韓榮偉，于忠娜，劉璐，王軍，*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東萊陽265200）

響應(yīng)面法優(yōu)化直投式酸奶發(fā)酵劑的工藝研究

韓榮偉1，于忠娜2，劉璐1，王軍1，*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東萊陽265200）

直投式酸奶發(fā)酵劑因活性高、穩(wěn)定性好、使用簡便，已成為酸奶發(fā)酵劑的主要發(fā)展方向。嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus，St）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus，Lb）經(jīng)活化和純化后，以存活率為指標(biāo)，對混合發(fā)酵液的菌種混合比例、離心條件、預(yù)凍條件進(jìn)行單因素試驗。試驗結(jié)果表明混合發(fā)酵液的最佳制備條件為：St∶Lb=1∶1（體積比）、離心速度3000 r/min、離心時間10min、預(yù)凍溫度-80℃、預(yù)凍時間1 h；采用響應(yīng)面法對凍干菌懸液的保護(hù)劑pH、保護(hù)劑和菌泥平衡時間、保護(hù)劑和菌泥混合比例進(jìn)行優(yōu)化試驗，結(jié)果表明凍干菌懸液最佳制備條件為：保護(hù)劑pH6.6、平衡時間30min、保護(hù)劑和菌泥混合比例2∶1（mL/g），此時St存活率63.77%、Lb存活率66.03%，具有較好的市場前景和應(yīng)用價值。

嗜熱鏈球菌；保加利亞乳桿菌；直投式酸奶發(fā)酵劑；響應(yīng)面法

酸奶發(fā)酵劑是酸奶生產(chǎn)中至關(guān)重要的一部分，酸奶發(fā)酵劑的發(fā)酵性能直接關(guān)系到酸奶的品質(zhì)和質(zhì)量。酸奶發(fā)酵劑一般都是由嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，St）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，Lb）兩種菌組成[1-3]。將保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進(jìn)行組合制備直投式酸奶發(fā)酵劑，可以發(fā)揮不同優(yōu)良菌株的發(fā)酵性能，從而使得酸奶發(fā)酵劑同時具備發(fā)酵速率快、發(fā)酵產(chǎn)品黏度好、特征風(fēng)味濃郁、保健功能良好等優(yōu)良性能[4-7]。我國在凍干發(fā)酵劑的研制方面起步較晚，國內(nèi)現(xiàn)階段使用的酸奶發(fā)酵劑大多是從國外進(jìn)口。基于此，本文研究通過響應(yīng)面方法研究了直投式保加利亞乳桿菌—嗜熱鏈球菌復(fù)合發(fā)酵劑制備過程中混合發(fā)酵液及凍干菌懸液的制備條件，從而制備出一種高活性的直投式酸奶發(fā)酵劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌：臺灣亞芯生物科技有限公司；奶粉：伊利脫脂奶粉；氯化鈉、葡萄糖、乳糖、檸檬酸二銨、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸錳：萊陽市康德化工有限公司；乙酸鈉：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；吐溫-80：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；胰蛋白胨、牛肉膏酵母浸粉、中性紅：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Alpha 1-2 LD plus真空冷凍干燥機(jī)：德國CHRIST公司；Seven-Multi型pH/電導(dǎo)率/離子綜合測試儀：梅特勒-托利多公司；AR224CN電子天平：奧豪斯儀器上海有限公司；SW-CJ-1F超潔凈工作臺：蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；TGL-16C臺式離心機(jī)：上海安亭電子儀器廠。

1.3 試劑配制

培養(yǎng)基及緩沖液磷酸緩沖液、10%脫脂乳培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基及MRS培養(yǎng)基均按文獻(xiàn)中配方配制[8-12]。

1.4 方法

菌種活化→制備混合發(fā)酵液→離心混合發(fā)酵液→加入保護(hù)劑→預(yù)凍→真空冷凍干燥→獲得發(fā)酵劑

1.5 菌種活化

稱取St、Lb菌粉各1 g分別加入盛有9mLMC、MRS無菌液體培養(yǎng)基中，混合均勻后37℃恒溫培養(yǎng)24 h。取MC、MRS菌懸液各0.1mL涂布于MC、MRS固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h，然后挑取St、Lb的單個菌落分別接種于10mLMC、MRS無菌液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，獲得St、Lb菌懸液，備用。

