李宵寧，殷金秋，柴蕓，李玉環(huán)，高榮梅，劉明亮

含有芳雜環(huán)片段的喹諾酮類化合物的設(shè)計、合成與體外抗病毒活性

李宵寧*，殷金秋*，柴蕓，李玉環(huán)，高榮梅，劉明亮

目的設(shè)計合成一系列含有芳雜環(huán)片段的喹諾酮類化合物，并評價其體外抗人類巨細(xì)胞病毒（HCMV）和抗單純皰疹病毒 1 型（HSV-1）活性。

喹諾酮類； 化學(xué)技術(shù)，合成； 抗病毒藥；皰疹病毒 1 型，人； 巨細(xì)胞病毒

人類巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是皰疹病毒家族中的重要成員，可引起人類巨細(xì)胞病毒感染[1]。單純皰疹病毒 1 型（herpes simplex virus 1，HSV-1）則是引起口腔和面部損傷的主要病原體，也是皰疹性腦炎的最常見病因[2]。目前常用的抗 HCMV/HSV-1 藥物均為病毒 DNA聚合酶抑制劑，因安全性問題和口服生物利用度低等使其臨床應(yīng)用受到很大限制[3]，而近年不斷出現(xiàn)的交叉耐藥毒株則使其治療方案復(fù)雜化[4]，故尋找和研發(fā)新型抗病毒藥物勢在必行[5]。

喹諾酮是目前臨床廣泛使用的一類廣譜、高效、低毒的一線抗感染化療藥物，主要用于治療由細(xì)菌感染引起的系統(tǒng)性疾病[6]。近 10 余年來，科學(xué)家對喹諾酮進(jìn)行了卓有成效的結(jié)構(gòu)改造，發(fā)現(xiàn)這類化合物除抗菌之外還具有多種“非經(jīng)典”生物活性，并篩選得到若干有苗頭的候選物[7]。其中，第 1 個喹諾酮抗腫瘤藥物沃薩羅辛（voreloxin，拓?fù)洚悩?gòu)酶 II 抑制劑）[8]和第 1 個喹諾酮抗AIDS 藥物埃替格韋（elvitegravir，HIV-1 整合酶抑制劑）[9]已分別于 2009 年和 2012 年被美國FDA 批準(zhǔn)上市。

多名學(xué)者對 6-氨基喹諾酮的抗病毒構(gòu)效關(guān)系（SAR）進(jìn)行了系統(tǒng)研究[10-12]。其中，代表物WC5[13-14]（14c）對人類皰疹病毒家族中的 HCMV具有高度的選擇性[15]，且與更昔洛韋（GCV）表現(xiàn)出協(xié)同作用[16]。本文以 WC5 為先導(dǎo)物，在對其 C7位改造的基礎(chǔ)上，對母核的 N1、C6 和 C8 位分別修飾，設(shè)計合成一系列含有芳雜環(huán)片段的喹諾酮類化合物，并初步評價其抗病毒活性，以期獲得對HCMV 和（或）HSV-1 具有抑制活性的化合物，為下一步設(shè)計合成活性喹諾酮類化合物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 梅特勒 MP-70 熔點儀為瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；Mass Express 2.1.243 和Micromass Autospec Ultima-TOF 型質(zhì)譜儀分別為美國 Advion 公司和 Waters 公司產(chǎn)品；Mercury-400 MHz 和 Inova-500 MHz 型核磁共振儀為美國 Varian 公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 陽性對照藥 GCV 和阿昔洛韋（ACV）分別購于美國 Sigma-Aldrich 公司和湖北科益制藥廠；色譜用薄層層析硅膠 H 為青島海洋化工廠產(chǎn)品；其他試劑和溶劑均為市售化學(xué)純或分析純，根據(jù)需要經(jīng)無水干燥處理后使用。

1.2 方法

1.2.1 化學(xué)合成 以 2-氯苯并噁唑（1a）和 2-溴苯并噻唑（1b）為原料，依次經(jīng)與 N-Boc-哌嗪親核取代和脫保護(hù)基可分別制得側(cè)鏈化合物 2-哌嗪基苯并噁唑（2a）和 2-哌嗪基苯并噻唑（2b）[17]（圖 1）。

