遲惠榮 毛碧增

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州 310058）

技術(shù)與方法

植物病毒檢測(cè)及脫毒方法的研究進(jìn)展

遲惠榮 毛碧增

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州 310058）

病毒是人們所知的自然界最小的生物之一，其形態(tài)大小要借助電鏡放大到幾萬(wàn)甚至幾十萬(wàn)倍才能觀察得到。病毒具有嚴(yán)格的寄生性，必須在宿主細(xì)胞內(nèi)才能生長(zhǎng)繁殖。植物病毒是病毒科的一個(gè)重要組成部分，這一類病原物所引起的病害正逐年加重，影響了植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，降低了產(chǎn)量和品質(zhì)。因病毒種類多，危害機(jī)制復(fù)雜，所以病毒病的防治也存在一定的困難。闡述了植物病毒的檢測(cè)方法，詳述了脫毒的技術(shù)方法及其近幾年的應(yīng)用情況，討論了在脫毒過(guò)程中要注意的問(wèn)題，并對(duì)今后的研究方向進(jìn)行展望，以期為相關(guān)研究提供一些參考和理論依據(jù)。

植物病毒；檢測(cè)技術(shù)；脫毒方法

自1892年發(fā)現(xiàn)第一種植物病毒病——煙草花葉?。?］，至今已報(bào)道了 600 種以上的病毒種類［2］。植物病毒病給世界各地帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界僅糧食作物每年因病毒病導(dǎo)致的損失高達(dá)200億美元，經(jīng)濟(jì)作物因病毒病造成的損失，每年高達(dá)600億美元［3］。常見(jiàn)的病毒有煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）、番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和馬鈴薯 Y 病毒（Potato virus Y，PVY）［4］。植物病毒分布廣、繁殖快、防治難，有植物“癌癥”之稱。病毒可通過(guò)螨類、線蟲［5］和真菌［6］等介體傳染和嫁接、汁液等無(wú)介體傳染，尤其是近年來(lái)由褐飛虱（Nilaparvata lugens）傳播的水稻矮縮病毒（Rice dwarf virus，RDV）［7，8］和由煙粉虱（Bemisia tabaci）傳播的TYLCV［9］危害更為嚴(yán)重。病毒侵入寄主植物，在寄主細(xì)胞內(nèi)完成自我復(fù)制后轉(zhuǎn)運(yùn)其他組織，最后使整株植物發(fā)病。病毒在植物體內(nèi)主要有兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑：通過(guò)胞間連絲在相鄰細(xì)胞間的短距離胞間運(yùn)動(dòng)（Cell-to-cell movement）和通過(guò)維管束組織的長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)（Long-distacne systemic transport）［10］。病毒能破壞細(xì)胞的代謝活動(dòng)，引起植物的生理變化，常常表現(xiàn)出變色、壞死、畸形、皺縮、蕨葉、曲葉、卷葉、縮節(jié)、不孕、植株矮小、節(jié)間短、密集和果實(shí)畸形等，嚴(yán)重時(shí)可影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，降低作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，甚至使植物死亡。在大田作物、十字花科植物、茄科植物和果樹上發(fā)生的病毒病逐年加重，并且有多種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象。尤其對(duì)于百合、藏紅花［11，12］、草莓、甘薯及菊花［13，14］等無(wú)性繁殖的植物來(lái)說(shuō)，植株體內(nèi)病毒隨著栽培時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷積累，導(dǎo)致品種退化、品質(zhì)下降，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益。病毒病危害巨大，病毒的分離、鑒定及高效檢測(cè)尤為重要。本文總結(jié)了植物病毒的檢測(cè)方法、脫毒方法，認(rèn)為傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)與當(dāng)前的分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合能有效的檢測(cè)病毒種類，種苗脫毒體系的建立是推廣健康優(yōu)質(zhì)種苗行之有效的方法。