1.6 混合發(fā)酵液處理條件的單因素試驗

1.6.1 混合發(fā)酵液的制備

將St和Lb分別按照活菌數(shù)1∶1、1∶2、2∶1的比例（體積比）接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，10 h后每2 h添加一次緩沖液，添加量均為1%（體積比）[12]，培養(yǎng)至16 h取出，獲得混合發(fā)酵液。然后分別進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.6.2 混合發(fā)酵液離心條件的確定

制備混合發(fā)酵液，在2 000、3 000、4 000 r/min條件下分別離心10、15、20min，取上清液和菌泥分別進(jìn)行活菌計數(shù)，計算出菌泥獲得率和離心存活率。

式中：X為離心存活率，%；N1為初始活菌數(shù)，cfu/mL；N2為菌泥活菌數(shù)，cfu/mL；N3為上清液活菌數(shù)，cfu/mL。

式中：M為菌泥獲得率，%；m1為離心后離心管總重，g；m2為離心管空重，g；m3為終止培養(yǎng)時培養(yǎng)物和離心管總重，g；m4為干離心管空重，g。

1.6.3 保護(hù)劑的加入

加入保護(hù)劑后可以使保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌保持穩(wěn)定的活性，減弱真空冷凍干燥過程中對兩種菌的破壞。本試驗選取10%的脫脂乳作為凍干保護(hù)劑[8]。

1.6.4 預(yù)凍溫度和預(yù)凍時間的確定

菌泥均勻混合等量10%脫脂乳，在-20、-80℃條件下預(yù)凍不同的時間1、3、5 h后，將完全凍結(jié)的樣品取出，采用平板計數(shù)法進(jìn)行菌落計數(shù)。檢測預(yù)凍前后的活菌數(shù)，計算兩種菌的預(yù)凍存活率。

式中：Y為預(yù)凍存活率，%；N4為預(yù)凍后活菌數(shù)，cfu/mL；N5為預(yù)凍前活菌數(shù)，cfu/mL。

1.7 真空冷凍干燥

開啟真空冷凍干燥機(jī)待溫度降到-56℃后進(jìn)行1 h預(yù)熱。將經(jīng)過1.6.4中確定的預(yù)凍溫度和預(yù)凍時間處理過的完全凍結(jié)的菌懸液，進(jìn)行真空冷凍干燥[13]。

1.8 凍干菌懸液制備條件的單因素試驗

1.8.1 保護(hù)劑的pH值的確定

調(diào)節(jié)凍干保護(hù)劑（10%脫脂乳）的pH值為6.0、6.5、7.0、7.5。在室溫下將菌泥與等量的凍干保護(hù)劑混合均勻后，平衡30min，進(jìn)行真空冷凍干燥。

1.8.2 保護(hù)劑和菌泥的平衡時間的確定

在室溫下將菌泥與等量的凍干保護(hù)劑混合均勻后，在凍干保護(hù)劑pH值6.5條件下分別平衡20、30、40、50min，進(jìn)行真空冷凍干燥。

1.8.3 保護(hù)劑與和菌泥混合比例的確定

在室溫下將凍干保護(hù)劑與菌泥按1∶1、2∶1、3∶1、4∶1（mL/g）比例混合均勻后，在凍干保護(hù)劑pH值6.5條件下平衡30min，進(jìn)行真空冷凍干燥。

1.9 菌落計數(shù)

將真空冷凍干燥后得到的菌粉在無菌條件下，用無菌生理鹽水將其在室溫下進(jìn)行復(fù)水操作。平板計數(shù)法檢測真空冷凍干燥前后兩種菌的活菌數(shù)，然后計算出兩種菌的凍干存活率。

