王潔，張振新，王雅梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與藝術(shù)設(shè)計(jì)學(xué)院，呼和浩特010018)

微納米黃連的制備及其對木材白腐菌的抑菌性

王潔，張振新，王雅梅*

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與藝術(shù)設(shè)計(jì)學(xué)院，呼和浩特010018)

以中草藥黃連為原料，使用物理干法球磨制備微納米黃連，檢測其對木材的防腐效果。采用正交試驗(yàn)方法研究球磨轉(zhuǎn)速、球磨時(shí)間、小球數(shù)對微納米黃連制備的影響，并確定最佳制備條件和最小抑菌質(zhì)量濃度，以激光粒度儀與掃描電子顯微鏡(SEM)對微納米黃連的粒度分布與形貌進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：微納米黃連粉體較普通黃連粉體有更明顯的抑菌效果，經(jīng)過試驗(yàn)篩選得出制備微納米黃連粉體的最佳工藝條件為球磨轉(zhuǎn)速280 r/min、球磨時(shí)間4 h、小球數(shù)60個，此時(shí)菌落直徑僅為2.91 mm，最小抑菌質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。SEM與顯微粒度檢測結(jié)果顯示，微納米黃連的主要形貌為塊狀和不規(guī)則的球狀，粒度分布均勻且為分散狀，粒徑寬度和長度大多分布在200～700 nm。

微納米；木材防腐劑；黃連；干法球磨；抑菌；白腐菌

木材防腐處理是實(shí)現(xiàn)木材高附加值利用的重要途徑[1]。目前，木材防腐的主要目標(biāo)是開發(fā)出一種只對微生物有害，而對人獸無害、對環(huán)境無污染、對金屬無腐蝕，以及綜合性能優(yōu)異的新型木材防腐劑[2-3]。中草藥是天然環(huán)保型材料，選用中草藥抑制木腐菌生長可解決環(huán)保問題，但是仍存在其他不足。首先，中草藥的有效抑菌活性成分較少，且有效成分的提取工藝復(fù)雜，提取量少，降低了中草藥的使用效率；其次，在中藥提取過程中只提取了單一的有效成分，卻忽視了其他有效成分的藥用性，使資源得不到有效利用。因此，如何更方便高效地利用中草藥是目前需要解決的首要問題。余園媛等[4]研究表明，黃連(CoptischinensisFranch.)對大量真菌有一定的抑制作用，且對腐蝕木材的彩絨革蓋菌(Coriolusversicolor)有明顯的抑制效果。黃連對木腐菌能夠產(chǎn)生抑制作用主要是因?yàn)槠鋬?nèi)部的活性有效成分鹽酸小檗堿和巴馬丁[5]，但鹽酸小檗堿只占黃連質(zhì)量的6.88%～13.64%[6]。

為提高黃連的利用率，改善抑菌效果，減少用藥量，節(jié)約有限的資源[7-8]，筆者將納米技術(shù)應(yīng)用到中草藥防腐領(lǐng)域。中草藥產(chǎn)生的藥理效應(yīng)不能僅歸功于該藥特有的化學(xué)組成，還與藥物的物理狀態(tài)密切相關(guān)[9]。納米技術(shù)從改變中草藥的粒徑入手，直接解決其水溶性問題，避免了復(fù)雜的煎熬或提取工藝。納米技術(shù)應(yīng)用于中藥可使中藥物質(zhì)核100%破壁，使其全部釋放，取得最佳使用效果。

陳力等[10]對微納米中藥的制備方法進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，制備微納米中藥時(shí)不宜采用化學(xué)方法或制備工藝需要高溫高壓等苛刻條件的物理方法，這可以保留中草藥原有的有效成分、化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥效性。球磨法是一種普通的機(jī)械粉碎法，是國內(nèi)外制備超細(xì)粉體運(yùn)用較廣的方法[11-13]。與普通球磨機(jī)相比，行星式球磨機(jī)在工作過程中會產(chǎn)生更高的能量，對物料產(chǎn)生的沖擊與磨削作用更強(qiáng)[14]。因此，本試驗(yàn)利用變頻行星式球磨機(jī)對黃連進(jìn)行物理干法球磨，通過正交試驗(yàn)研究了球磨轉(zhuǎn)速、球磨時(shí)間和小球數(shù)3個因素對微納米黃連粒徑及抑菌性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

毛茛科植物黃連，購于呼和浩特市北域藥房；試驗(yàn)菌種為白腐菌(彩絨革蓋菌)，購于中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)活化。

