張黃琴+朱振華+錢大瑋+翁澤斌+郭盛+段金廒+雷振宏+李安平

[摘要] 該研究以苦參花資源化利用為目的，分析苦參花不同物候期中生物堿類、黃酮類資源性化學(xué)成分的含量，以期發(fā)現(xiàn)苦參花資源的潛在利用價值。采用UPLC-TQ-MS聯(lián)用技術(shù)，對山西長治產(chǎn)苦參花中7個生物堿類及7個黃酮類成分進行分析測定。結(jié)果顯示不同花期中都含有金雀花堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、N-甲基金雀花堿、苦參堿、槐果堿7種生物堿，各堿總和為花蕾1.47%、半開花1.34%、盛開花1.17%、敗花1.01%，其中主要生物堿為N-甲基金雀花堿、氧化槐果堿、氧化苦參堿，約占總生物堿量的83%；所測定的蘆丁、木犀草素、槲皮素、異槲皮苷、三葉豆紫檀苷、苦參酮、苦參醇7種黃酮類成分，各黃酮總和花蕾495.2 μg·g^-1、半開花313.7 μg·g^-1、敗花224.2 μg·g^-1、盛開花193.0 μg·g^-1，其中木犀草素的含量相對較高，約占所測總黃酮量的89%～94%。結(jié)果提示苦參花所含的喹諾里西啶類生物堿是其主要的資源性化學(xué)成分，可加以開發(fā)利用。

[關(guān)鍵詞] 苦參花；花期；生物堿；黃酮；資源化利用

[Abstract] This study intends to explore the potential resource-orientedutilization value of the flower of Sophora flavescents by analyzing alkaloids and flavonoids in the flower of S. flavescens from Shanxi province. This study established a rapid UPLC-TQ-MS/MS method that is used for determination of seven alkaloids and seven flavonoids in the flower of S.flavescens. The different florescences all have the seven detected alkaloids such as cytisine，oxy-matrine，oxy-sophocarpine，sophoridine，N-methylcytisine，matrine，sophocarpine.The total contents of detected alkaloids are as follows： flower buds 1.47%，primal flowers 1.34%，full bloomed flowers 1.17%，faded flowers 1.01%. The top three contents of alkaloids are N-methylcytisine ，oxy-sophocarpine and oxymatrine，accounting for about 83% of the total amount of detected alkaloids. All the samples in different florescences have the seven detected flavonoids such as rutin，luteolin，quercetin，isoquercitrin，trifolirhizin，kurarinone，and kushenol I. The total contents of detected alkaloids are as follows： flower buds 495.2 μg·g^-1 ，primal flowers 313.7 μg·g^-1 ，faded flowers 224.2 μg·g^-1，full bloomed flowers 193.0 μg·g^-1. The content of luteolinis relatively higher than other detected flavonoids，accounting for about 89%-94% of the total amount of detected flavonoids. The results indicated that the flower of S.flavescens could be an important material resource to obtain the resourceful alkaloids. This result can provide scientific basis for resource-oriented utilization and industrial development of the flower of S. flavescens.

[Key words] flower of Sophora flavescens；florescences；alkaloids；flavonoids；resources utilization