1 植物病毒病檢測(cè)方法

1.1 生物學(xué)檢測(cè)方法

生物學(xué)檢測(cè)方法是根據(jù)寄主植物受病毒侵染后所產(chǎn)生的特異性癥狀來(lái)鑒定病毒病的一種方法［15］。指示植物主要有兩種：草本指示植物和木本指示植物。草本指示植物主要有藜科、茄科、豆科及葫蘆科，通常情況下采用汁液摩擦接種法［16］。吳凌娟等［17］用指示植物千日紅（Gomphrena globosa）、心葉煙（Nicotiana glutinosa）等鑒定PVX；李春敏［18］用黃瓜為指示植物鑒定核果壞死環(huán)斑病毒（PNRSV）。木本指示植物有GF305桃苗、白普賢櫻花［18］，使用最多的是雙重芽接法［19］，蘋果潛隱病毒的常規(guī)檢測(cè)主要是木本指示植物檢測(cè)法［20］。在接種病毒時(shí)選擇健壯的指示植物，接種過(guò)程在防蟲網(wǎng)下進(jìn)行。該法受檢測(cè)速度較慢，靈敏度較低，季節(jié)限制等因素影響，應(yīng)用局限性較大。

1.2 電子顯微觀察法

1939年Kausche等［21］首次用電子顯微鏡觀察到了煙草花葉病毒的長(zhǎng)形病毒粒子，開(kāi)啟了植物病毒病研究的序幕。電子顯微觀察是直接通過(guò)掃描電鏡、透射電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及病毒侵染寄主所引起的細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的變化，檢測(cè)方便、快速。觀察病毒常用到的方法是負(fù)染色電鏡法、超薄切片法。韋石泉等［22］用負(fù)染色技術(shù)電鏡觀察，結(jié)果表明可檢測(cè)出線條狀和桿狀病毒，如蕪菁花葉病毒（TuMV）較為有效，但檢測(cè)球形和短桿狀病毒，如CMV甚為困難。謝禮等［23］選取病葉做超薄切片電鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蠶豆葉肉細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重病理變化，病變細(xì)胞線粒體增生和聚集，形狀畸變，體積增大。不過(guò)近些年來(lái)建立了免疫吸附和修飾、免疫膠體金標(biāo)記［24］、圖像分析等一整套病毒電鏡檢測(cè)研究方法，將免疫電鏡新技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)蔬菜、花卉等作物的病毒病，首次報(bào)道了番茄花葉病毒（ToMV）的細(xì)胞病理學(xué)、葡萄扇葉病毒（GFLV）的細(xì)胞病理學(xué)［25］，以及運(yùn)動(dòng)蛋白細(xì)胞定位和TuMV破壞光合作用的機(jī)制［26］。

1.3 血清學(xué)方法

血清學(xué)方法現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于植物病毒的檢測(cè)上，該法的原理是將抗原抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用結(jié)合起來(lái)。血清學(xué)方法主要有沉淀反應(yīng)、瓊膠擴(kuò)散法、凝集反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、斑點(diǎn)免疫結(jié)合法等。其中酶聯(lián)免疫吸附法最早是由Clark和Adnm于1977年提出的，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用到了各個(gè)領(lǐng)域，可檢測(cè)豆類植物上TMV、大豆花葉病毒（SMV）、CMV、苜蓿花葉病毒（AMV）4種不同形態(tài)、不同分類組群的病毒［27］。ELISA可以檢驗(yàn)出單粒種子中攜帶的病毒，且能靈敏檢驗(yàn)出種子不同部位如大豆的種皮、種胚、胚乳及胚根中的病毒。1982年，Hawkes等建立了點(diǎn)免疫結(jié)合測(cè)試技術(shù)（Dot immunobinding assay，DIA），用硝酸纖維素膜代替酶標(biāo)板，使檢測(cè)更為簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)［28］。1985年，Hibi等［29］利用這種方法檢測(cè)TMV獲得了較為理想的結(jié)果。此后DIA進(jìn)一步改良，發(fā)展了直接法、間接法及雙抗體夾心法等檢測(cè)方法，目前廣泛應(yīng)用于TuMv、SMV、CMV［28］、斑豆花葉病毒（CpMV）、芋花葉病毒（DMV）、柑桔速衰病毒（CTV）［30］和TYLCV［31］等病毒的檢測(cè)。血清學(xué)檢測(cè)具有靈敏、快速、特異性強(qiáng)、分析率高、花費(fèi)少等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)一些病毒含量低和含有干擾測(cè)定物質(zhì)的樣品則不能做出準(zhǔn)確的測(cè)定，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。同時(shí)也有一些病毒不能用血清學(xué)檢測(cè)，血清學(xué)檢測(cè)病毒是以病毒的外殼蛋白的抗原性進(jìn)行檢測(cè)的，而類病毒沒(méi)有外殼蛋白，還有一些病毒在某些情況下缺乏外殼蛋白，因此不能用血清學(xué)方法檢測(cè)［32］。