1.10 響應(yīng)面設(shè)計

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，以保護(hù)劑的pH（A）、保護(hù)劑和菌泥的平衡時間（B）、保護(hù)劑和菌泥的混合比例（C）3個因素作為自變量，以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的存活率（Y1、Y2）作為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計試驗。根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理[14]，通過Design-Expert8.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定凍干菌懸液的最佳制備工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 離心條件對混合發(fā)酵液中菌落存活率的影響

離心轉(zhuǎn)速和時間對St、Lb存活率的影響見表1。

表1 離心轉(zhuǎn)速和時間對St、Lb存活率的影響Table1 Effectof centrifugalspeed and timeon survival rateof St&Lb

由表1可知，經(jīng)過離心后Lb存活率在75%以上的有4、5、6、7，St存活率在75%以上的有3、4、5，為了同時保證兩種菌的高存活率試驗方案4、5較理想，其菌泥獲得率分別為1.23%、1.36%。從節(jié)約能源、提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本方面考慮，選擇3 000 r/min、10min作為該試驗的最佳離心條件。

2.2 預(yù)凍溫度和預(yù)凍時間對混合發(fā)酵液中菌落存活率的影響

預(yù)凍溫度和時間對St、Lb存活率的影響見圖1。

圖1 預(yù)凍溫度和時間對St、Lb存活率的影響Fig.1 Effectsof p refreezing temperatureand freezing tim eon the survival rateof St&Lb

由圖1可知，-20℃下預(yù)凍5 h和-80℃預(yù)凍1h條件下兩種菌的存活率都達(dá)到75%以上；這可能是因為-80℃條件下，冷凍可以快速通過最大冰晶生成區(qū)，可以形成大量小的穩(wěn)定冰晶體[15]。所以選擇預(yù)凍溫度-80℃、預(yù)凍時間1 h作為兩種菌的最佳試驗條件。

2.3 凍干菌懸液制備條件對St、Lb存活率的影響

2.3.1 St、Lb混合比例對其存活率的影響

St和Lb混合比例對其存活率的影響見表2。

表2 St和Lb混合比例對其存活率的影響Table2 Effectsof St&Lbm ixture ratio on their survival rate

根據(jù)表2數(shù)據(jù)可以看出St與Lb按活菌數(shù)為1∶1（體積比）混合時，兩種菌的存活率最高。所以將St：Lb=1∶1（體積比），作為本試驗兩種菌的混合比例。

2.3.2 保護(hù)劑pH對St、Lb存活率的影響

保護(hù)劑pH對St、Lb存活率的影響見圖2。

圖2 保護(hù)劑pH對St、Lb存活率的影響Fig.2 Effectof protectiveagent pH on the survival rateof St&Lb

由圖2可知，兩種菌的存活率隨著保護(hù)劑pH的增大先上升后下降，且在pH值為6.5時，兩種菌的存活率達(dá)到最高值。這也說明保護(hù)劑的pH只是在某個特定范圍值內(nèi)，才會在真空冷凍干燥過程中對保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌的存活起到保護(hù)作用，pH過高或者過低都會使兩種菌的存活率降低。pH值為6.5時為最優(yōu)條件。

2.3.3 保護(hù)劑和菌泥的平衡時間對St、Lb存活率的影響

圖3保護(hù)劑和菌泥的平衡時間對St、Lb存活率的影響見圖3。

圖3 保護(hù)劑和菌泥的平衡時間對St、Lb存活率的影響Fig.3 Effectsof thebalance timeof the protectiveagentand the bacterialsludgeon the survival rateof St&Lb

根據(jù)圖3可以看出，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的存活率都隨著平衡時間的延長先上升后下降，并且在平衡時間為30min時，存活率達(dá)到最大值。這可能是因為平衡時間太短，會使保護(hù)劑無法充分?jǐn)U散至兩種菌中，從而導(dǎo)致保護(hù)劑無法對兩者菌達(dá)到最佳的保護(hù)效果；平衡時間過長，護(hù)劑不但不會起到保護(hù)作用，可能還會對兩種菌的存活起到抑制作用[16]。