變頻行星式球磨機(jī)，南京科析實(shí)驗(yàn)儀器研究所；WK-1200A型高速藥物粉碎機(jī)，青州市精誠機(jī)械有限公司；LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；BSA224S-CW型電子天平，精度0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DHG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；ZHWY-1102型恒溫培養(yǎng)搖床，金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；N4-plus多角動態(tài)激光散射顆粒粒度測定儀，美國Coulter公司；Hitachi S-4800型場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微納米黃連的制備

將同批次購買的黃連粉碎，過200目(75 μm)篩，絕干密封放置備用，采用物理干法球磨方法制備微納米黃連。在不考慮交互作用條件下，對球磨轉(zhuǎn)速、球磨時(shí)間、小球數(shù)3個球磨參數(shù)進(jìn)行正交試驗(yàn)，采用L9(34)正交表進(jìn)行9次試驗(yàn)，以菌落直徑大小為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行抑菌性能分析，從而得出最佳生產(chǎn)工藝條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2 微納米黃連的抑菌性能檢測

將9次正交試驗(yàn)所制微納米黃連分別編號為1～9，未研磨黃連作為對照組編號為10，空白組編號為11進(jìn)行抑菌對比試驗(yàn)。將1～10號藥末分別用水加熱溶解制成10 mg/mL的藥液，與馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)混合制成藥液質(zhì)量濃度為2 mg/mL的帶毒培養(yǎng)基并對應(yīng)編號。每一種帶毒培養(yǎng)基設(shè)3個重復(fù)，另設(shè)3個空白組，于立式壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃滅菌30 min。在無菌操作條件下將等量的菌體分別接種于培養(yǎng)皿，倒置放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱，于80%相對濕度、26℃下培養(yǎng)7 d，每天同一時(shí)刻用滅菌的游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量各平板菌落直徑。

1.2.3 最小抑菌質(zhì)量濃度試驗(yàn)

選取抑菌效果最好的一組樣品，分別稱取17.5，35.0，70.0，350.0和700.0 mg樣品倒入已備好的液體培養(yǎng)基中搖勻，分別配置為0.1，0.5，1.0，5.0和10.0 mg/mL 5個質(zhì)量濃度的液體帶毒培養(yǎng)基。每個質(zhì)量濃度設(shè)3個重復(fù)，另設(shè)3個空白組，于立式壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃滅菌30 min。在無菌操作條件下將同樣大小的菌種接種于錐形瓶中，震蕩使菌混合均勻并置于27℃、45 r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)7 d。每天同一時(shí)刻觀察菌絲生長情況，培養(yǎng)第7天后用同種定性濾紙，將菌絲過濾后稱出濕質(zhì)量并記錄。稱量后將菌絲與濾紙一起置于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，在80℃下烘至質(zhì)量恒定，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 微納米黃連結(jié)構(gòu)與粒徑檢測

取少量樣品，用適當(dāng)?shù)娜苊?水或乙醇)分散，滴取混懸液后自然干燥，然后粘臺噴金，置于掃描電子顯微鏡(SEM)和顯微粒度儀下觀察微觀結(jié)構(gòu)。取適量樣品，加入一定量的分散溶媒將樣品分散制成 0.001～0.002 g/mL的混懸液，置于粒度分析儀中測定(測定前可進(jìn)行超聲分散)粒徑分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 微納米黃連粒徑分析

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，5號樣品的抑菌圈直徑僅為2.91 mm，抑菌效果最好。因此，本試驗(yàn)選取5號樣品與隨機(jī)抽選的抑菌效果一般的9號樣品分別進(jìn)行粒徑檢測。

5號和9號微納米黃連粉體經(jīng)SEM和顯微粒度儀測定的微觀形貌圖分別見圖1和圖2。由圖1a和圖2a可以看出，5號粉體粒徑小、多分散，主要形貌為塊狀與不規(guī)則球狀。由圖1b、1c和圖2可以看出，5號粉體較9號粉體粒度分布更均勻，9號粉體的小顆粒多附著于大顆粒表面。5號粉體的寬度和長度多分布在200～700 nm，9號粉體的寬度和長度多分布在0.5～3.0 μm。結(jié)合抑菌試驗(yàn)結(jié)果可知，質(zhì)量濃度相同的藥液，顆粒粒徑越小抑菌效果越好。

