吳秋霞，黃鈞，吳重德，周榮清，2，3＊

（1.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，成都 610065；2.皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610065；3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州 646000）

季節(jié)和制曲位置變化對(duì)大曲生產(chǎn)影響的研究

吳秋霞1，黃鈞1，吳重德1，周榮清1，2，3＊

（1.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，成都 610065；2.皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610065；3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州 646000）

描述了采用代謝產(chǎn)物分析及大曲微生物群落多樣性評(píng)估等多尺度的方法，研究不同季節(jié)和制曲位置對(duì)大曲生產(chǎn)影響的結(jié)果。夏、秋季節(jié)和曲房不同位置的大曲微生物群落多樣性差異顯著，秋曲底物的水解活性及發(fā)酵力高于夏曲是真菌生物量增高所致。分離株及共培強(qiáng)化的秋曲中酯類和芳香族類組分的含量高于夏曲的，目標(biāo)產(chǎn)物四甲基吡嗪（TTMP）的含量也是秋曲高于夏曲，且中央?yún)^(qū)域大曲高于曲房周邊曲的，但4－乙基愈創(chuàng)木酚（4－EG）含量則是夏曲的較高，且曲房周邊的曲較高。共培養(yǎng)強(qiáng)化秋曲的TTMP含量較對(duì)照曲高12倍，而夏曲的4－EG含量也提高了9.6倍。

強(qiáng)化大曲；季節(jié)；制曲位置；理化性質(zhì)；揮發(fā)性組分；微生物群落

1 概述

中國傳統(tǒng)白酒的生產(chǎn)過程中，大曲參與了底物水解、初級(jí)與次級(jí)代謝產(chǎn)物的代謝，并因大曲質(zhì)量和風(fēng)味與基酒的質(zhì)量和特色密切相關(guān)而被譽(yù)為“酒之骨”［1，2］。大曲的生產(chǎn)特點(diǎn)是自然接種，生料制曲，其小生境的溫度、濕度、棲息微生物群落多樣性以及品溫、濕度的控制對(duì)其質(zhì)量的影響顯著［3－5］。大曲微生物群落構(gòu)成復(fù)雜，可培養(yǎng)方法難以揭示群落多樣性以及微生物與大曲活力之間的相關(guān)性，生產(chǎn)工藝也滯留在師傳身授的傳統(tǒng)模式。二十多年來，分子生物學(xué)理論與技術(shù)的迅速發(fā)展促進(jìn)了對(duì)釀酒大曲微生物群落的構(gòu)成特征和多樣性的深入研究［6－8］。Zhang等應(yīng)用巢式PCR技術(shù)比較了3種大曲間主要群落的異同，為開發(fā)特定功能強(qiáng)化大曲的生產(chǎn)技術(shù)奠定了重要基礎(chǔ)［9］。Han等應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)春、夏季大曲的群落多樣性、水解活性及揮發(fā)性組分異同的研究結(jié)果表明：原核生物的分類操作單元（OUT）較真核生物的多，桃花曲（春曲）真菌群落構(gòu)成較伏曲（夏曲）的復(fù)雜，致使其液化力和糖化力更強(qiáng)，且揮發(fā)性組分更豐富［10］。從釀酒中間產(chǎn)品中篩選功能菌及開發(fā)強(qiáng)化大曲的生產(chǎn)新技術(shù)逐漸被視為改善釀酒大曲和控制大曲代謝產(chǎn)物的重要途徑。Wu等以源于糟醅的分離菌株構(gòu)建工程菌，開發(fā)了改善其淀粉水解活力和發(fā)酵力的強(qiáng)化大曲，有效提高了產(chǎn)酒率［11］。陳雪玲等也進(jìn)行了類似的研究，根據(jù)生產(chǎn)復(fù)合大曲的主要理化性質(zhì)（糖化力、液化力、發(fā)酵力、酯化力等）獲得了多菌株共培強(qiáng)化的優(yōu)化條件［12］。從理化指標(biāo)、感官性質(zhì)、群落多樣性及揮發(fā)性組分等多尺度評(píng)估大曲質(zhì)量的優(yōu)劣，將有助于揭示大曲在白酒釀造過程中的關(guān)鍵貢獻(xiàn)，同時(shí)科學(xué)地指導(dǎo)大曲生產(chǎn)工藝的優(yōu)化。

本文描述了基于理化性質(zhì)、微生物群落、揮發(fā)性組分及指紋圖譜等不同尺度評(píng)估季節(jié)、制曲位置對(duì)大曲質(zhì)量的影響。針對(duì)基于TTMP高產(chǎn)分離株Bacillus velezensis M－14和4－EG高產(chǎn)分離株B.subtilis D－31及共培條件生產(chǎn)強(qiáng)化大曲，同時(shí)研究了對(duì)四甲基吡嗪（TTMP）和4－乙基愈創(chuàng)木酚（4－EG）目標(biāo)產(chǎn)物含量的影響。研究結(jié)果有益于認(rèn)識(shí)季節(jié)、小生境條件對(duì)分離株及共培強(qiáng)化大曲特性的影響，為強(qiáng)化大曲工藝條件的優(yōu)化有借鑒作用。