1.4 分子生物學(xué)檢測(cè)

通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)樣品中是否有病原微生物的核酸，從而可以特異地判定采集樣品中是否有相應(yīng)的病原微生物。常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)包括基因組電泳分析、DNA酶切圖譜分析、寡核苷酸指紋圖、核酸雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。其中核酸雜交和PCR技術(shù)以特異、快速、敏感的優(yōu)點(diǎn)適用于樣品的檢測(cè)中，是當(dāng)前應(yīng)用較廣泛的技術(shù)。在果樹上，RT-PCR 已被用來(lái)檢測(cè)李痘病毒（PPV）、櫻桃壞死銹斑駁病毒（CNRMV）、櫻桃病毒A（CVA）［33］、蘋果莖痘病毒（ASPV）、蘋果莖溝病毒（ASGV）［34］和蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）［35］等。高雅紅等［36］建立了PPV的熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)方法。在RTPCR的基礎(chǔ)上衍生出一些新的技術(shù)如基因芯片、巢式RT-PCR、半巢式RT-PCR等。此外，陳定虎等［37］采用RT-PCR方法結(jié)合納米磁珠技術(shù)來(lái)檢測(cè)PPV，結(jié)果表明該技術(shù)不僅能夠檢測(cè)到極低濃度的病毒，而且操作簡(jiǎn)單快速。逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技 術(shù)（Reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）作為近幾年新發(fā)展的擴(kuò)增方法，將反轉(zhuǎn)錄與核酸擴(kuò)增同時(shí)進(jìn)行，而且采用恒溫?cái)U(kuò)增的方法，不僅省去了反轉(zhuǎn)錄的時(shí)間，更縮短了核酸擴(kuò)增所用時(shí)間，具有檢測(cè)速度快、靈敏度高及不需要昂貴的循環(huán)擴(kuò)增儀器等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于多種動(dòng)物病毒［38］和植物病毒的檢測(cè)，張?chǎng)┠鹊龋?9］利用該技術(shù)快速檢測(cè)SMV，丁小蘭等［40］建立了馬鈴薯帚頂病毒（PMTV）的 RT-LAMP 檢測(cè)方法。從核酸的水平來(lái)檢測(cè)病毒比血清學(xué)方法靈敏度更高，特異性更強(qiáng)，檢測(cè)病毒的范圍更廣，可以克服血清學(xué)檢測(cè)法和其他檢測(cè)方法中的一些缺點(diǎn)，可以進(jìn)行大批量的樣本檢測(cè)［32］。但是，對(duì)不同的寄主植物、不同的病毒種或株系（分離物），各種方法的檢測(cè)靈敏度各不相同，需在多次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中找到最佳的方法。