2.3.4 保護(hù)劑和菌泥混合比例對St、Lb存活率的影響

保護(hù)劑和菌泥混合比例對St、Lb存活率的影響見圖4。

圖4 保護(hù)劑和菌泥混合比例對St、Lb存活率的影響Fig.4 Effectsofm ixed proportion of protectiveagentsand bacterialsludgeon the survival rateof St&Lb

根據(jù)圖4可以看出，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌都是隨著保護(hù)劑與菌泥混合比例的增加，先上升后下降，在保護(hù)劑：菌泥的混合比例為2∶1（mL/g）時，兩種菌的存活率達(dá)到最大值。這可能是由于混合比例的增大，使得有足夠的保護(hù)劑能夠充分?jǐn)U散到兩種菌中，確保細(xì)胞被充分的保護(hù)，達(dá)到良好的保護(hù)效果。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計和結(jié)果分析

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計和結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果見表3、表4。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素水平表Table3 Factorsand levelsused in response surfacedesign

表4 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table4 Box-Behnken design With experimental results for sterilization efficiency

2.4.2 各因素對St存活率的響應(yīng)面優(yōu)化試驗和分析

本試驗對保護(hù)劑pH值、保護(hù)劑和菌泥平衡時間、保護(hù)劑和菌泥混合比例3個因素，及3個因素的交叉作用對St存活率的影響進(jìn)行研究，結(jié)果如表5所示。

表5 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table5 Analysisof variance for the fittedmathematicalmodel

續(xù)表5 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Continue table5 Analysisof variance for the fittedm athematical model

根據(jù)表5可以看出，模型的P值＜0.000 1，這說明該模型極顯著，即該試驗方案具有可靠性。失擬項P= 0.187 2＞0.05，說明沒有失擬因素存在，回歸方程具有較好的擬合性，該模型能模擬A、B、C 3個因素對St菌種存活率的影響。B、C的P值均＜0.000 1，A的P= 0.003 8＜0.005，所以B、C對St存活率的影響是極顯著的，A對St存活率是顯著的；AB（P=0.0448）、AC（P= 0.005 1）、BC（P=0.000 5）的P值均＜0.005，所以3組交叉項對St存活率影響顯著；從F值可以看出，3個因素對St存活率的影響為A（保護(hù)劑pH）＞C（混合比例）＞B（均衡時間）。模型的R2Adj=0.996 4，說明該模型能很好的描述99.64%的響應(yīng)值結(jié)果，能夠有效地反映各因素對響應(yīng)值的影響。3個因素的交叉作用對響應(yīng)值的影響如圖5所示。根據(jù)軟件的數(shù)據(jù)分析可得：保護(hù)劑pH值為6.57，平衡時間為29.71min，混合比例為2.05時，對St存活率來說是最佳試驗條件。

2.4.3 各因素對Lb存活率的響應(yīng)面優(yōu)化試驗和分析

Lb存活率不但取決于眾多單因素的影響，也會受這些因素的交叉作用的影響。本試驗對保護(hù)劑pH值、保護(hù)劑和菌泥平衡時間、保護(hù)劑和菌泥混合比例3個因素，及3個因素的交叉作用對Lb存貨率的影響進(jìn)行研究，結(jié)果如表6所示。

表6 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table6 Analysisof variance for the fittedmathem aticalmodel

續(xù)表6 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Continue table6 Analysisof variance for the fittedmathem atical m odel

根據(jù)表6可以看出，模型的P值＜0.000 1，這說明該模型極顯著，即該試驗方案具有可靠性。失擬項P= 0.839 6＞0.05，說明沒有失擬因素存在，回歸方程具有較好的擬合性，該模型能模擬A、B、C 3個因素對Lb菌種存活率的影響。A、B、C的P值均＜0.000 1，所以A、B、C對存活率的影響是極顯著的；AB（P=0.033 3）、AC（P=0.001 4）、BC（P=0.024 6）的P值均＜0.005，所以3組交叉項對Lb存活率影響顯著；從F值可以看出，3個因素對Lb存活率的影響為C（混合比例）＞A（保護(hù)劑pH）＞B（均衡時間）；模型的R2Adj=0.997 1，說明該模型能很好的描述99.71%的響應(yīng)值結(jié)果，能夠有效地反映各因素對響應(yīng)值的影響。3個因素的交叉作用對響應(yīng)值的影響如圖6所示。根據(jù)軟件的數(shù)據(jù)分析可得：保護(hù)劑pH為6.57，平衡時間為29.97min，混合比例為2.01∶1（mL/g）時，對Lb存活率來說是最佳試驗條件。