表2 正交試驗(yàn)和極差分析結(jié)果

注：Ki和ki分別為某因素的i水平對抑菌圈直徑的總體和平均影響程度；R為某因素不同水平之間的極差。

圖1 微納米黃連的SEM圖Fig. 1 SEM images of the micro-nano copits

圖2 微納米黃連的顯微形貌圖Fig. 2 Micrograph of the micro-nano copits

2.2 抑菌試驗(yàn)分析

微納米和普通黃連粉體對白腐菌的抑菌作用見圖3。由圖3可以看出，11號菌落直徑最大，這說明黃連對白腐菌有明顯的抑制作用；1～9號菌落直徑均小于10號，并且1～9號菌落直徑從第3天到第7天的增長速度較10號更平緩；隨著天數(shù)的增加，菌落的增長速率逐漸減小，從第6天到第7天時(shí)1～9號菌落直徑基本無變化，而10號仍有增長，表明同一質(zhì)量濃度的微納米黃連較普通黃連的抑菌效果明顯增強(qiáng)，抑菌周期減小。黃連抑制白腐菌生長主要是其內(nèi)部的有效成分鹽酸小檗堿和巴馬丁的作用，而黃連中的有效成分需要經(jīng)過溶劑的浸潤、溶脹、滲透和分散才能溶出。對黃連本身而言，有效抑菌活性成分溶出主要受細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和溶劑接觸面積的影響。因此，當(dāng)黃連經(jīng)過研磨制成微納米粉體后，藥材中的細(xì)胞壁破碎，成分溶出不受細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的阻礙，使得有效成分溶出量增多，并且縮短了溶劑進(jìn)入顆粒中心的距離，加快了溶出速率，水溶性增強(qiáng)，從而表現(xiàn)出較普通黃連更強(qiáng)的抑菌性。除10號和11號粉體外，5號粉體的菌落最小，抑菌效果最好，7號粉體的菌落最大，抑菌效果最差，其他粉體表現(xiàn)出各不相同的抑菌效果。這是由于在不同條件下制備的粉體由于粒徑不同，導(dǎo)致粉體破壁率不同，有效成分的溶出量不同，從而表現(xiàn)出不同的抑菌效果。微納米黃連的粒徑越小，比表面積越大，與溶出介質(zhì)間的有效接觸越大，水溶性越強(qiáng)，同時(shí)溶劑進(jìn)入顆粒中心的距離越短，有效抑菌活性成分的溶出速率越大，從而使其更多更快地作用于白腐菌[15]。

圖3 微納米和普通黃連粉體對木材白腐菌的抑菌作用Fig. 3 Antimicrobial effects of micro-nano and normal copits on wood white-rot fungi

由表2可知，最優(yōu)制備方案為球磨轉(zhuǎn)速為280 r/min、球磨時(shí)間4 h、小球數(shù)60個，極差的絕對值由大到小依次為A、C、B。其中A因素影響最大，即首先要考慮球磨機(jī)轉(zhuǎn)速，選280 r/min；其次要考慮C，即小球數(shù)為60個；最后考慮B，即球磨時(shí)間為4 h。這是因?yàn)樵谘心ミ^程中，研磨球由于其較大的慣性力而對物料產(chǎn)生強(qiáng)烈撞擊，并且撞擊力隨著轉(zhuǎn)速的增加成平方級增大，增加了給物料破碎提供的能量，但是當(dāng)轉(zhuǎn)速增加至330 r/min時(shí)，由于研磨球與物料的質(zhì)量偏差太大，會導(dǎo)致兩者產(chǎn)生的離心力差異過大而出現(xiàn)分層現(xiàn)象，減小了兩者之間的接觸。此外，研磨時(shí)間過長會對物料顆粒造成二次團(tuán)聚，影響最終粒徑。因此，球磨轉(zhuǎn)速為280 r/min、球磨時(shí)間4 h、小球數(shù)60個是最佳球磨效果參數(shù)。

正交試驗(yàn)的方差分析見表3，因素A和C對試驗(yàn)結(jié)果都有非常顯著的影響，其中因素A的影響最顯著，而因素B對試驗(yàn)結(jié)果無顯著影響。

表3 方差分析

注：*表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 最小抑菌質(zhì)量濃度分析

圖4 菌絲干質(zhì)量隨抑菌質(zhì)量濃度變化趨勢Fig. 4 Change trend of hypha dry mass as a function of antibacterial mass concentration