2 脫除植物病毒的方法

2.1 莖尖組織培養(yǎng)脫毒法

莖尖培養(yǎng)脫毒是利用病毒在植物組織內(nèi)分布不均勻的特點(diǎn)，在植物生長(zhǎng)、分裂最為旺盛的地方，其含有的病毒顆粒相對(duì)較少，又因?yàn)椴《驹谥参矬w內(nèi)隨維管系統(tǒng)遷移，在莖尖分生組織中沒(méi)有維管束系統(tǒng)，病毒通過(guò)胞間連絲傳遞比較慢，而細(xì)胞分裂速度快，所以莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)部位幾乎沒(méi)有病毒，并且植物分生組織內(nèi)含有較高的內(nèi)源激素，可能對(duì)病毒的復(fù)制起到抑制作用。因此，可選用莖尖作為脫毒培養(yǎng)的材料。1952年法國(guó)的Morel等［41］將帶病毒的大麗菊莖尖切離培養(yǎng)，獲得脫毒植株。1962年Belkengren 和 Miller［42］首先用組織培養(yǎng)的方法獲得了草莓無(wú)病毒苗，毛碧增等［43］采用“多重分步法”脫毒方法獲得了草莓脫毒苗，并建立了脫毒種苗的繁育體系，通過(guò)剝?nèi)?.5 mm的草莓苗莖尖，脫毒率可達(dá)到100%，脫毒原種苗繁殖系數(shù)為1∶375，抗病性提高，田間生長(zhǎng)旺，增產(chǎn)顯著。高慧卿等［44］對(duì)初代培養(yǎng)的百合無(wú)菌苗進(jìn)行莖尖脫毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CMV的脫毒率可達(dá)到82.29%。Kawarabayashi等［45］利用莖尖脫毒法獲取無(wú)LSV、CMV的植株和種球，有效的消除了病毒危害的現(xiàn)象，促進(jìn)百合生長(zhǎng)。平培元等［46］報(bào)道了利用莖尖脫毒方法獲得了杭白菊無(wú)毒苗的再生植株。同時(shí)，剝離莖尖的大小已成為脫毒是否成功的關(guān)鍵所在。切取莖尖的長(zhǎng)度原則上是0.1-1 mm，若莖尖長(zhǎng)度過(guò)小則不易成活，過(guò)大脫毒效果不好。何歡樂(lè)等［47］相關(guān)分析結(jié)果表明，在相同的培養(yǎng)基上，莖尖越小成活率越低，莖尖越大成活率越高，大小為0.2 mm的莖尖成活率為16.67%，電鏡下未檢測(cè)到病毒粒子；大小為1 mm的莖尖成活率為83.33%，電鏡下檢測(cè)到7個(gè)病毒粒子，試管苗出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象。劉輝輝［14］選取0.3-0.5 mm杭白菊莖尖接種到適宜培養(yǎng)培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脫毒的杭白菊的株高、莖粗、有效花朵數(shù)、分支數(shù)等性狀與未脫毒的杭白菊存在顯著差異。何新民等［48］研究表明，以‘紅姑娘2號(hào)’甘薯為材料，當(dāng)剝?nèi)〉那o尖為0.3-0.5 mm時(shí)，脫毒率為100%；莖尖為0.6-0.8 mm時(shí)，脫毒率為93.3%。莖尖脫毒實(shí)驗(yàn)中剝?nèi)〉那o尖大小也與病毒種類有關(guān)，馬鈴薯S病毒（PVS）和PVX病毒離生長(zhǎng)點(diǎn)很近，莖尖剝?nèi)￠L(zhǎng)度須在 0.2 mm 以下，PVY離生長(zhǎng)點(diǎn)較遠(yuǎn)，莖尖可切取 0.3-0.5 mm，通過(guò)剝?nèi)『线m的莖尖長(zhǎng)度對(duì)提高脫毒效果有明顯作用。

