié)論 DcR3和EGFR雙基因共沉默能有效抑制人結(jié)腸癌細胞株SW480的增殖并誘導其凋亡，且作用優(yōu)于DcR3或EGFR單基因沉默。

受體，腫瘤壞死因子，成員6b； 受體，表皮生長因子； 結(jié)腸腫瘤； *基因； *基因沉默； 細胞凋亡； 細胞增殖

結(jié)直腸癌是威脅人類生命和健康的常見腫瘤之一。近年來，結(jié)腸癌的發(fā)病率與死亡率呈明顯上升趨勢[1]。目前，腫瘤外科手術(shù)治療、放射治療、內(nèi)科治療(化學藥物治療、生物治療)和基因靶向治療相結(jié)合的個體化綜合治療模式是優(yōu)化結(jié)腸癌治療效果所推崇的模式。分子靶向治療成為近年來腫瘤治療發(fā)展領(lǐng)域的研究熱點，越來越受到重視，單基因靶向治療結(jié)腸癌已獲得一定進展，但處于一個平臺期，因此聯(lián)合共同作用于腫瘤細胞中的多個癌基因是腫瘤基因治療中一個新的研究方向[2]。誘騙受體3(decoy receptor 3, DcR3)是由Pitti等發(fā)現(xiàn)的可溶性腫瘤壞死因子受體超家族成員，能夠?qū)毎L發(fā)育和分化進行調(diào)節(jié)，誘導腫瘤細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，與腫瘤的增殖和遷移侵襲能力關(guān)系密切，可作為腫瘤惡化的一種重要生物學標志物[3-6]，臨床應(yīng)用前景廣闊。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是酪氨酸激酶受體家族中的一種跨膜受體，介導的信號轉(zhuǎn)導對腫瘤細胞的增殖、分化、生存、轉(zhuǎn)移等起調(diào)節(jié)作用，EGFR及其配體網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)明確為腫瘤治療的重要靶點[7]，EGFR抑制劑西妥昔單抗以其高選擇性和低毒性的優(yōu)勢而在臨床被廣泛應(yīng)用，可獲得確切的臨床效果[8]。RNA干擾是一種封閉基因表達的有效方法，通過siRNA誘導的基因沉默現(xiàn)象，與反義寡核苷酸技術(shù)相比能更高效地抑制目的基因的表達，具有高度特異性、高效、穩(wěn)定的特點[9-10]。

本研究根據(jù)DcR3、EGFR的cDNA序列分別構(gòu)建針對DcR3和EGFR的siRNA，通過siRNA共沉默人結(jié)腸癌細胞株SW480的DcR3和EGFR基因與沉默單個基因的作用效應(yīng)進行比較，研究共同沉默DcR3和EGFR基因?qū)θ私Y(jié)腸癌細胞株SW480的增殖活性和凋亡狀態(tài)的影響，初步探討雙基因靶點抑制在結(jié)腸癌基因治療中的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株：結(jié)腸癌細胞株SW480(武漢大學細胞典藏中心)。主要試劑：轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；熒光定量PCR試劑盒[TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司]；MTT試劑(美國Sigama公司)；Purified anti-human DcR3抗體、Purified anti-human EGFR抗體和Purified anti-human β-actin多克隆抗體(美國Santa公司)；細胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG二抗(北京中山生物技術(shù)公司)。主要儀器：PCR儀(AB2720型，美國ABI公司)；紫外光透射分析儀(ZF-B型，上海長明光學電子儀器廠)；Gene Genius凝膠成像系統(tǒng)(英國Syngene公司)；Uhmspec 4 300 pm紫外/可見分光光度計(Amersham 公司)；Mini-Protein垂直蛋白電泳儀(Bio-Rad公司)；CMIA多功能北航彩色病理圖像分析系統(tǒng)(北京航空航天大學);Biotek酶標儀(Applied Biosystems公司)等。

