李杰，何梅，王再花*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640;2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510631)

人工栽培鐵皮石斛及其市售干品品質(zhì)比較與HPLC指紋圖譜分析

李杰1，何梅2，王再花1*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640;2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510631)

比較不同產(chǎn)地鐵皮石斛品質(zhì)差異，建立HPLC指紋圖譜，對(duì)其質(zhì)量控制提供參考。以29份來(lái)自云南、浙江、湖南、廣西和廣東不同栽培產(chǎn)地的鐵皮石斛(25份鮮條、4份市售干條和楓斗)為試材，比較了其多糖和醇溶性浸出物含量，并利用HPLC法建立了鐵皮石斛指紋圖譜。結(jié)果表明，樣品間多糖含量和醇溶性浸出物含量差異顯著，有1份樣品的多糖含量和4份樣品的醇溶性浸出物含量未達(dá)到中國(guó)藥典的標(biāo)準(zhǔn)。HPLC指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)29份樣品共有13個(gè)共有峰，除1份云南樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度為0.676外，其余樣品與對(duì)照?qǐng)D譜相似度均在0.751～0.934。依據(jù)共有峰峰面積聚類分析發(fā)現(xiàn)僅少數(shù)來(lái)源地相近的鐵皮石斛樣品能優(yōu)先聚類，而多糖含量、醇溶性浸出物含量與相似度間并沒(méi)有明顯的相關(guān)性。不同產(chǎn)地的人工栽培鐵皮石斛及其市售干品品質(zhì)差異較大，鐵皮石斛HPLC指紋圖譜含13個(gè)共有峰，利用該圖譜可以對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

鐵皮石斛;多糖;醇溶性浸出物;HPLC指紋圖譜

鐵皮石斛(Dendrobium officinale)是蘭科石斛屬的多年生草本植物，我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，富含多糖、氨基酸和微量元素等多種化學(xué)成分，具有有健脾養(yǎng)胃、滋陰補(bǔ)腎、潤(rùn)肺生津等功效［1－3］，現(xiàn)代藥理研究也證明，鐵皮石斛還具有增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力［4］、抗氧化［5－6］、抗腫瘤［7］、降低血糖［6，8］、鎮(zhèn)痛消炎［9］等作用，藥用保健價(jià)值高。目前鐵皮石斛在秦嶺淮河以南的諸多省區(qū)都有分布和栽培，云南和浙江的栽培面積較大，而由于產(chǎn)地、生態(tài)環(huán)境和栽培管理的不同，產(chǎn)品質(zhì)量和化學(xué)成分也存在差異，2010年版《中國(guó)藥典》就對(duì)其多糖和醇溶性浸出物含量提出了明確要求［10］。為有效地比較和控制鐵皮石斛產(chǎn)品質(zhì)量，鄧星燕等［11］建立了利用紫外光譜快速鑒別云南省不同產(chǎn)地鐵皮石斛的方法，何鐵光等［12］分析了廣西省內(nèi)13份鐵皮石斛新鮮莖的HPLC指紋圖譜，而劉文杰等［13］和崔娟等［14］則主要分析了云南省內(nèi)不同產(chǎn)地鐵皮石斛新鮮莖的HPLC指紋圖譜分析，而有關(guān)湖南、廣東等地栽培的鐵皮石斛以及市售鐵皮石斛干條和楓斗的報(bào)道甚少。本研究參考《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)比較測(cè)定了25份來(lái)自云南、浙江、湖南、廣西和廣東不同來(lái)源的鐵皮石斛新鮮莖以及4份市售干條和楓斗樣品的多糖和醇溶性浸出物成分含量，并利用HPLC指紋圖譜法進(jìn)行了比較研究。比較不同來(lái)源的人工栽培鐵皮石斛及其市售干品品質(zhì)，建立HPLC指紋圖譜，并對(duì)其品質(zhì)進(jìn)行比較評(píng)價(jià)，以期對(duì)鐵皮石斛質(zhì)量現(xiàn)狀和質(zhì)量控制提供參考。

表1 鐵皮石斛編號(hào)及其來(lái)源Table 1 Numbers and locations of Dendrobium officinale samples