最佳條件下制備的微納米黃連在不同質(zhì)量濃度下抑制白腐菌生長的菌絲干質(zhì)量變化趨勢見圖4。由圖4可知，菌絲干質(zhì)量隨著微納米黃連質(zhì)量濃度的減小而逐漸增大，當(dāng)質(zhì)量濃度由10.0 mg/mL減小至5.0 mg/mL時(shí)，菌絲干質(zhì)量變化較平緩；當(dāng)質(zhì)量濃度小于0.5 mg/mL時(shí)，菌絲干質(zhì)量的增長幅度較大，抑菌效果明顯減小；當(dāng)質(zhì)量濃度減小為0.1 mg/mL時(shí)，菌絲干質(zhì)量與空白組接近，幾乎沒有抑菌效果。這是由于當(dāng)質(zhì)量濃度在10.0 mg/mL與5.0 mg/mL之間時(shí)，藥液中的有效抑菌活性成分達(dá)到了抑菌水平；當(dāng)質(zhì)量濃度小于0.5 mg/mL時(shí)，有效抑菌活性成分不足以抑制菌種生長。根據(jù)最小抑菌質(zhì)量濃度的定義可得，在球磨轉(zhuǎn)速為280 r/min、球磨時(shí)間4 h、小球數(shù)60個的條件下制備的微納米黃連最小抑菌質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。

3 結(jié) 論

微納米黃連的主要形貌為塊狀和不規(guī)則的球狀，抑菌效果最佳的5號粉體粒度分布較抑菌效果一般的9號粉體更均勻，5號粉體的寬度和長度多分布在200～700 nm，9號粉體的寬度和長度多分布在0.5～3.0 μm。質(zhì)量濃度相同的藥液，顆粒粒徑越小抑菌效果越好。不同條件下制備的微納米黃連由于粒徑的減小，有效抑菌成分的水溶性增強(qiáng)，溶出速率加快，較普通黃連表現(xiàn)出更明顯的抑菌效果。通過菌落直徑的比較確定微納米黃連的最佳制備工藝條件為：球磨轉(zhuǎn)速280 r/min、球磨時(shí)間4 h、小球數(shù)60個，在此條件下制得的微納米黃連粒徑均勻分布，顆粒為分散狀，菌落直徑僅為2.91 mm，抑菌效果最佳。當(dāng)微納米黃連抑菌質(zhì)量濃度低于0.5 mg/mL時(shí)，抑菌效果急劇下降；當(dāng)質(zhì)量濃度降低至0.1 mg/mL時(shí)幾乎沒有抑菌效果。因此，微納米黃連的最小抑菌質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。

本研究初步證明了微納米黃連較普通黃連的抑菌效果更強(qiáng)，下一步應(yīng)該對微納米黃連分子結(jié)構(gòu)、微納米黃連物質(zhì)核破壁情況、微納米與普通黃連的抑菌機(jī)理差異、粒徑對抑菌效果的影響及最佳粒徑范圍等進(jìn)行深入研究，為中草藥防腐劑的高效利用提供借鑒。

[1]馬紅霞, 謝桂軍, 何雪香, 等. ACQ復(fù)配防水染色劑及其處理木材性能[J]. 林業(yè)與環(huán)境科學(xué), 2016, 32(4):17-22. MA H X, XIE G J, HE X X, et al. Properties of ACQ compound with dye and paraffin wax emulsion and its properties of treated wood[J]. Forestry and Environmental Science, 2016, 32(4):17-22.

[2]曹金珍. 國外木材防腐技術(shù)和研究現(xiàn)狀[J]. 林業(yè)科學(xué), 2006, 42(7):120-126. CAO J Z. A review on wood preservation technologies and research[J]. Scientia Silvae Sinicae, 2006, 42(7):120-126.

[3]張佳彬, 黃海兵, 張長武, 等. 生物質(zhì)木材防腐劑的研究現(xiàn)狀與展望[J]. 化工新型材料, 2016, 44(4):35-40. ZHANG J B, HUANG H B, ZHANG C W, et al. Research status and prospect of biomass wood preservative[J]. New Chemical Materials, 2016, 44(4):35-40.

[4]余園媛, 王伯初, 彭亮, 等. 黃連的藥理研究進(jìn)展[J]. 重慶大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2006, 29(2)：107-111. YU Y Y, WANG B C, PENG L, et al. Advances in pharmacological studies of coptis Chinese[J]. Journal of Chongqing University(Natural Science Edition), 2006, 29(2):107-111.

[5]蔣世一, 王喜明, 王雅梅. 20種中草藥水提液對白腐菌和褐腐菌的抑菌作用[J]. 木材加工機(jī)械, 2014, 25(5):33-35. JIANG S Y, WANG X M, WANG Y M. Antifungal activities of 20 kinds of Chinese herbal extracts of water wood white-rot fungi and wood brown-rot fungi[J]. Wood Processing Machinery, 2014, 25(5):33-35.