1.2 方法

1.2.1 人結(jié)腸癌細胞SW480的鑒定及siRNA合成、轉(zhuǎn)染、篩選 (1)細胞培養(yǎng)。將人結(jié)腸癌細胞SW480培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，細胞成單層貼壁生長，以0.25%胰蛋白酶消化貼壁傳代，按1∶2或1∶3傳代，加入培養(yǎng)液后在37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2孵箱中培養(yǎng)。(2)DcR3、EGFR siRNA序列的設(shè)計、合成。根據(jù)DcR3 mRNA的序列初步選擇siRNA序列[11]。(3)轉(zhuǎn)染與篩選。細胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前一天，以每孔3×105～5×105個細胞接種在6孔板，用2 mL含10% FBS的RPMI 1640細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。在250 μL的RPMI 1640無血清培養(yǎng)基中加入100 pmol siRNA，柔和混勻，用無血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)基稀釋5 μL Lipofectamine試劑，siRNA和RNAi-Mate試劑混合形成siRNA/Lipofectamine復合物。將500 μL siRNA/Lipofectamine復合物加入每個孔中，將細胞置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中溫育24～48 h后，進行轉(zhuǎn)染后的其他檢測步驟。(4)通過Real-time篩選siRNA?？俁NA的提取按TRIzolTM(美國Invitrogen公司)試劑盒說明進行，所得RNA樣品采用紫外分光光度計測定在260 nm和280 nm的吸光度值，即OD260 nm及OD280 nm值，算出OD260 nm/OD280 nm，并計算其濃度及純度。用熒光定量RT-PCR檢測DcR3、EGFR的表達并篩選出干擾效果較好的DcR3和EGFR siRNA。將3對DcR3-siRNA及3對EGFR-siRNA序列分別轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細胞SW480，24 h后收集細胞進行熒光定量PCR，檢測處理前后DcR3與EGFR基因的表達情況，并將DcR3-siRNA分為DcR3對照組和DcR3-179、DcR3-641、DcR3-1027組，將EGFR-siRNA分為EGFR對照組和EGFR-395、EGFR-1211、EGFR-1499組。運用引物設(shè)計軟件設(shè)計引物如下：

DcR3(產(chǎn)物大小144 bp)：

前引物：5’-TCAATGTGCCAGGCTCTTC-3’

后引物：5’-GCCTCTTGATGGAGATGTCC-3’

EGFR(產(chǎn)物大小175～176 bp)：

前引物：5’-GAGTTAAGATTTTTTTAAGGGTCCC-3’

后引物：5’-TAACTGACATGGGTCGGCC-3’

β-actin(產(chǎn)物大小202 bp)：

前引物：5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’

后引物：5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’

通過Western-blot篩選siRNA，將結(jié)果掃描傳送至計算機，采用Image-Proplus圖像分析軟件對結(jié)果數(shù)據(jù)進行分析，以蛋白條帶的灰度掃描比值來代表蛋白的表達量。

1.2.2 細胞免疫組織化學及FAM熒光標記 應(yīng)用細胞免疫化學法鑒定SW480細胞EGFR蛋白和DcR3蛋白的表達情況。在同等條件下用FAM標記siRNA和陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染SW480細胞，并在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 MTT比色試驗與流式細胞學檢測 實驗分為對照組、脂質(zhì)體組、DcR3沉默組、EGFR沉默組和EGFR-DcR3共沉默組，通過實時MTT比色試驗法及流式細胞學方法，觀察轉(zhuǎn)染后各組對人結(jié)腸癌細胞SW480體外生長情況的影響。

2 結(jié) 果

2.1 SW480細胞EGFR和DcR3的蛋白表達 細胞免疫化學鑒定SW480細胞EGFR蛋白和DcR3蛋白的表達情況，結(jié)果顯示SW480細胞EGFR和DcR3染色陽性()(圖1)。

A：EGFR()；B：DcR3().圖1 SW480細胞EGFR蛋白和DcR3蛋白的表達Fig 1 EGFR and DcR3 protein expression in SW480 cells

2.2 siRNA轉(zhuǎn)染SW480細胞的效率分析 在同等條件下用FAM標記siRNA和陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染SW480細胞，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果如圖2所示。