不同材料的莖尖剝?nèi)∨c脫毒率有關(guān)，黃遠(yuǎn)新等［49］對(duì)帶有甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）的‘渝薯2號(hào)’進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)切取葉原基處于突起態(tài)、半閉合態(tài)和閉合態(tài)0.22-0.35 mm大小的莖尖時(shí)，最終的脫毒效果差異顯著，獲得脫毒率分別為100%，83.9%和71.9%。趙軍良［50］發(fā)現(xiàn)選取0.2-0.5 mm帶有一個(gè)葉原基的莖尖，脫毒效果最好，成活率也最高，經(jīng)在田間用指示植物初步檢測(cè)得知，脫毒率達(dá)到95%以上。病毒的復(fù)合侵染也會(huì)影響脫毒效果，單一病毒侵染植株，采用莖尖組織培養(yǎng)法較容易獲得無(wú)毒的組培苗，若兩種或兩種以上的病毒復(fù)合侵染植株時(shí)，只采用莖尖脫毒法無(wú)法得到完全脫毒的組培苗。莖尖培養(yǎng)的過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)褐化、玻璃化、外植體污染等問(wèn)題，選擇適宜的消毒時(shí)間、適宜的培養(yǎng)基都是獲得脫毒苗的關(guān)鍵。

2.2 熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒法

熱處理脫毒法是利用高溫可使蛋白質(zhì)變性，從而使病毒鈍化的原理。熱處理的材料可以是已經(jīng)長(zhǎng)芽的莖塊，也可以是組培瓶中長(zhǎng)到約1 cm的小植株［51］，將其在一定的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，使植株在此溫度下的生長(zhǎng)速度快于病毒的復(fù)制速度，切取不含有病毒的莖尖接種到適宜的培養(yǎng)基中，最終獲得脫毒苗。熱處理時(shí)的溫度及處理時(shí)間的長(zhǎng)短都應(yīng)慎重選擇，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)殺死芽眼，還可能對(duì)植物組織造成不良影響；時(shí)間過(guò)短達(dá)不到預(yù)期的脫毒效果，且熱處理的溫度和時(shí)間要基于不同病毒的鈍化（致死）溫度，TSWV致死最低溫度為45℃，而TMV鈍化溫度超過(guò)90℃，大多數(shù)植物病毒的鈍化溫度在55-70℃之間［3］。唐菖蒲莖尖組織于42℃處理5 d，脫除病毒的效果最佳［52］。37℃恒溫?zé)崽幚?0 d后ACLSV的脫除率為100%［53］。Previati等［54］用熱處理方法（20-30℃處理12 d或者在30℃處理18 d）去除菊花B病毒（CVB），采用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，得到10%的脫毒植株。王莉等［55］將草莓苗置于37-40℃ 培養(yǎng)4周，結(jié)果表明熱處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合可使草莓病毒脫除率達(dá)到72.7%-100%，效果穩(wěn)定，是較為理想的脫除技術(shù)。何歡樂(lè)等［38］通過(guò)二次脫毒法、改良熱處理+莖尖培養(yǎng)法、冷處理+莖尖培養(yǎng)法進(jìn)行草莓的脫毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改良熱處理（40℃水浴處理4 h）+莖尖培養(yǎng)法，莖尖成活率高達(dá)47.37%，脫毒率達(dá)到了100%，試管苗沒(méi)有出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象。趙霜［56］采用莖尖脫毒法、化學(xué)脫毒法和熱處理結(jié)合莖尖脫毒法對(duì)菊花體內(nèi)的3種病毒（CVB、CMV和TMV）進(jìn)行脫毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)法的脫毒效果最佳，脫毒率達(dá)到94%。

近幾年還發(fā)展出了變溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)來(lái)提高外植體成活率和脫毒率的方法。暗培養(yǎng)條件下變溫?zé)崽幚恚?8℃/32℃）適合大多數(shù)品種和砧木脫除蘋果潛隱性病毒［57］。經(jīng)變溫?zé)崽幚肀群銣責(zé)崽幚砻摱韭矢?。熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒法一方面不存在消毒問(wèn)題，使莖尖培養(yǎng)的存活率上升，可較少污染率；另一方面，解決了常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫病毒所需的較小莖尖帶來(lái)的操作困難和成活率較低的問(wèn)題。