按照合成喹諾酮的常規(guī)操作[18-19]，6 個母核羧酸酯（8～13）很容易由相應(yīng)的羧酸（3～7）依次經(jīng)酰氯化、與丙二酸二乙酯縮合、部分水解并脫羧、與原甲酸三乙酯縮合、親核取代及環(huán)合分別制得（圖 2）。

基于我們合成喹諾酮類化合物的成功經(jīng)驗[20-22]，羧酸酯 8 與上述合成的側(cè)鏈化合物 2a、2b 以及國內(nèi)有商品供應(yīng)的 1-(2-吡啶基)哌嗪（2c）、1-(3-吡啶基)哌嗪（2d）和 1-(4-吡啶基)哌嗪（2e）直接縮合，接著依次經(jīng)酯水解和硝基還原得目標(biāo)物 14；喹諾酮母核 9～11 則需先經(jīng)螯合活化，然后與側(cè)鏈化合物縮合，最后水解即得 15～17；萘啶酮母核 12 和 13 可直接與側(cè)鏈化合物縮合后水解即得 18 和 19（圖 3）。

1.2.2 CPE 法測定體外抗病毒活性 HCMV 和HSV-1 病毒株分別為 HCMV AD-169 株（ATCC VR538）和 HSV-1 F 株（ATCC VR733），病毒宿主分別為人胚胎成纖維細(xì)胞（MRC-5）和非洲綠猴腎（Vero）細(xì)胞，陽性對照藥分別為 GCV 和 ACV。目標(biāo)化合物用 DMSO 配成濃度為 20 mg/ml 的母液，檢測時用培養(yǎng)液稀釋濃度為 200 μg/ml，然后進(jìn)行 3 倍稀釋，共 8 個稀釋度。試驗時，MRC-5細(xì)胞和 Vero 細(xì)胞分別種 96 孔培養(yǎng)板，24 h 后分別感染 AD-169（100 TCID50）和 HSV-1（100 TCID50），吸附 2 h，棄病毒液，加入含有不同稀釋度樣品及陽性對照藥的維持液，同時設(shè)細(xì)胞對照孔和病毒對照孔，待病毒對照組病變程度（CPE）達(dá) 4+時觀察各組 CPE，用 Reed-Muench[23]法分別計算目標(biāo)化合物對 HCMV 和 HSV-1 的藥物半數(shù)有毒濃度（TC50）和藥物對病毒半數(shù)抑制濃度（IC50）。

圖1 側(cè)鏈化合物 2a、2b 的合成Figure 1 Synthesis of compounds 2a and 2b

圖2 喹諾酮母核羧酸酯 8～13 的合成Figure 2 Synthesis of compounds 8-13

圖3 目標(biāo)化合物 14～19 的合成Figure 3 Synthesis of target compounds 14-19

2 結(jié)果

2.1 目標(biāo)化合物的合成

共合成目標(biāo)化合物 22 個（包括 WC5），其結(jié)構(gòu)（圖 4）均經(jīng)1H-NMR、13C-NMR 和 MS 確證，部分化合物還經(jīng) HRMS 進(jìn)一步確證。

2.2 抗病毒活性

2.2.1 抗 HCMV 活性 由表 1 可見，目標(biāo)物 17和 18b 對 HCMV 有抑制作用[IC50分別為（17.26 ± 1.85）μg/ml 和（11.14 ± 1.69）μg/ml]，但明顯弱于先導(dǎo)物 WC5（14c）[IC50：（1.27 ± 0.44）μg/ml]和對照藥 GCV[IC50：（0.025 ± 0.005）μg/ml]，其余目標(biāo)物在無毒濃度下均未測出 IC50。

2.2.2 抗 HSV-1 活性 由表 1 可見，9 個目標(biāo)物（14d、15d、16c、16d、17、18b、18d、18e、19）在無毒濃度下對 HSV-1 顯示抑制作用，其中目標(biāo)物 19 的活性[IC50：（2.18 ± 0.30）μg/ml]僅略弱于先導(dǎo)物 WC5[IC50：（1.68 ± 0.25）μg/ml]，兩者均弱于對照藥 ACV[IC50：（0.63 ± 0.09）μg/ml]。