doi：10.4268/cjcmm20162422

豆科槐屬植物苦參Sophora flavescens Ait.的干燥根是一個常用大宗藥材，其始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》稱其為水槐，列為中品。其味苦，性寒，具有清熱燥濕，殺蟲利尿等功效[1]?，F(xiàn)代研究表明苦參藥材的功效可能主要與其所含的生物堿類和黃酮類成分有關(guān)[2-5]，在臨床治療疾病方面具有重要的應(yīng)用價值。目前我國苦參藥材除野生資源外，在我國山西、陜西和遼寧等地已建立苦參栽培基地并大面積種植栽培苦參[6]?？鄥槎嗄晟参铮厣喜糠置磕昵锛究菸?，來年春天重新發(fā)芽，于栽種第3年秋天采收藥材，栽種前兩年一般不開花結(jié)籽，但第3年6—8月份卻大量開花結(jié)籽。就全國而言每年有大量的花作為農(nóng)業(yè)廢棄物未被開發(fā)和利用而廢棄。因此從資源循環(huán)利用的角度出發(fā)，探討苦參植株非藥用部位花可利用的價值顯得尤為重要[7-8]。本文即選取采自山西長治苦參GAP種植基地的苦參花為研究對象，采用UPLC-TQ-MS技術(shù)對不同花期苦參花中生物堿類、黃酮類資源性成分進行分析，以探討苦參花的開發(fā)利用價值和資源化利用策略，為苦參非藥用部位的資源化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC系統(tǒng)（二元高壓泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器，Waters公司）；Xevo TQ/MS質(zhì)譜系統(tǒng)（Waters公司）；MassLynx^TM質(zhì)譜工作站（Waters公司）；ML204，MS105電子分析天平（梅特勒-托尼多儀器有限公司）；Millipore Q純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；KQ-250E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；Anke GL-16GⅡ型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試藥與試劑

金雀花堿（cytisine）、氧化苦參堿（oxy-matrine）、氧化槐果堿（oxy-sophocarpine）、槐定堿（sophoridine）、N-甲基金雀花堿（N-methylcytisine）、苦參堿（matrine）、槐果堿（sophocarpine）、蘆?。╮utin）、木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）、異槲皮苷（isoquercitrin）、三葉豆紫檀苷（trifolirhizin）、苦參酮（kurarinone）、苦參醇（kushenol I）均購自合肥博美生物科技有限公司（供含量測定用），經(jīng)HPLC檢測純度均大于98%。甲酸、乙腈（Merck），甲醇（Tedia），乙酸銨、氨水、乙醇（分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司）。

1.3 樣品

本研究選擇山西長治苦參GAP種植基地的苦參花為研究對象。根據(jù)花期分為花蕾、半開花、盛開花、敗花，經(jīng)晾曬干燥，其中S1～S3為花蕾，S4～S6為半開花，S7～S9為盛開花，S10～S12為敗花。憑證標(biāo)本存放于南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 生物堿類成分分析

2.1.1 對照品溶液的制備

分別取金雀花堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、N-甲基金雀花堿、苦參堿、槐果堿對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并定容配制成對照品儲備液；取適量各成分儲備液，加甲醇稀釋定容，配制成混合對照品溶液，其中各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為137.0，96.50，105.0，109.0，118.0，155.0，114.0 mg·L^-1。取上述混合對照品溶液用甲醇稀釋成不同濃度的混標(biāo)工作液。

2.1.2 供試品溶液的制備

取0.5 g樣品粉末（40目），精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇50 mL，稱重，靜置1 h，超聲1 h，冷卻至室溫，稱重，以75%乙醇補足失重，搖勻，13 000 r·min^-1離心10 min，取上清液，以0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.3 UPLC-TQ-MS分析條件

色譜分析條件Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）色譜柱；柱溫35 ℃。流動相10 mmol·L^-1乙酸銨溶液（氨水調(diào)pH為8）（A），乙腈（B），梯度洗脫（0～4 min，95%～90% A；4～5 min，90%～80% A；5～9 min，80%～80% A；9～10 min，80%～75% A；10～13 min，75%～40% A；13～14 min，40%～5% A）。流速0.4 mL·min^-1；進樣量 2 μL。

質(zhì)譜檢測條件ESI源；掃描方式ESI⁺模式；多反應(yīng)檢測（MRM）；毛細(xì)管電壓3.0 kV；錐孔電壓30 V；萃取電壓3.0 V；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；錐孔氣流量50 L·h^-1；脫溶劑氣流量1 000 L·h^-1，輔助氣流0.15 mL·min^-1。各生物堿類成分的質(zhì)譜參數(shù)見表1，色譜圖見圖1。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量限 精密量取2.1.1項下混標(biāo)工作液按2.1.3項下的分析條件進行測定。以被測化合物的峰面積（Y）對濃度（X）進行線性回歸，并按信噪比（S/N）為10和3分別計算被測組分的定量限（LOQ）和檢測限（LOD）。結(jié)果見表2，各成分線性良好，r均在0.982 7以上。