2.3 化學(xué)脫毒法

化學(xué)脫毒法是選用一些抗病毒藥劑，通過(guò)將這些藥劑加入到培養(yǎng)基中去除病毒，可顯著提高無(wú)病毒植株的幾率。其作用機(jī)理主要為競(jìng)爭(zhēng)寄主細(xì)胞表面受體、阻礙病毒穿入脫殼、阻礙病毒生物合成和提高寄主抗病能力4 種方式［11］。常用的病毒化學(xué)藥物有三氮唑核苷（病毒唑）、5-二氫尿嘧啶（DHT）、雙乙酰-二氫-5-氮尿嘧啶（DA-DHT）、放線菌素、堿性孔雀綠及環(huán)乙酰胺等，其中病毒唑是廣譜性的抗病毒藥物。采用化學(xué)脫毒方法，較容易脫除多種病毒，并且這種方法對(duì)取材要求不嚴(yán)，接種莖尖長(zhǎng)度可大于1 mm，易于分化出苗，提高存活率［58］。劉衛(wèi)平等［59］通過(guò)添加抗病毒藥劑成功地脫除PVX。謝嘉華等［60］研究表明，病毒唑?qū)MV、PVX、TMV等多種病毒的增殖有抑制作用，最終提高脫毒苗的產(chǎn)量。不同的抗病毒的藥劑所達(dá)到的脫毒效果不同。Sharmas等［61］采用化學(xué)脫毒與莖尖培養(yǎng)法脫除柑橘環(huán)斑病毒（ICRSV），結(jié)果發(fā)現(xiàn)25 mg/L的病毒唑脫毒率為37%，25 mg/L無(wú)環(huán)鳥苷（ACV）的脫毒率為20.8%，疊氮胸苷和DHT對(duì)ICRSV無(wú)脫毒效果。病毒脫除效果與抗病毒藥劑處理時(shí)間有關(guān)，20 mg/L病毒醚處理時(shí)間由30 d延長(zhǎng)至40 d后進(jìn)行超低溫處理，‘豐水’和‘美人酥’的ASGV脫除率分別由84.6%和60%提高至90%和80%［62］。

化學(xué)脫毒法使用方便，操作簡(jiǎn)單，適用于病毒的大面積防治，對(duì)于病毒的復(fù)合侵染有明顯的抑制作用，可以同時(shí)去除多種病毒。不足之處是，化學(xué)試劑可能會(huì)對(duì)環(huán)境造成危害。

2.4 超低溫保存結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒法

近年來(lái)，在植物超低溫保存的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)處理的植株體內(nèi)的病毒量降低，甚至有些材料沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病毒的存在，之后被人們作為一種脫除病毒的方法。該脫毒法原理是含有病毒的頂端細(xì)胞液泡內(nèi)含有大量的水分，在超低溫（-80℃以下）保存過(guò)程中易形成水晶致死，而增殖較快的分生組織細(xì)胞胞質(zhì)濃，含水少，因而在低溫保存的過(guò)程中不易致死，最終能獲得脫毒的植株。常用液氮做冷源。Brison等［63］采用超低溫保存結(jié)合莖尖離體培養(yǎng)方法使李屬根狀莖上的PPV的脫毒率達(dá)到50%，比單純的莖尖培養(yǎng)的脫毒率多了近2倍，開(kāi)創(chuàng)了超低溫脫毒法。王壯偉［64］采用超低溫玻璃化結(jié)合莖尖培養(yǎng)獲得了70%無(wú)蘋果潛隱性病毒的植株。白建明等［65］用超低溫保存法和常規(guī)方法（莖尖分生組織培養(yǎng)、溫?zé)岑煼ㄒ约皽責(zé)岑煼ńY(jié)合莖尖分生組織培養(yǎng)）來(lái)去除馬鈴薯試管苗中馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd）和PVX，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種方法都可以去除PVX，其中超低溫保存法的脫毒率最高，為59.13%。