2 材料與方法

2.1 微生物及培養(yǎng)基

Bacillus subtilis D－31，Bacillus velezensis M－14：分別分離自醬香型和濃香型大曲，經(jīng)形態(tài)、生理生化及16SrDNA測(cè)序結(jié)果鑒定，保藏于本實(shí)驗(yàn)室。

菌種保藏及活化培養(yǎng)基：固體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：Bacillus velezensis M－14：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；Bacillus subtilis D－31：可溶性淀粉27.70g／L，KCl 6.66g／L，酵母膏50g／L，起始pH調(diào)至8.0。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：大曲坯料。

2.2 主要試劑

四甲基吡嗪 阿拉丁公司；4－乙基愈創(chuàng)木酚標(biāo)品英國Alfa Aesar公司；2－辛醇、辛酸及其甲酯 Sigma公司；其他化學(xué)試劑購于本地化學(xué)商品試劑供應(yīng)商，均為分析純。

2.3 主要儀器與設(shè)備

氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀，TR－5MS毛細(xì)管色譜柱Thermo Fisher公司（美國）；QYC－2112恒溫振動(dòng)培養(yǎng)器 ?，斢邢薰荆ㄉ虾＃?。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

強(qiáng)化種子液的制備：從B.subtilis D－31和B.velezensis M－14斜面上分別挑取2～3環(huán)接種到裝有50mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，搖瓶培養(yǎng)12h（37℃，120r／min）至對(duì)數(shù)前期，然后分別以3%（V／V）和6%（V／V）的量接種到裝有250mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，搖瓶培養(yǎng)24h（37℃，120r／min）。

混合菌液的制備：將D－31和M－14兩菌株的種子液調(diào)整到大致相同的濃度（107cfu／mL），然后以M－14∶D－31為3∶7的比例混合制得菌懸液。

分離株和混合菌懸液均以0.2%（V／m）的量接種到大曲坯料中，在宜賓敘府酒業(yè)制曲車間生產(chǎn)強(qiáng)化大曲。

2.5 分析檢測(cè)方法

2.5.1 理化指標(biāo)的檢測(cè)

參照文獻(xiàn)［13，14］中所述方法檢測(cè)大曲的水分、酸度、發(fā)酵力、酯化力、糖化力以及液化力。

2.5.2 基于PLFA指紋圖譜技術(shù)對(duì)微生物群落多樣性的評(píng)估

［15，16］所述的方法，應(yīng)用基于PLFA生物標(biāo)記指紋圖譜方法評(píng)估大曲樣品的微生物群落多樣性特征。

2.5.3 基于HS－SPME／GC－MS技術(shù)檢測(cè)大曲揮發(fā)性組分

稱取1g大曲樣品，加入10μL內(nèi)標(biāo)溶液，置于20mL頂空瓶中，在60℃恒溫水浴鍋中預(yù)平衡15min后，插入固相微萃取針頭萃取45min，再將萃取頭插入GC－MS進(jìn)樣口解吸3min，進(jìn)行GC－MS分析［17］。

3 結(jié)果與討論

3.1 季節(jié)對(duì)大曲理化性質(zhì)的影響

季節(jié)對(duì)大曲理化指標(biāo)的影響見表1。

表1 季節(jié)對(duì)大曲理化指標(biāo)的影響Table 1 Effects of different seasons on physicochemical properties of Daqu

由表1可知，各季節(jié)強(qiáng)化大曲的理化性質(zhì)都優(yōu)于對(duì)應(yīng)的空白曲。分離株及共培強(qiáng)化大曲的酸度因菌相間的競(jìng)爭(zhēng)抑制了環(huán)境和原料攜帶的產(chǎn)酸菌的生長(zhǎng)繁殖而降低，而糖化、液化力提高顯著。酯化力和發(fā)酵力則略有差異。B.subtilis D－31分離株強(qiáng)化的秋曲的酯化力和發(fā)酵力低于對(duì)照樣的。夏季晝夜間氣溫、濕度差小，對(duì)照樣和強(qiáng)化曲樣的各種活性指標(biāo)低于秋曲的。而秋季氣溫相對(duì)較低，晝夜間溫濕度差較大，前期升溫緩慢，生產(chǎn)過程的溫濕度容易控制，有益真菌生長(zhǎng)繁殖，所以相應(yīng)活性參數(shù)高于夏曲的。