2.1.4.2 精密度試驗 取中等濃度混合對照品溶液，在上述色譜條件下分別于1日內(nèi)重復(fù)進樣6次和連續(xù)3 d內(nèi)重復(fù)進樣3次以測定所分析的化學(xué)成分的峰面積，以各指標(biāo)成分含量的（RSD）來評價日內(nèi)及日間精密度。結(jié)果見表3，各成分日內(nèi)精密度RSD≤2.1%，日間精密度RSD≤2.5%。

2.1.4.3 重復(fù)性試驗 取S1號樣品6份，按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，分別進樣分析，以樣品中各指標(biāo)成分含量的RSD值評價其重復(fù)性，結(jié)果見表3，重復(fù)性RSD≤2.7%。

2.1.4.4 穩(wěn)定性試驗 取S1號樣品6份，按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，置于4 ℃保存，分別于0，2，4，8，12，24 h進樣分析，以各指標(biāo)成分含量，計算RSD，考察方法的穩(wěn)定性，結(jié)果見表3，穩(wěn)定性RSD≤3.3%。

2.1.4.5 加樣回收率試驗 取0.25 g已知含量的樣品9份（S1），加入樣品中各成分80%，100%，120%的對照品，各平行3份，按照供試品溶液的制備方法處理并按上述條件測定，計算平均回收率和RSD，結(jié)果見表3，平均加樣回收率95.34%～104.4%，RSD≤4.1%均符合分析要求。

2.1.5 含量測定

各樣品按2.1.2項下的方法制得供試品溶液。取各供試品溶液，按2.1.3項下的條件進樣測定，測定結(jié)果見表4。

2.2 黃酮類成分分析

2.2.1 對照品溶液的制備

分別取蘆丁、木犀草素、槲皮素、異槲皮苷、三葉豆紫檀苷、苦參酮、苦參醇對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并定容配制成對照品儲備液；取適量各成分儲備液，加甲醇稀釋定容，配制成混合對照品溶液，其中各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為151.0，120.0，129.0，120.0，125.0，113.0，126.0 mg·L^-1。取上述混合對照品溶液用甲醇稀釋成不同濃度的混標(biāo)工作液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取1 g樣品粉末（40目），精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇20 mL，稱重，靜置1 h，超聲1 h，冷卻至室溫后稱重，加80%乙醇補足失重，搖勻，13 000 r·min^-1離心10 min，取上清液，以0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 UPLC-TQ-MS分析條件

色譜分析條件Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱；柱溫35 ℃。流動相0.1%甲酸水（A），乙腈（B），梯度洗脫（0～1.5 min，95%～80% A；1.5～6 min，80%～70% A；6～7 min，70%～5% A；7～8 min，5%～5% A；8～9 min，5%～95% A）。流速：0.4 mL·min^-1；進樣量 2 μL。

質(zhì)譜檢測條件ESI源；掃描方式ESI⁺，ESI^-模式；多反應(yīng)檢測（MRM）；毛細(xì)管電壓3.0 kV；錐孔電壓43 V；萃取電壓3.0 V；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度400 ℃；錐孔氣流量 50 L·h^-1；脫溶劑氣流量1 000 L·h^-1，輔助氣流：0.15 mL·min^-1。各黃酮類成分的質(zhì)譜參數(shù)見表5，色譜圖見圖2。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量限 精密量取2.2.1項下混標(biāo)工作液按2.2.3項下的分析條件進行測定。以被測化合物的峰面積（Y）對濃度（X）進行線性回歸，并按信噪比（S/N）為10和3分別計算被測組分的定量限（LOQ）和檢測限（LOD），結(jié)果見表6，各成分線性良好，r值均在0.996 2以上。