該法的顯著特點(diǎn)是脫毒率高，能同時(shí)處理大量材料，能夠排除切取莖尖過(guò)程的操作問(wèn)題，不需要昂貴的儀器設(shè)備，短時(shí)間內(nèi)就可以生產(chǎn)出無(wú)毒植株，然而不足之處是其存活率較傳統(tǒng)脫毒方法低，具體操作步驟繁瑣，影響最終脫毒效果的因素較多。不同材料低溫保存的溫度仍需要通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)的摸索，低溫引起的表觀遺傳現(xiàn)象尚需進(jìn)一步研究。

2.5 組織培養(yǎng)脫毒法

2.5.1 愈傷組織培養(yǎng)脫毒法 愈傷組織培養(yǎng)脫毒法是通過(guò)選擇適宜的外植體來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后愈傷組織再分化進(jìn)而形成完整的再生植株。選擇愈傷組織脫毒法是因?yàn)橛鷤M織內(nèi)病毒的復(fù)制速度慢于細(xì)胞的增殖速度，又或者是因?yàn)槠渲械挠行┘?xì)胞通過(guò)突變獲得了抗病毒能力［66］。該方法的外植體一般選為根、莖、葉等營(yíng)養(yǎng)器官。許莉萍等［67］用甘蔗心葉愈傷組織培養(yǎng)，最終發(fā)現(xiàn)花葉病的發(fā)病率為0%。在剪切外植體時(shí)，一方面要保證愈傷高誘導(dǎo)率，又要注意傷口破壞程度最小，減少酚類物質(zhì)流出，減輕褐化程度。

2.5.2 花藥培養(yǎng)脫毒法 該方法的外植體一般為花藥、花瓣、花軸、花萼、胚珠、果實(shí)等生殖器官。外植體需要一個(gè)脫分化形成愈傷組織的過(guò)程，愈傷組織經(jīng)過(guò)再分化，形成叢生芽或產(chǎn)生胚狀體，然后誘導(dǎo)長(zhǎng)根，形成完整再生植株。覃蘭英等［68］最早通過(guò)花藥愈傷組織誘導(dǎo)再生植株的途徑，培育了‘因都卡’、‘達(dá)娜’等品種的花藥脫毒苗。曹有龍等［69］取4種供試品種4-5 mm花蕾誘導(dǎo)形成愈傷組織，最終結(jié)果表明花藥培養(yǎng)脫毒率平均為73.5%。利用花藥培養(yǎng)脫毒法，獲得的草莓脫毒苗長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，品質(zhì)明顯提高，產(chǎn)量較未脫毒草莓提高 20%-45%［70］。高慶玉等［71］選取花藥、幼葉和莖尖愈傷組織作為外植體接種在培養(yǎng)基中，以獲得最終的完整植株，結(jié)果表明花藥培養(yǎng)獲得的植株脫毒效果最好，達(dá)到100%，而幼葉和莖尖愈傷組織培養(yǎng)的脫毒效果只有20%?；ㄋ幣囵B(yǎng)脫毒法提高了脫毒率，降低了脫毒苗生產(chǎn)成本。但與莖尖分生組織培養(yǎng)相比，花藥誘導(dǎo)分化成苗率低，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，不利于快速繁殖。