將3對DcR3-siRNA及3對EGFR-siRNA序列分別轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細胞SW480，24 h后收集細胞進行熒光定量PCR，檢測處理前后DcR3與EGFR基因的表達情況(表1)。DcR3-siRNA處理組DcR3靶基因的mRNA表達水平分別為對照組的32%，42%及30%，與對照組比較，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；EGFR-siRNA處理組EGFR靶基因的mRNA表達水平分別為對照組的48%(P<0.05)，63%(P>0.05)及39%(P<0.05)，即DcR3-179、DcR3-641、DcR3-1027、EGFR-395、EGFR-1499與對照組比較，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A：siRNA；B：siCont.圖2 FAM標記的siRNA細胞轉(zhuǎn)染Fig 2 FAM-labeled siRNA cell transfection

細胞轉(zhuǎn)染72 h后，各組靶蛋白表達的變化如下：DcR3-179、DcR3-641及DcR3-1027 siRNA對SW480細胞的DcR3蛋白表達較對照組有顯著抑制作用(P<0.05)，EGFR-395及EGFR-1499 siRNA對SW480細胞的EGFR蛋白表達較對照組有顯著抑制作用(P<0.05)，而EGFR-1211 siRNA對EGFR蛋白表達的抑制作用與對照組比較，差別則無統(tǒng)計學意義(P>0.05);其中，DcR3-1027 siRNA和EGFR-1499 siRNA的抑制效果最好(圖3)。

表1 siRNA轉(zhuǎn)染后胞內(nèi)DcR3及EGFR的mRNA表達水平

DcR3：誘騙受體3； EGFR：表皮生長因子受體. 與對照組比較，☆：P<0.05.

A、C：DcR3-siRNA下調(diào)SW480細胞DcR3蛋白表達；B、D：EGFR-siRNA下調(diào)SW480細胞EGFR蛋白表達. ☆☆：P< 0.01；☆☆☆：P< 0.001.圖3 siRNA下調(diào)SW480細胞靶蛋白表達Fig 3 siRNA decreases DcR3 and EGFR protein expression in SW480

2.3 DCR3和EGFR基因敲減對SW480細胞增殖的抑制 通過上述過程篩選出DcR3-1027 siRNA和EGFR-1499 siRNA對SW480細胞較好的干擾效果，對靶基因mRNA表達的抑制率為70%和61%。將2種siRNA單獨或聯(lián)合轉(zhuǎn)染入SW480細胞后，通過MTT法檢測各組轉(zhuǎn)染后對SW480增殖的影響，結(jié)果顯示，DcR3沉默組、EGFR沉默組和共沉默組的抑制率均比對照組高，在24和48 h時差別有顯著性意義(P<0.05)，且共沉默組較單獨沉默組在24和48 h對細胞有更明顯的抑制作用(P<0.05)，而DcR3沉默組與EGFR沉默組對細胞的抑制作用在0～72 h差別均無明顯意義(P>0.05)。具體見表2及圖4。

表2 MTT法測轉(zhuǎn)染后的SW480細胞的吸光度

DcR3：誘騙受體3；EGFR：表皮生長因子受體. 與對照組比較，☆：P<0.05.

☆：P<0.05；☆☆☆：P<0.001.圖4 MTT法測SW480細胞增殖曲線Fig 4 The proliferation rate curve of SW480 in different groups

2.4 DcR3和EGFR基因敲減誘導SW480細胞的凋亡 通過流式細胞學方法檢測轉(zhuǎn)染后各組凋亡情況，轉(zhuǎn)染后各組細胞凋亡率分別為對照組(9.4±0.9)%，脂質(zhì)體組(8.8±1.2)%，DcR3沉默組(16.5±2.2)%，EGFR沉默組(15.9±1.3)%，共沉默組(20.1±1.7)%。其中DcR3沉默組、EGFR沉默組和共沉默組的凋亡率均較對照組高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；共沉默組與單獨沉默組比較差別也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而DcR3沉默組與EGFR沉默組的凋亡率差別則無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具體見圖5。

