張雪，SHI Hao，李士澤，李云龍，劉鵬，甄莉，李鵬，楊玉英

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319；2.弗吉尼亞理工大學農(nóng)業(yè)與生命科學學院）

O-GlcNAc對冷應(yīng)激下小鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞Caspase-3的影響

張雪1，SHI Hao2，李士澤1，李云龍1，劉鵬1，甄莉1，李鵬1，楊玉英1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319；2.弗吉尼亞理工大學農(nóng)業(yè)與生命科學學院）

O-連接的N-乙酰葡糖胺糖基化修飾（O-GlcNAcylation）是一種存在于蛋白質(zhì)Ser/Thr上的翻譯后修飾，主要是由OGlcNAc催化轉(zhuǎn)移酶（簡稱OGT）和O-GlcNAc水解酶（簡稱OGA）調(diào)控的動態(tài)過程。其過程與磷酸化相似，在多種細胞過程中扮演著重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路角色，并與神經(jīng)退行性疾病、Ⅱ型糖尿病、癌癥等許多疾病的發(fā)病機理密切相關(guān)。主要是在低溫應(yīng)激下，通過抑制劑來調(diào)控OGT和OGA，間接調(diào)控小鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞內(nèi)O-GlcNAc的含量，來探討O-GlcNAc對骨骼肌衛(wèi)星細胞凋亡的作用。實驗分為正常對照組、OGA高表達組、OGT高表達組，經(jīng)過常溫（37℃）和亞低溫（32℃）不同條件的處理，采用ELISA方法檢測Casp-3指標的變化。結(jié)果顯示：冷應(yīng)激處理后，人為調(diào)控骨骼肌衛(wèi)星細胞內(nèi)O-GlcNAc的含量后，所檢測的指標有明顯差異（P＜0.05）。結(jié)果說明：在低溫應(yīng)激條件下，O-GlcNAc降低會促進細胞凋亡，從而降低了小鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞的抗應(yīng)激能力，對骨骼肌衛(wèi)星細胞造成了一定的影響。

冷應(yīng)激；O-GlcNAc；骨骼肌衛(wèi)星細胞

O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶（OGT）最早是在大鼠肝臟提取物中分離出來的，主要在細胞核內(nèi)表達，并且具有高度保守性，各組織中均可檢測到，是哺乳動物細胞中負責O-GlcNAc糖基化轉(zhuǎn)移的唯一酶。經(jīng)研究學者鑒定，由OGT催化的成千上萬種細胞質(zhì)以及核蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化都與細胞過程有著聯(lián)系，如基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、營養(yǎng)傳感、神經(jīng)元功能、細胞周期進程、淋巴細胞激活和應(yīng)激反應(yīng)等[1-6]。O-GlcNAc水解酶（OGA）有130 kDa和75 kDa兩種亞型，以O(shè)-GlcNAc為特異性底物。中性環(huán)境下可去掉O-GlcNAc修飾蛋白上的N-乙酰葡萄糖胺，且具有特異性。在細胞凋亡起始時，O-GlcNAcase可被胱天蛋白酶3（caspase-3）迅速剪切，產(chǎn)生一個65 kD的片段且仍然具有糖苷酶活性，由此可見其在細胞凋亡中也可能發(fā)揮作用[7]。

骨髓肌是具有收縮能力的肌細胞（由于其形狀成幼長的纖維狀，所以亦稱作肌纖維）所組成。骨骼肌約占人體總重的40%～60%，并且包含了機體內(nèi)50%～75%的蛋白質(zhì)[8]，任何的身體活動和體育活動，都是骨骼肌收縮的完成，直接影響人體的力量和耐力。Daniel Bovet經(jīng)大量研究證實：骨骼肌在血糖利用方面作用極其重要，人體85%的血糖轉(zhuǎn)化和71%的糖元儲存由骨骼肌完成的。專家研究發(fā)現(xiàn)，99.8%的糖尿病人骨骼肌出現(xiàn)弱化甚至萎縮現(xiàn)象。D’Souza等人發(fā)現(xiàn)糖尿病主要是通過影響衛(wèi)星細胞的活性來損害肌再生細胞的生成[9]。然而許多研究學者認為蛋白質(zhì)O-GlcNAc水平是糖尿病病理學發(fā)生的一個誘發(fā)因素[10]。因此O-GlcNAc對骨骼肌衛(wèi)星細胞的作用受到了越來越多的學者關(guān)注，人們認為O-GlcNAc在骨骼肌中扮演著重要的營養(yǎng)代謝傳感器的角色。研究學者通過小鼠模型和體外細胞培養(yǎng)實驗表明，不適當?shù)腛-GlcNAc糖基化會損害肌纖維的形成，并誘導(dǎo)肌肉萎縮[11-12]。那么當冷應(yīng)激誘導(dǎo)O-GlcNAc調(diào)控的蛋白質(zhì)水平發(fā)生變化后，對骨骼肌衛(wèi)星細胞的營養(yǎng)代謝到底有怎么樣的影響是值得我們探討的。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