3.2 季節(jié)對(duì)目標(biāo)組分及揮發(fā)組分的影響

對(duì)強(qiáng)化大曲的目標(biāo)組分TTMP和4－EG的含量檢測(cè)結(jié)果（見圖1）表明；強(qiáng)化大曲的TTMP，4－EG含量較對(duì)照樣品高。季節(jié)變化對(duì)TTMP含量的影響類似理化性質(zhì)的結(jié)果，秋曲中的含量高于夏曲的，秋季共培強(qiáng)化曲（Q2）中TTMP的含量較對(duì)照曲（Q0）的增加了10.93倍，且是夏曲（X2）的10.27倍。而4－EG的含量則是夏曲的較高，夏季共培強(qiáng)化曲（X2）較對(duì)照曲（X0）增加了8.56倍，是秋曲（Q2）的4.91倍。

圖1 季節(jié)對(duì)大曲特征組分的影響Fig.1 Effects of different seasons on characteristic components of Daqu

由檢測(cè)不同季節(jié)大曲揮發(fā)性組分的結(jié)果（見表2）可知，在5類組分中，優(yōu)勢(shì)組分是芳香族類和酯類。B.subtilis D－31能有效地將阿魏酸（FA）轉(zhuǎn)化為4－EG等酚類，而B.velezensis M－14能高效地合成吡嗪類［18］，且分離株具有較強(qiáng)的分泌水解酶（淀粉酶、酯化酶）的能力，培養(yǎng)過程中酯類合成能力較強(qiáng)，因此強(qiáng)化曲酯類組分含量較對(duì)照曲高，夏秋兩季共培強(qiáng)化曲分別是對(duì)照曲的2.94倍和2.73倍。鑒于上述小生境變遷的原因，強(qiáng)化秋曲的芳香族、酯類及吡嗪類組分含量均高于對(duì)應(yīng)的夏曲。季節(jié)間對(duì)照樣揮發(fā)性酸類組分與其他類組分含量變化不顯著，但強(qiáng)化方式因季節(jié)不同差異顯著。共培強(qiáng)化與分離株夏曲的酸類組分顯著低于對(duì)照，但其他類組分則更高。然而，僅共培強(qiáng)化秋曲的酸類組分含量顯著低于對(duì)照組，分離株強(qiáng)化曲與相應(yīng)的對(duì)照曲差異不顯著，共培及B.velezensis M－14分離株強(qiáng)化曲的其他類組分含量高于對(duì)照組，但B.subtilis D－31分離株強(qiáng)化曲則低于對(duì)照組?？赡苁菑?qiáng)化菌株的參與對(duì)原群落產(chǎn)生干擾，改變了代謝及產(chǎn)物積累途徑所致，其機(jī)理有待進(jìn)一步探討。

表2 季節(jié)對(duì)大曲揮發(fā)性組分的影響Table 2 Effects of different seasons on volatile components of Daqu ng／g

3.3 季節(jié)對(duì)大曲微生物群落多樣性的影響

夏曲和秋曲分別檢出了11種和12種PLFAs（見圖2），其含量在各強(qiáng)化曲中差異不顯著。進(jìn)一步評(píng)估強(qiáng)化方式、季節(jié)對(duì)微生物群落多樣性影響的結(jié)果（見表3）表明：強(qiáng)化曲G＋／G－和細(xì)菌／真菌的值較對(duì)照曲都有不同程度的增高，這是因?yàn)橛糜趶?qiáng)化的分離菌株D－31和M－14皆屬G＋菌，且耐高溫，在生產(chǎn)過程中有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。微生物群落多樣性特征評(píng)估的結(jié)果佐證了夏曲細(xì)菌／真菌的值高，夏季氣溫較高，適合產(chǎn)酸細(xì)菌的繁殖，從而導(dǎo)致大曲酸度較高，秋曲真菌生長(zhǎng)繁殖較旺盛，發(fā)酵力增高的推測(cè)（見表1）。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果也揭示酯類、芳香族類組分的含量與真菌含量密切相關(guān)。

圖2 不同季節(jié)大曲中PLFA的種類與含量Fig.2 PLFA types and content of Daqu in different seasons

表3 不同季節(jié)大曲中微生物群落多樣性特征Table 3 Characteristics of microbial community diversity of Daqu in different seasons

3.4 空間位置對(duì)大曲各參數(shù)的影響

將同期制作的強(qiáng)化大曲分別放置于同一間曲房的四周和中央?yún)^(qū)域進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)大曲的理化指標(biāo)，結(jié)果見表4。

表4 空間位置對(duì)大曲理化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of locations on physicochemical properties of Daqu

由表4可知：曲塊放置對(duì)其有較大的影響。曲房中央大曲的水分和酸度高于曲房四周的大曲，這是由于中央?yún)^(qū)域通風(fēng)、排潮不暢，溫、濕度控制滯后于曲房周邊環(huán)境，但中央大曲的發(fā)酵力和酯化力較低。結(jié)果揭示了溫度和濕度控制對(duì)強(qiáng)化大曲的質(zhì)量也有顯著的影響。