1 材料與方法

1.1 供試材料

采集于不同地點(diǎn)的人工栽培鐵皮石斛新鮮莖25份、市售鐵皮石斛干條2份和鐵皮楓斗2份，共29份樣品，60℃烘干，粉碎過(guò)60目篩，置干燥器中備用。樣品編號(hào)及其來(lái)源具體見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC供試樣品液制備精密稱取鐵皮石斛粉末l g于磨口三角瓶中，適量10%氨水潤(rùn)濕，加入甲醇50mL并密閉靜置30 min，于85℃下水浴回流提取4 h，趁熱過(guò)濾，濾液于65℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后，用5 mL甲醇溶解并定容，過(guò)膜過(guò)濾得到供試溶液，每樣品提取3次作為3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 HPLC色譜分析條件儀器為Aglient1100高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱:C18液相色譜柱250 mm×4.6 mm，5μm。流動(dòng)相:乙腈(A)～0.1%磷酸(B)，A+B=100;梯度洗脫A的濃度變化為0～10 min，10%;10～20 min，15%;20～30 min，20%;30～40 min，20%;40～55 min，25%;55～60 min，10%;60～67 min，10%。流速:1.00 mL/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為310 nm，進(jìn)樣體積:20μl。

1.2.3 多糖含量與醇溶性浸出物含量測(cè)定多糖參考《中國(guó)藥典》2010年版的方法進(jìn)行測(cè)定分析［10］，每份樣品測(cè)定3次，取其平均值。醇溶性浸出物含量照《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄XA項(xiàng)下熱浸法測(cè)定［10］，用乙醇做溶劑，每份樣品測(cè)定3次，取其平均值。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)利用SAS進(jìn)行方差分析和聚類分析，指紋圖譜數(shù)據(jù)應(yīng)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(《國(guó)家藥典委員會(huì)》2004A版)軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛共有峰的標(biāo)定與對(duì)照指紋圖譜的生成

運(yùn)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”2004A版軟件對(duì)不同來(lái)源的29份鐵皮石斛樣品HPLC指紋圖譜進(jìn)行多點(diǎn)校正，再進(jìn)行相似度分析和匹配分析，并匹配后生成對(duì)照指紋圖譜。從圖1可以看出，29份樣品共有13個(gè)共有峰，其中11和12號(hào)峰的峰面積相對(duì)大些。

2.2 相似度比較

利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”2004A版軟件，計(jì)算不同產(chǎn)地的29份鐵皮石斛樣品間指紋圖譜的相似度和與對(duì)照指紋圖譜的相似度(表2)。各產(chǎn)地樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.676～0.934，除S15樣品的相似度略低外，其余樣品的相似度均在0.75以上，其中10個(gè)樣品的相似度達(dá)在0.90以上，相似度較好。

2.3 不同來(lái)源鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物含量比較

圖1 29份鐵皮石斛樣品指紋圖譜的匹配分析Fig.1 Fingerprintsmatching analysis of 29 Dendrobium officinale

表2 29份鐵皮石斛的多糖含量、醇溶性浸出物含量與相似度Table 2 Polysaccharide content，alcohol soluble extract content and similarity of29 Dendrobium officinale samples

由表2可以看出，鐵皮石斛的2種主要成分存在較大差異。29份樣品中，18份樣品的多糖含量超過(guò)40.0%，其中S16的多糖含量最高，為55%，顯著高于其他樣品，而S17、S18和S20次之，三者的多糖含量也達(dá)到了44%以上，而S15最低，僅24.3 %。醇溶性浸出物方方面，有13份樣品均超過(guò)10.0%，最高為S25，達(dá)27.2%，顯著高于其他樣品，而S29最低，顯著低于其他樣品。參考2010版《中國(guó)藥典》的標(biāo)準(zhǔn)，鐵皮石斛多糖含量不得少于25.0 %，醇溶性浸出物含量不得少于6.5%，本研究中的29份樣品多糖含量?jī)HS15低于該標(biāo)準(zhǔn)，多糖含量達(dá)標(biāo)率為96.6%，而S2、S20、S22和S29 4份樣品(包含1份市售干條和1份楓斗)的醇溶性浸出物含量低于該標(biāo)準(zhǔn)，醇溶性浸出物含量達(dá)標(biāo)率為86.2 %。