7～10日齡昆明小鼠，體重約（4±0.2）g，由黑龍江八一農(nóng)墾大學動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑

OGT抑制劑（3-（2-adamantanylethyl）-2-[（4-chlorophenyl）azamethylene]-4-oxo-1，3-thiazaperhyd roine-6-carboxylic acid，TT04）：購自美國Tim Tec；OGA抑制劑（Thiamet，ThG）：購自美國 Cayman Chemical；二甲基亞砜 DMSO：購自美國 Gayload Slidell，La；GR&D Systems即用型試劑盒：Casp-3 ELISA檢測試劑盒。

1.3 試驗設(shè)備

318MC型酶標儀：上海三科器有限公司

SHP-250型生化培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司

2 試驗方法

2.1 小鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離、培養(yǎng)

選用新生7～10 d，體重（4±0.2）g的昆明小鼠，75%酒精浸泡消毒，無菌條件下剝皮，完整取下新生小鼠后肢肌肉、背部肌肉，以及斜肩前肌肉、隔膜肌，并將其分割成細小碎塊，進行第一次消化（Ham’s F-10培養(yǎng)基：含500 U·mL-1的膠原酶II，10%馬血清和1%青霉素/鏈霉素）與37℃、5%CO2細胞孵箱中消化約90 min；之后加入等體積的洗滌劑（Ham’s F-10含10%馬血清）終止消化，靜置1 min，500 g分離1 min，棄掉上清（第1次洗滌），之后再重復(fù)洗兩次；進行第二次消化37℃下消化30 min，每10 min震蕩一次。在消化結(jié)束后，加入10 mL洗滌劑（F-10，10% HS）終止消化，500 g離心1 min，上清液用40微米篩目細胞過濾器過濾到50 mL離心管中，1 000 g分離5 min，加入生長培養(yǎng)基（F-10含20%胎牛血清FBS，1%抗生素，5 NG·mL-1的bFGF），每個35 mm培養(yǎng)皿中接種約5×104個細胞，于37℃、5%CO2細胞孵箱中進行培養(yǎng)；24 h后將更換細胞培養(yǎng)液（F-10培養(yǎng)基，20%牛血清，5 NG·mL-1bFGF，1%雙抗），于37℃、5%CO2細胞孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)；每3天更換生長培養(yǎng)液，7～8 d進行純化，用預(yù)先溫熱的PBS洗滌培養(yǎng)皿，加入細胞分化培養(yǎng)基（2%馬血清的DMEM中，用1%青霉素/鏈霉素），每2天換一次培養(yǎng)液，鏡下觀察細胞狀態(tài)，14 d左右可以準備進行后續(xù)實驗處理。

2.2 樣品的收集

將上述方法培養(yǎng)小鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞，在收集樣品的前一天，無菌條件下將細胞的原培養(yǎng)基棄掉，用預(yù)熱的PBS清洗兩遍，更換成無血清的培養(yǎng)基，將細胞分為正常對照組，OGA高表達組，OGT高表達組。正常組不做任何處理，OGT高表達組是通過在該組細胞內(nèi)加入OGA的抑制劑ThG，從而使O-Glc－NAc信號積聚；OGA高表達組是通過在該組細胞內(nèi)加入OGT的抑制劑TT04，從而達到O-GlcNAc信號削弱的效果。將三組細胞放入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，再分別置于常溫（37℃）和低溫（32℃2 h、32℃ 4 h、32℃ 6 h、32℃ 8 h） 條件下進行處理。收取不同條件下的三組細胞的細胞培養(yǎng)基，3 000 rpm，4℃離心10 min，收取各組上清液，做好標記，置于-20℃下保存。

2.3 ELISA檢測

樣品室溫下進行解凍，并確保其可以解凍的充分均勻；取出保存在2～8℃的ELISA試劑盒，使用前應(yīng)先在室溫下平衡20 min；然后按照ELISA檢測試劑盒說明書進行檢測，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔的OD值并記錄數(shù)據(jù)；最后處理數(shù)據(jù)并利用SPSS V19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析凋亡指標：人胱天蛋白酶3（Casp-3）。

3 結(jié)果

采用ELISA方法，分別計算各組小鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞Casp-3的濃度。結(jié)果如圖1所示，正常培育溫度37℃狀態(tài)下，OGT高表達處理組Casp-3濃度與正常對照組相比有明顯差異（P＜0.05），而OGA高表達組Casp-3濃度與正常對照組相比有顯著差異（P＜0.01）。亞低溫32℃狀態(tài)下：當骨骼肌衛(wèi)星細胞處于亞低溫應(yīng)激2 h時，OGT高表達處理組Casp-3濃度與常溫對照組相比有明顯差異（P＜0.05），而OGA高表達組Casp-3濃度與常溫對照組相比差異顯著（P＜0.01）；在細胞處于應(yīng)激6 h內(nèi)，OGT高表達處理組 Casp-3濃度與常溫對照組相比有明顯差異（P＜0.05），而OGA高表達組Casp-3濃度與常溫對照組相比無明顯差異（P＞0.05）；當應(yīng)激8 h后，各組細胞均出現(xiàn)明顯凋亡狀態(tài)，無明顯差異（P＞0.05）。