3 討論

作為抗 HCMV 候選物，6-氨基喹諾酮 WC5具有全新作用機(jī)制（直接阻滯病毒 IE2 蛋白轉(zhuǎn)錄活性[15]），被認(rèn)為在對付耐藥病毒感染方面可能具有重要意義[14]。作者借鑒喹諾酮的抗菌 SAR，以WC5 為先導(dǎo)物，對其母核的四個位置（N1、C6、C7、C8）進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，設(shè)計合成了一系列含有芳雜環(huán)片段的喹諾酮類化合物。由體外活性數(shù)據(jù)可見：①活性結(jié)果大多不如預(yù)期，僅部分化合物表現(xiàn)出體外抗病毒活性，故其 SAR 難以總結(jié)；②所有對 HCMV 有抑制作用的化合物（17、18b）也同樣顯示出抗 HSV-1 活性，但兩者之間并無直接相關(guān)性；③WC5 不僅對 HCMV 具有抑制作用，而且對 HSV-1 顯示相似的活性，但對 Vero 細(xì)胞毒性大（TC50：22.22 μg/ml）及選擇性差（SI：13.23）。

值得注意的是，N1 位為 (1S,2R)-2-氟環(huán)丙基（第四代喹諾酮西他沙星的 N1 位取代基）的喹諾酮 17 對 HCMV 和 HSV-1 均有抑制作用，且對兩種細(xì)胞的毒性均小于 WC5，而 N1 位為(1S,2R)-2-氟環(huán)丙基的萘啶酮 19 對 HSV-1 顯示良好活性（盡管其細(xì)胞毒性較大）。據(jù)此，我們認(rèn)為，很有必要對 1-[(1S,2R)-2-氟環(huán)丙基]喹諾酮/萘啶酮的 C6、C7 和 C8 位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，以期篩選出活性更強(qiáng)和毒性更小的化合物。事實上，本課題組已經(jīng)開始相關(guān)的化學(xué)合成工作，結(jié)果值得期待。

圖4 目標(biāo)化合物 14～19 的結(jié)構(gòu)Figure 4 Structures of target compounds 14-19

表1 目標(biāo)化合物 14～19 的抗病毒活性Table 1 Antiviral activity of target compounds 14-19

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Design,synthesis and in vitro antiviral activity of quinolones containing a heteroaromatic moiety

LI Xiao-ning,YIN Jin-qiu,CHAI Yun,LI Yu-huan,GAO Rong-mei,LIU Ming-liang

ObjectiveTo design and synthesize a series of novel quinolones containing a heteroaromatic moiety,and evaluate their in vitroantiviral (HCMV and HSV-1) activity.MethodsTarget compounds were synthesized through nucleophilic substitution of N-heteroaromaticpiperazines with different quinolone cores.Their structures were characterized by1H-NMR,13C-NMR,MS and HRMS.In vitro antiviral (HCMV and HSV-1) activity of the compounds was evaluated by CPE assay.ResultsTwenty-two compounds including WC5 were synthesized in this study.Some compounds were found to have inhibition against HCMV and/or HSV-1.Compound 19 [IC50:(2.18 ± 0.30) μg/ml]is slightly less active than WC5 [IC50:(1.68 ± 0.25) μg/ml]against HSV-1.ConclusionThe study enriches the structure activity relationship of quinolone against HCMV/HSV-1,which lays the foundation for the future design of novel quinolones with potent activity.

Quinolones; Chemistry techniques,synthetic; Antiviral agents; Herpesvirus 1,human; Cytomegalovirus

LIU Ming-liang,Email:lmllyx@126.com

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（81502923）

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所有機(jī)化學(xué)室

劉明亮，Email：lmllyx@126.com

2017-01-16

*同為第一作者

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.003

方法N-芳雜環(huán)基哌嗪與喹諾酮母核化合物通過親核取代反應(yīng)制備目標(biāo)物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、MS 和HRMS 確證。CPE 法測定所有目標(biāo)物對細(xì)胞的 TC50及對HCMV 和 HSV-1 的 IC50值。

結(jié)果合成了 22 個喹諾酮類化合物（包括先導(dǎo)物 WC5）。部分目標(biāo)物對 HCMV 和（或）HSV-1 有抑制作用，其中化合物 19 對 HSV-1 的 IC50為（2.18 ± 0.30）μg/ml，略弱于 WC5 的（1.68 ± 0.25）μg/ml。

結(jié)論豐富了喹諾酮類化合物抗病毒構(gòu)效關(guān)系，并為下一步設(shè)計合成活性喹諾酮類化合物奠定基礎(chǔ)。

Author Affiliation:Department of Medicinal Chemistry,Institute of Medicinal Biotechnology,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Beijing 100050,China