3 討 論

DcR3在調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖、凋亡中起重要作用，一方面可通過與死亡因子FasL特異性結(jié)合，抑制FasL與受體Fas的結(jié)合，影響Fas/FasL途徑誘導產(chǎn)生的細胞凋亡作用，使惡性腫瘤細胞逃避免疫細胞攻擊；另一方面可通過與腫瘤壞死因子超家族成員淋巴毒素類似物(LIGHT)緊密結(jié)合，抑制LIGHT與受體HVEM/TR2和LTI3R的相互結(jié)合，抑制LIGHT介導的細胞凋亡作用，在腫瘤細胞的免疫逃逸中發(fā)揮著重要的作用[12]。DcR3在惡性腫瘤組織中的表達水平高于正常組織，其表達水平與腫瘤惡性程度、腫瘤大小、臨床分期、腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13]。本研究證實，經(jīng)轉(zhuǎn)染DcR3-siRNA的SW480結(jié)腸癌細胞，其DcR3 mRNA及蛋白表達均降低。使用針對DcR3抑制效果較好的siRNA轉(zhuǎn)染SW480細胞，腫瘤細胞的增殖受抑制，凋亡增加，提示靶向抑制DcR3可能作為結(jié)腸癌的一種潛在的治療方法。

EGFR是細胞表面受體表皮生長因子家族(EGF family)中的一種重要的細胞表面多功能跨膜蛋白分子[14]，由其介導的信號轉(zhuǎn)導對腫瘤細胞的增殖、分化、生存、轉(zhuǎn)移等起調(diào)節(jié)作用[15]。EGFR能夠通過激活MAPK、PI3K/AKT、及TAK-STAT信號轉(zhuǎn)導通路，對調(diào)控細胞周期的CDK-cyclin系統(tǒng)產(chǎn)生影響，加快細胞的增殖、轉(zhuǎn)化。當EGFR過度表達時，EGFR能夠與其配體EGF結(jié)合形成一個自分泌環(huán)路，使EGFR活性明顯上調(diào)，促進腫瘤細胞生長，而EGFR抗體治療的主要機制就是通過阻斷EGF/EGFR自分泌環(huán)起治療作用。本實驗將針對EGFR的siRNA轉(zhuǎn)染SW480細胞，結(jié)果顯示，3組針對EGFR的siRNA對人結(jié)腸癌SW480細胞的靶基因的mRNA抑制分別為61%，37%和52%。篩選出其中對EGFR抑制效果最好的siRNA轉(zhuǎn)染SW480細胞，細胞凋亡率顯著增加，呈現(xiàn)細胞生長抑制作用。

分子靶向治療是目前腫瘤研究的熱點，逐漸受到腫瘤醫(yī)生的高度重視，但仍以阻斷單一分子為主。然而腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多種基因共同參與的復雜過程，涉及到多個基因表達的異常升高。因而，針對單一分子的治療療效往往無法獲得滿意療效。同樣，針對基因治療，多靶點聯(lián)合沉默腫瘤相關(guān)基因的治療思路將逐漸取代針對單一基因的治療[16]。由于RNAi抑制基因表達具有特異性和高效性2個明顯的特征，因而，RNAi技術(shù)被廣泛用于敲減腫瘤細胞靶基因的表達，用于抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲等。研究證明，在同一個細胞內(nèi)采用多個siRNA抑制多個目標基因的表達是可行的[17]。多基因共沉默技術(shù)已應(yīng)用于肺癌、喉癌、胰腺癌及皮膚癌等腫瘤的基礎(chǔ)研究，并取得明顯效果，如Shi等通過聯(lián)合沉默K-ras和Akt2 2個癌基因，探索RNA干擾技術(shù)用于胰腺癌的治療作用[18]。