2.4 聚類分析

HPLC指紋圖譜反映了鐵皮石斛中的大部分化學(xué)成分信息，而峰面積的大小則表明化學(xué)成分含量的高低。將29份樣品的13個(gè)共有峰峰面積利用SAS軟件進(jìn)行聚類分析，其結(jié)果如圖2所示。29份樣品聚為3類，S4、S14和S21為第1類群，其中S4和S14都來(lái)自廣西都嶠山，而S21為浙江藥店。S3、S10和S18為第2類群，其余樣品為第3類群。在第3類群中，S9、S11和S12均來(lái)自廣西，且先聚在一起。S5、S26、S13和S7先聚在了一起，四者均來(lái)自云南。S20、S22和S23也優(yōu)先聚在了一起，其中S20和S23均來(lái)自廣州清平市場(chǎng)，說(shuō)明這些來(lái)源地相近的鐵皮石斛其化學(xué)成分含量相似，但其他多數(shù)樣品未見(jiàn)明顯的規(guī)律。

圖2 不同產(chǎn)地鐵皮石斛聚類分析圖Fig.2 Clustering analysis of Dendrobiumofficinale produced from different areas

3 討論

因氣候條件和栽培技術(shù)的不同，不同地域栽培的鐵皮石斛主要化合物成分含量存在顯著差異，俞巧仙等［15］研究了鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物含量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，證實(shí)當(dāng)以多糖與醇溶性浸出物總量為目標(biāo)時(shí)以春芽萌動(dòng)至開(kāi)花前采收為宜，本研究中樣品于12月份采收，與其時(shí)期一致。諸燕等［16］研究發(fā)現(xiàn)浙江省內(nèi)不同產(chǎn)地的13份2年生鐵皮石斛的多糖含量在25.63%～41.65%，而劉文杰等［13］也發(fā)現(xiàn)云南省內(nèi)不同產(chǎn)地的6份鐵皮石斛多糖含量在30.63%～35.87%，而醇溶性浸出物含量在7.92%～13.65%，且以勐海栽培的含量最高。本研究進(jìn)一步擴(kuò)大了樣品數(shù)及其栽培范圍，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛的差異更大，29份樣品的多糖含量在24.3%～55%，多糖含量高于40%的樣品主要來(lái)至浙江、廣西和廣東產(chǎn)地，而低于30%的樣品則廣西、云南和浙江產(chǎn)地均有。29份樣品的醇溶性浸出物含量在4.0%～27.2%，含量較高的幾份樣品來(lái)自云南、浙江和廣西。2份湖南樣品的這2個(gè)指標(biāo)基本處于中等水平。對(duì)4份市售鐵皮石斛干品和楓斗的比較發(fā)現(xiàn)，多糖含量均符合《中國(guó)藥典》的標(biāo)準(zhǔn)，且3份含量在40%以上，但醇溶性浸出物含量則有2份未達(dá)到《中國(guó)藥典》6.5%的標(biāo)準(zhǔn)［10］，因此，基于對(duì)市售鐵皮石斛質(zhì)量的監(jiān)管，醇溶性浸出物含量的檢測(cè)顯得更為重要。

HPLC指紋圖譜的直觀比較，能夠反映各化學(xué)成分的有無(wú)和含量高低，從而判斷樣品的一致性情況。何鐵光等［12］分析13份廣西栽培的鐵皮石斛，有12份相似度均在0.7以上，1份僅為0.604;劉文杰等［13］發(fā)現(xiàn)6份云南栽培的鐵皮石斛相似度在0.8以上。本研究中來(lái)自5個(gè)不同栽培省份的29份鐵皮石斛共找到13個(gè)共有峰，其中28份樣品的相似度在0.75以上，而4份楓斗和干品的相似度在0.751～0.914，說(shuō)明鐵皮石斛鮮條、干條和楓斗的品質(zhì)都存在差異。樣品S15相似度最低(0.604)，該樣品的多糖含量也最低(24.3%)，而將所有樣品的多糖含量、醇溶性浸出物含量以及與對(duì)照指紋圖譜的相似度進(jìn)行分析，未見(jiàn)明顯的相關(guān)性。

4 結(jié)論

不同產(chǎn)地的29份人工栽培鐵皮石斛及其市售干品在多糖含量和醇溶性浸出物含量上差異顯著，基于上述樣品構(gòu)建的鐵皮石斛HPLC指紋圖譜含13個(gè)共有峰，利用該圖譜可以對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

參考文獻(xiàn):

［1］章金輝，王再花，李杰，等.大苞鞘石斛與鐵皮石斛主要活性成分比較分析［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2015，36(12):2192－2197.

［2］張愛(ài)蓮，魏濤，斯金平，等.鐵皮石斛中基本氨基酸含量變異規(guī)律［J］.中國(guó)中藥雜志，2011，36(19):2632－2635.