[6]鄒晨輝, 申竹芳. 黃連生物堿抗糖尿病機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2004, 35(11):附2-附5. ZOU C H, SHEN Z F. Anti-diabetic mechanism of alkaloids in coptis chinensis[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2004, 35(11):s2-s5.

[7]汪楊, 吳偉. 隱形納米粒的體內(nèi)靶向性[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2004, 39(1):7-11.

[8]NISHIOKA Y, YOSHINO H. Lymphatic targeting with nanoparticulate system [J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2001, 47:55-64.

[9]李泳雪, 王春龍, 李杰. 納米技術(shù)在現(xiàn)代中藥制劑中的應(yīng)用[J]. 中草藥, 2002, 33(8):673-675. LI Y X, WANG C L, LI J. Application of nanotechnique to modern preparation of Chinese materia medica[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2002, 33(8):673-675.

[10]陳力, 吳懿平. 微米中藥及其制備技術(shù)[J]. 中草藥, 2002, 33(10):865-868. CHEN L, WU Y P. Micrometer Chinese materia medica and its preparation technique[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2002, 33(10):865-868.

[11]FUERSTENAU D W, ABOUZEID A Z M. The energy efficiency of ball milling in comminution[J]. International Journal of Mineral Processing, 2002, 67(1/2/3/4):161-185.

[12]KOTAKE N, SUZUKI K, ASAHI S, et al. Experimental study on the grinding rate constant of solid materials in a ball mill[J]. Powder Technology, 2002,122(2/3):101-108.

[13]TANGSATHITKULCHAI C. Effects of slurry concentration and powder filling on the net mill power of a laboratory ball mill[J]. Powder Technology, 2003, 137(3):131-138.

[14]CHATTOPADHYAY P P, MANNA I, TALAPATRA S, et al. A mathematical analysis of milling mechanics in a planetary ball mill[J]. Materials Chemistry and Physics, 2001, 68(1/2/3):85-94.

[15]丁志平, 孫毅坤, 喬延江. 不同粒徑黃連粉體中小檗堿體外溶出研究[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 27(3):60-62. DING Z P, SUN Y K, QIAO Y J. Examination of the in vitro dissolution of berberine in the coptis root powder of different granule diameters[J]. Journal of Beijing University of TCM, 2004, 27(3):60-62.

Preparation of micro-nano coptis and its antimicrobialactivity on white rot fungi

WANG Jie, ZHANG Zhenxin, WANG Yamei*

(College of Material Science and Art Design, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

To investigate the antifungal performance of the Chinese herbal medicine on wood, rhizoma coptis was used as a non-toxic and efficient raw material to prepare micro-nano coptis by the method of dry-ball milling. The effects of ball grinding time, ball grinding speed and ball number on the preparation of micro-nano copits were explored through the orthogonal test. The optimal preparation conditions were obtained by the comparison test of antifungal performance. The minimum antifungal mass concentration experiment determined the minimum fungi-static mass concentration of micro-nano coptis. The diameter distribution and morphology of nano-particles was examined by using the laser scattering particle size distribution analyzer and scanning electron microscopy (SEM) respectively. The results showed that the rhizoma coptis particles had more obvious fungistatic effect than the ordinary coptis did. The optimum parameters in the preparation of micro-nano coptis were as follows: the ball mill speed of 280 r/min, ball grinding time of 4 h and ball number of 60. The micro-nano coptis prepared in this condition were distributed with uniform particle size, and the bacteriostatic effect was the best. The minimum diameter of fungal colony was only 2.91 mm, and the minimum inhibitory mass concentration was 0.5 mg/mL. The results of SEM and microscope analysis showed that the main morphology of micro-nano copits was massive and irregular sphericity, and the particle size distribution was uniform and dispersive. Particle diameter and length were mostly ranged between 200 nm and 700 nm. Had the best bacteriostatic effect, No.5 powder particle size distributed more uniform than No.9 powder. The width and height of No.5 powder ranged between 200 nm and 700 nm, while those of No.9 powder were between 0.5 μm and 3.0 μm. Under the same solution concentration, the smaller particle had better bacteriostatic effect.

micro-nano; wood preservative; rhizoma coptis; dry ball milling; antifungal; white rot fungi

2016-08-17

2016-10-20

國家優(yōu)秀青年科學(xué)基金(2014XYQ-13)。

王潔，女，研究方向?yàn)槟静谋Ｗo(hù)。通信作者：王雅梅，女，教授。E-mail:wangym80@126.com

S782.33

A

2096-1359(2017)02-0028-05