考察位置對(duì)目標(biāo)組分含量影響的結(jié)果（見圖3）表明：同一曲房不同區(qū)域的微環(huán)境存在較大差異，致使大曲TTMP和4－EG的含量增幅各異，曲房周邊大曲的4－EG含量高于中央?yún)^(qū)域的，對(duì)TTMP含量也類似。微環(huán)境的差異對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物含量因分離株和強(qiáng)化方式而異。B.subtilis D－31強(qiáng)化，則在中央?yún)^(qū)域大曲的4－EG含量增幅最大，為對(duì)照曲的11倍，而四周的共培強(qiáng)化曲TTMP的含量是對(duì)照樣的2.8倍。由此可見，共培強(qiáng)化、降溫迅速、排潮快均有益于TTMP含量的提高，反之B.subtilis D－31強(qiáng)化，有利于4－EG含量的提高，這些目標(biāo)產(chǎn)物的含量可能與溫、濕度、供氧速率有關(guān)［19］。

圖3 位置對(duì)大曲揮發(fā)性組分的影響Fig.3 Effects of locations on volatile components of Daqu

不同空間位置的大曲檢出的12種PLFA組分及含量見圖4。

圖4 不同位置大曲中PLFA的種類與含量Fig.4 PLFA types and content of Daqu in different locations

相應(yīng)的G＋菌、G－菌、細(xì)菌和真菌組成特點(diǎn)見表5。

表5 不同位置大曲的微生物群落多樣性特征Table 5 Characteristics of microbial community diversity of Daqu in different locations

對(duì)于自然制曲，中央?yún)^(qū)域大曲的G－菌和真菌生物量低于對(duì)應(yīng)周邊大曲的，細(xì)菌及G＋菌略占優(yōu)勢(shì)。在兩個(gè)區(qū)域的分離株強(qiáng)化曲的G＋菌的生物量增加，但僅有中央?yún)^(qū)域曲的G＋／G－的值顯著增高，曲房四周區(qū)域的則幾乎相同，細(xì)菌總的生物量也有類似的變化。兩個(gè)區(qū)域的B.velezensis M－14分離株與共培強(qiáng)化曲的真菌生物量增高，但B.subtilis D－31強(qiáng)化曲中真菌生物量略有減少，其原因有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

以理化性質(zhì)、基于PLFA的大曲微生物群落多樣性評(píng)估及揮發(fā)性物質(zhì)組成等參數(shù)對(duì)夏、秋強(qiáng)化大曲的研究結(jié)果表明：季節(jié)和制曲小生境對(duì)大曲群落多樣性影響較大，秋曲的底物的水解活性及發(fā)酵力高于夏曲，其主要貢獻(xiàn)是真菌生物量增高所致。分離株及共培強(qiáng)化秋曲的酯類、芳香族類組分的含量高于夏曲的，目標(biāo)產(chǎn)物的TTMP含量也高于夏曲，且曲房中央?yún)^(qū)域的曲高于周邊的曲，但4－EG的含量則夏曲較高，曲房周邊的曲較高。

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Study on the Effect of Season and Koji－making Location on Daqu Production

WU Qiu－xia1，HUANG Jun1，WU Chong－de1，ZHOU Rong－qing1，2，3＊
（1.College of Light Industry，Textile ＆Food Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China；2.Key Laboratory of Leather Chemistry and Engineering，Ministry of Education，Chengdu 610065，China；3.National Solid Fermentation Engineering Research Center，Luzhou 646000，China）

Use analysis of metabolites，PLFA method and other ways to explore the effect of season and kojimaking location on Daqu production.The results show that different seasons and koji－making locations cause obvious differences of microbial community diversity，and it indicates that the increasing fungal biomass makes hydrolytic activity and fermentation power of Daqu made in autumn higher than that of Daqu made in summer.The content of esters and aromatics in fortified Daqu made in autumn is higher than that of Daqu made in summer，so does TTMP，and compared with Daqu around koji－making plant，the content of TTMP in central area is higher.However，Daqu made in summer and located around koji－making plant has more 4－EG.The content of TTMP in fortified Daqu by co－culturing made in autumn increases 12times compared to the control sample，and the content of 4－EG in fortified Daqu by co－culturing made in summer increases 9.6times.

fortified Daqu；season；location；physicochemical property；volatile components；microbial community

TS261.11

A

10.3969／j.issn.1000－9973.2017.04.010

1000－9973（2017）04－0042－05

2016－10－15 ＊通訊作者

吳秋霞（1991－），女，碩士，研究方向：現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)；周榮清（1960－），男，教授，博士生導(dǎo)師，博士，研究方向：發(fā)酵工程與生物化工。