2.2.4.2 精密度試驗 取中等濃度混合對照品溶液，在上述色譜條件下分別于1日內(nèi)重復(fù)進樣6次和連續(xù)3 d內(nèi)重復(fù)進樣3次以測定所分析的化學(xué)成分的峰面積，以各指標(biāo)成分含量的（RSD）來評價日內(nèi)及日間精密度，結(jié)果見表7，各成分日內(nèi)精密度RSD≤2.7%，日間精密度RSD≤2.9%。

2.2.4.3 重復(fù)性試驗 取S1號樣品6份，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，分別進樣分析，以樣品中各指標(biāo)成分含量的 RSD評價其穩(wěn)定性，結(jié)果見表7，重復(fù)性RSD≤3.1%。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取S1號樣品6份，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，置于4 ℃保存，分別于0，2，4，8，12，24 h分別取樣，進行UPLC-TQ-MS分析，以各指標(biāo)成分含量，計算RSD，考察方法的穩(wěn)定性。

2.2.4.5 加樣回收率試驗 取0.5 g已知含量的樣品9份（S1），加入樣品中各成分80%，100%，120%的對照品，各平行3份，按照供試品溶液的制備方法處理并按上述條件測定，計算平均回收率和RSD，結(jié)果見表7，平均加樣回收率95.21%～106.0%，RSD≤4.0%均符合分析要求。

2.2.5 含量測定

各樣品按2.2.2項下的方法制得供試品溶液。取各供試品溶液，按2.2.3項下的條件進樣測定，測定結(jié)果見表8。

3 討論

3.1 苦參花的適宜采收期

不同花期的苦參花中生物堿、黃酮的種類大致相同，但含量有差異。各花期平均總生物堿為花蕾>半開花>盛開花>敗花，所測總黃酮含量花蕾>半開花>敗花>盛開花。經(jīng)ANOVA分析，花蕾中的各生物堿類、黃酮類成分含量與其他花期含量均有統(tǒng)計學(xué)差異。提示苦參花的最佳采收期為花蕾期。

3.2 苦參花的利用前景探討

藥典規(guī)定，苦參藥材所含生物堿以苦參堿和氧化苦參堿為主，總量不得少于1.0%[1]。與藥用部位的主要生物堿種類不同，苦參花中主要生物堿為N-甲基金雀花堿、氧化槐果堿、氧化苦參堿，總量達(dá)0.8%以上，其中花蕾中高達(dá)1.2%；所測生物堿中N-甲基金雀花堿含量最高達(dá)0.3%以上，尤其是花蕾中高達(dá)0.6%以上，提示苦參花可作為N-甲基金雀花堿的原料。

本研究表明苦參花中所測定的7種生物堿總量達(dá)1%以上，其中以花蕾中N-甲基金雀花堿含量最高，達(dá)0.6%以上。可將苦參花作為獲取生物堿類（尤其是N-甲基金雀花堿）資源性化學(xué)成分的補充資源，對其進行資源化利用與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，提升苦參資源的利用效率?？鄥⒌纳飰A類化學(xué)成分具有較好的殺蟲、抑菌活性[9-12]，近年來在獸藥領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，目前的研究著重于苦參堿及氧化苦參堿，但N-甲基金雀花堿的研究較少，其功效的開發(fā)還有待進一步研究以挖掘苦參花的潛在利用價值。

文獻(xiàn)報道苦參藥材中含有豐富的異戊烯基黃酮類成分[13]，但研究表明，苦參花中這些成分相對較少，但含有較多的木犀草素，其合成途徑有待進一步探討。文獻(xiàn)報道槐屬植物的花，如槐花中含有大量的蘆丁等黃酮[14]，但本研究結(jié)果表明苦參花中的蘆丁含量較少。結(jié)合黃酮類成分的分析，提示苦參花不是獲取黃酮的好原料。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]