圖1 不同條件下三組小鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞中Casp-3檢測結(jié)果圖Fig.1 The concentration of Casp-3 in mouse skeletal muscle satellite cells from three groups under different conditions

4 討論

細胞凋亡是基因調(diào)控的細胞自殺行為，在生理或病條件下均會發(fā)生，以此來維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（Caspase）是一類與凋亡發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的蛋白水解家族，其中Caspase3是細胞凋亡主要執(zhí)行者并與凋亡的形態(tài)學特征密切相關(guān)，其活化是細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，一旦被激活，即發(fā)生下游的級聯(lián)反應(yīng)，使凋亡不可避免，因而Caspase3被稱為“死亡蛋白酶”。所以當細胞中Casp-3的濃度增高，說明細胞的凋亡率增加。多種刺激均可導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡，而冷應(yīng)激主要是使細胞內(nèi)ROS升高，從而導(dǎo)致細胞調(diào)亡[13-14]。

當骨骼肌衛(wèi)星細胞處于37℃狀態(tài)下，OGT高表達處理組中Casp-3的濃度明顯低于正常對照組，然而人為地調(diào)控OGT高表達，主要目的是使O-Glc－NAc信號積聚，說明O-GlcNAc增多會抑制骨骼肌衛(wèi)星細胞的凋亡；相反，人為調(diào)控OGA高表達，主要目的是使O-GlcNAc信號減弱，說明O-GlcNAc降低時會促進骨骼肌衛(wèi)星細胞的凋亡。當骨骼肌衛(wèi)星細胞處于亞低溫32℃狀態(tài)下，前6 h內(nèi)，OGT高表達組Casp-3的濃度明顯低于正常對照組，但是相比37℃下的OGT高表達組要高一些。說明人為地調(diào)控OGT高表達使O-GlcNAc信號積聚后，會抑制骨骼肌衛(wèi)星細胞的凋亡，但是冷應(yīng)激會導(dǎo)致O-GlcNAc信號減弱，所以32℃狀態(tài)下Casp-3的濃度相比37℃下會有所增高，并且32℃下OGA高表達也從反面證實了這一點。這一結(jié)果表明O-GlcNAc下調(diào)會抑制骨骼肌衛(wèi)星細胞的凋亡，并且在亞低溫狀態(tài)下也會相應(yīng)地抑制骨骼肌衛(wèi)星細胞凋亡，從而更加說明O-Glc－NAc在骨骼肌衛(wèi)星細胞中扮演著重要的角色，并且在低溫狀態(tài)下，其含量減少對骨骼肌衛(wèi)星細胞的抗氧能力的保護也相對減少。這一觀點讓我們不禁會想到，冷應(yīng)激對動物肌肉品質(zhì)的影響，這也是值得我們進一步探討的問題。

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Influence of O-GlcNAc on Mouse Skeletal Muscle Satellite Cells Caspase-3 under Cold Stress

Zhang Xue1，SHI Hao2，Li Shize1，Li Yunlong1，Liu Peng1，Zhen Li1，Li Peng1，Yang Yuying1
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.College of Agricultural and life Science，Virginia Polytechnic Institute and State University）

O-GlcNAcylation，a dynamic process that was catalyzed by O-GlcNAc transferase（OGT）and O-GlcNAcase（OGA），represented a signal transduction pathway that played critical roles in a variety of cellular processes.The process was similar to phosphorylation，and was closely related to the pathogenesis of many diseases，such as neurodegenerative diseases，Ⅱ diabetes and cancer.The important role of O-GlcNAc in skeletal muscle satellite cells was explored under low temperature stress through inhibitors OGT and OGA，indirect regulation O-the content of GlcNAc mice skeletal muscle satellite cell.Experiment was divided into normal control group，OGT high expression group and OGA high expression group after normal temperature（37℃）and low temperature（32℃）of different conditions，contents of Casp-3 were detected by ELISA.Results showed that after treated with cold stress，artificial regulation of skeletal muscle satellite cells after the content of O-GlcNAc，the detection index had obvious difference（P＜0.05）.Results suggested that under the condition of low temperature stress，low O-GlcNAc could effectively inhibit the production in cells and improve the antioxidant capacity of skeletal muscle satellite cells in mice，which played an active protection role in skeletal muscle satellite cells.

cold stress；O-GlcNAc；skeletal muscle satellite cells

Q58

A

1002-2090（2017）02-0025-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.02.005

2016-03-20

“十三五”國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0501210）；國家自然科學基金項目（NO.31272524）；農(nóng)業(yè)部948重點計劃項目（2011-G35）。

張雪（1989-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院2013級碩士研究生。

楊玉英，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：yalele258@sina.com。