A～E：對照組、脂質(zhì)體組、DcR3沉默組、EGFR沉默組和共沉默組細胞流式法檢測； F：各組細胞凋亡率. ☆：P<0.05； ☆☆：P<0.01；☆☆☆：P<0.001.圖5 DcR3和EGFR基因敲減誘導SW480細胞的凋亡Fig 5 DcR3 and EGFR gene down-regulation induced SW480 cell apoptosis

本實驗選擇聯(lián)合沉默EGFR和DcR3基因，利用脂質(zhì)體同時轉(zhuǎn)染分別針對EGFR和DcR3的siRNA，且在siRNA設(shè)計時排除2種siRNA序列之間的相互干擾。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DcR3和EGFR雙基因共沉默與單基因沉默相比，細胞增殖明顯受抑制，細胞凋亡明顯增加，且共沉默的作用明顯強于DcR3和EGFR的單基因沉默。DcR3可抑制FasL/Fas途徑和LIGHT與受體HVEM/TR2和LTI3R的相互結(jié)合，抑制細胞凋亡作用；EGFR被EGF等配體激活后發(fā)生二聚體化并引發(fā)胞內(nèi)段發(fā)生酪氨酸激酶活性，進一步激活下游信號通路，調(diào)節(jié)細胞生長、增殖等生理過程[19]。共同沉默2個基因可起到協(xié)同抑制作用，促使細胞增殖受抑制，凋亡明顯增加。本實驗結(jié)果顯示:同時沉默DcR3和EGFR基因較單獨沉默在抑制增殖和誘導凋亡方面更具有優(yōu)勢。

本研究siRNA介導DcR3和EGFR雙基因共沉默為結(jié)腸癌的靶向治療提供了體外實驗依據(jù)，初步探討聯(lián)合共同作用于結(jié)腸癌細胞2個基因靶點在腫瘤靶向治療中的可行性，為結(jié)腸癌的治療提供了一個新的思路。

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(編輯：何佳鳳)

The Effects of Co-silence of DcR3 and EGFR Genes on SW480 Cell Line Growthinvitro

YANG Shugang, LIN Jianan, CHEN Shaoqin, YE Jianxin

Department of Gastrointestinal Surgery 2 Section, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China

Objective To explore the effects of co-silence of decoy receptor 3 (DcR3) and epidermal growth factor receptor(EGFR) genes on the proliferation and apoptosis of SW480 cell lineinvitro. Methods According to the siRNA design principle, three siRNA target sequences on DcR3 and EGFR genes were synthesized respectively. And siRNA was transfected into SW480 cells by Lipofectamine 2000 transfection methods. Real-time qPCR and Western-blot methods were used to detecte the mRNA and protein expression of DcR3 and EGFR of the SW480 cells after transfection for 48 hours. The highest inhibition efficiency siRNA sequences were selected and then transfected into SW480 cells using control-siRNA, DcR3-siRNA, EGFR-siRNA or DcR3-EGFR-siRNA co-silence. MTT method was used to measure cell proliferation and the flow-cytometry method was used to determine cell apoptosis rate after transfection. Results The highest inhibition rate on SW480 proliferation was co-silence of DcR3 and EGFR genes group compared with DcR3-siRNA or EGFR-siRNA group(P<0.05). And the DcR3-EGFR-siRNA co-silence group apoptosis rate(20.1±1.7)% were significantly increased compared with DcR3-siRNA group (16.5±2.2)% or EGFR-siRNA group(15.9±1.3)% (P<0.05). Conclusion Co-silence of DcR3 and EGFR genes can inhibit cell proliferation and induce cell apoptosis more effectively than DcR3 or EGFR genesilence singly.

receptors, tumor necrosis factor, member 6b; receptor, epidermal growth factor; colonic neoplasms; *genes; *gene silencing; apoptosis; cell proliferation

2016-10-11

福建省教育廳科技項目(JA10146)；福建省科技計劃重點項目(2014y0021)

福建醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院胃腸外科二區(qū)，福州 350005

楊樹鋼，男，主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士

葉建新. Email: yjx0201@vip.sina.com

R394； R394.114； R394.2； R735.35

A

1672-4194(2017)01-0024-06