［3］黎萬(wàn)奎，胡之璧，周吉燕，等.人工栽培鐵皮石斛與其他來(lái)源鐵皮石斛中氨基酸與多糖及微量元素的比較分析［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，22(4):80－83.

［4］Xia L J，Liu X F，Guo H Y，et al.Partial characterization and immunomodulatory activity of polysaccharides from the stem of Dendrobium officinale(Tiepishihu)in vitro［J］.Journal of Functional Foods，2012，4(1):294－301.

［5］王再花，章金輝，李杰，等.3種藥用石斛多糖的抗氧化活性比較研究［J］.華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，47(5):65－70.

［6］Pan L H，Li X F，Wang M N，et al.Comparison of hypoglycemic and antioxidative effects of polysaccharides from four different Dendrobium species［J］.International Journal of Niological Macromolecules，2014，64:420－427.

［7］何鐵光，楊麗濤，李楊瑞，等.鐵皮石斛原球莖多糖DCPP1a-1的理化性質(zhì)及抗腫瘤活性［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2007，19:578－583.

［8］吳昊姝，徐健華，陳立鉆，等.鐵皮石斛降血糖作用及其機(jī)制的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2004，29(2):160－163.

［9］侯少貞，李煥彬，郭建茹，等.鐵皮石斛鎮(zhèn)痛與抗炎作用研究［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33(10):49－52.

［10］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.第二部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:265－266.

［11］鄧星燕，張霽，王元忠，等.不同產(chǎn)地鐵皮石斛紫外指紋圖譜鑒別分析［J］.云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014，36(6):912－919.

［12］何鐵光，盧聲仙，王愛(ài)勤，等.廣西鐵皮石斛HPLC指紋圖譜研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2012，24:353－358，320.

［13］劉文杰，孫志蓉，杜遠(yuǎn)，等.不同產(chǎn)地鐵皮石斛主要化學(xué)成分及指紋圖譜研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，36(2):117－120.

［14］崔娟，楊柳，譚仕杰，等.鐵皮石斛HPLC指紋圖譜研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2013，48(19):1673－1676.

［15］俞巧仙，郭英英，斯金平，等.鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物動(dòng)態(tài)累積規(guī)律研究［J］.中國(guó)中藥雜，2014，39(24):4769－4772.

［16］諸燕，斯金平，郭寶林，等.人工栽培鐵皮石斛多糖含量變異規(guī)律［J］.中國(guó)中藥雜志，2010，35(4):427－430.

(責(zé)任編輯 陳虹)

Quality Com parison and HPLC Fingerprints Analysis of Cultivated Dendrobium officinale and Its Dried Commodities

LI Jie1，HE Mei2，WANG Zai-hua1*
(1.Environmental Horticulture Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Lab of Ornamental PlantGermplasm Innovation and Utilization，Guangdong Guangzhou 510640，China;2.College of Life Science，South China Normal University/Guangdong Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development，Guangdong Guangzhou 510631，China)

Comparing the quality differences of Dendrobium officinale from different areasand establishing the HPLC fingerprintsof D.officinale were conducted to provide a reference for quality control.The polysaccharide contentand alcohol soluble extract content of29 D.officinale(25 fresh samples and 4 dried samples and Fengdou)from different cultivation areaswere evaluated，and their fingerprintswere established using HPLCmethod.The results showed that29 sampleshave significant differences in the contentofpolysaccharidesand alcoholsoluble extracts，butpolysaccharide contentof one sample and alcoholsoluble extractcontentof four sampleswere below the standardsof the Chinese pharmacopoeia.HPLC fingerprints indicated therewere13 common peaks among29 samples.The similarity of HPLC fingerprintsof D.officinale was higher(between 0.751 and 0.934)except one Yunnan sample was0.676.Clustering analysis indicated a few D.officinale with similar sourceswere priority clustering，and no correlation was found among the polysaccharide content，alcohol soluble extract content and similarity.The qualitieswere diverse among the D.officinale samples from different areas.HPLC fingerprints of D.officinale contained 13 common peaks，which could be used for quality evaluation of D.officinale.

Dendrobium officinale;Polysaccharides;Alcohol soluble extract;HPLC fingerprints

S567

A

1001－4829(2017)2－0262－05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.2.004

2016－03－20

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B090600147和2013B0 20302011);國(guó)家青年基金項(xiàng)目(31400597)

李杰(1983－)，男，湖南常德人，博士，助理研究員，研究方向?yàn)橹参镌耘嗌砼c遺傳育種，*為通訊作者，E-mail:wangzaihua@163.com。