綜合考慮，兩種菌的存活率和實際操作等因素，將凍干菌懸液的制備條件修正為：保護(hù)劑的pH為6.57，平衡時間為30min，混合比例為2∶1（mL/g）。在此條件下，St和Lb的存活率分別為63.98%、66.21%，兩種菌的存活率均達(dá)到最大值。綜上所述，凍干菌懸液的最佳制備條件確定為：保護(hù)劑的pH為6.57，平衡時間為30min，混合比例為2∶1（mL/g）。

3 結(jié)論

本試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化法試驗得出最佳工藝條件為：St與Lb按活菌數(shù)1∶1混合（體積比），離心速度3 000 r/min，離心時間10min，預(yù)凍溫度-80℃，預(yù)凍時間1 h，保護(hù)劑pH6.6，平衡時間30min，保護(hù)劑和菌泥混合比例為2∶1（mL/g）。在此條件下，可以同時確保St、Lb的高存活率，從而確保最終得到的凍干菌粉具有良好的發(fā)酵性能。本試驗僅對凍干菌懸液的制備條件進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化，對混合發(fā)酵液的制備條件只進(jìn)行了單因素試驗?；旌习l(fā)酵液制備過程中各因素間的交叉影響也會對St、Lb的存活率產(chǎn)生一定影響，所以在進(jìn)一步的研究中應(yīng)對混合發(fā)酵液的制備條件也進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，以降低各因素交叉作用對試驗結(jié)果的影響。

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Optim ization on Direct Vat SetWith Response Surface M ethod

HANRong-wei1，YU Zhong-na2，LIU Lu1，WANG Jun1，*
（1.Collegeof Food Scienceand Engineering，Qingdao AgriculturalUniversity，Qingdao266109，Shandong，China；2.CollegeofHaidu，Qingdao AgriculturalUniversity，Laiyang265200，Shandong，China）

Directvatset（DVS）hasbecome themain developmentdirection ofyogurt fermentation agentdue to itshigh activity，good stability and easy to use.With the survival rate as the index，the single factor testofmixing ratio，centrifugalcondition and pre-freezing conditionwere conducted after the activation and purification of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus.The results showed that the optimizing fermentation conditionswere：St∶Lb=1∶1（volume ratio），the centrifugal speed of 3 000 r/min，centrifugation time of 10min，pre-freezing temperature of-80℃，pre-freezing time of1h；The pH of protective agent，the protective agent，the bacterialmud balance time，the protective agentand themixed proportion of the bacterialmire were optimized by response surfacemethod and the resultsshowed that the optimizing conditionsof freeze dried suspension were：protective agent pH of 6.6，equilibration time of 30min，themixing ratio of protective agent and bacterialmireof2∶1（mL/g）.Under theoptimized conditions，survival ratesof St&Lbwere63.77%and 66.03%，respectively，which indicated agoodmarket foreground and application value.

Streptococcus thermophilus；Lactobacillusbulgaricus；directvatset；responsesurfacemethod

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.016

2016-12-05

農(nóng)業(yè)部公益性農(nóng)業(yè)行業(yè)科研專項（201403071-5）；山東省自然基金青年基金（2015ZRB01095）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計劃（2016GSF120010）；山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金（BS2014NY011）；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金（6631115043）

韓榮偉（1981—），男（漢），副教授，博士，主要從事乳品科學(xué)方面研究。

*通信作者：王軍（1980—），男，副教授，博士，主要從事食品質(zhì)量安全控制的研究。