2.6 基因工程脫毒法

近些年來(lái)，選用基因工程技術(shù)來(lái)脫除植物體內(nèi)的病毒也較為流行。目前研究結(jié)果顯示，有效的抗病毒基因主要來(lái)源于病毒本身，如外殼蛋白（CP）基因、移動(dòng)蛋白（MP）基因、復(fù)制酶（Replicase）基因、反義 RNA（Antisense RNA）、正義RNA（Sense RNA）、RNA 干擾（RNA interference，RNAi）等［72］。通過(guò)體外構(gòu)建的外源基因轉(zhuǎn)化載體，轉(zhuǎn)錄后形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA，有效誘導(dǎo)基因沉默，從而抵抗病毒的入侵和繁殖。Abel等［73］通過(guò)植物基因工程技術(shù)將TMV外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草，培育出能穩(wěn)定遺傳的抗病毒工程植株，由此開(kāi)啟了抗病毒植物基因工程這一新的領(lǐng)域。Gargouri-Bouzid 等［74］將PVY的CP 基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入馬鈴薯中，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中表達(dá)的病毒CP可以介導(dǎo)馬鈴薯對(duì)PVY 產(chǎn)生抗性。目前，已克隆了TMV、CMV、SMV、苜?；ㄈ~病毒（ALMV）、PVX、PVY等在內(nèi)至少30種病毒的外殼蛋白基因，并成功地轉(zhuǎn)至煙草、番茄、大豆、馬鈴薯等作物［75］。反義 RNA 是指能與m RNA堿基互補(bǔ)配對(duì)的單鏈RNA，反義鏈RNA與其相應(yīng)的m RNA互補(bǔ)，可使該基因的表達(dá)受到抑制。利用反義RNA作為抗病毒基因工程的策略有待于進(jìn)一步完善［76］。另一策略是利用非病毒來(lái)源的基因如植物中自然存在的抗性基因，來(lái)獲得抗病毒植物。目前，用于植物抗病毒基因工程的非病毒來(lái)源的基因包括：植物、微生物的核糖體失活蛋白基因、α，β干擾素基因、PR蛋白基因、潛在自殺基因［77］。在基因工程這些方法中，利用病毒外殼蛋白基因獲得的轉(zhuǎn)基因植株，其獲得抗性效果最好，但一般只能延遲一年病害的發(fā)生，其他方法的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

2.7 其他脫毒方法

除了上述脫毒方法，在實(shí)際生產(chǎn)中還常常用到嫁接脫毒法。嫁接脫毒法是將莖尖嫁接于無(wú)毒砧木上培養(yǎng)，可獲得無(wú)病毒植株，縮短育苗周期，保持母本的優(yōu)良性狀。莖尖嫁接技術(shù)是目前在柑橘苗木繁育中應(yīng)用最廣的脫毒技術(shù)。莖尖嫁接成活率與砧木、接穗和莖尖大小等多種因素相關(guān)，在實(shí)際操作中可根據(jù)脫毒品種的具體情況進(jìn)行選擇［78］。另外，也有研究者采用變溫、二氧化碳處理與組培結(jié)合脫毒法，具體操作是在變溫處理和組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上結(jié)合高濃度二氧化碳和高溫短期處理的方法脫去病毒，在葡萄上已初見(jiàn)成效［79］。

3 展望

目前，針對(duì)病毒的檢測(cè)技術(shù)有生物學(xué)檢測(cè)方法、電子顯微觀察法、血清學(xué)方法、分子生物學(xué)檢測(cè)，但實(shí)際對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，一般采用多種方法，使得到的結(jié)果更為準(zhǔn)確、可靠。血清學(xué)方法常和其他學(xué)科相結(jié)合、生物測(cè)定與電鏡診斷結(jié)合，廣泛地應(yīng)用于病毒的檢測(cè)中以提高檢測(cè)效率、檢測(cè)靈敏度。植物病毒病檢測(cè)技術(shù)正在向著快速、高敏感性、高特異性和高通量并行性及自動(dòng)化的方向發(fā)展。

對(duì)多種植物脫毒方法研究發(fā)現(xiàn)，只采用莖尖脫毒不能完全除去侵染的復(fù)合病毒，一般可同時(shí)采用兩種或兩種以上的脫毒方法，達(dá)到較好的脫毒效果。其中，在采用莖尖脫毒法脫除病毒時(shí)，要注意切取莖尖的大小、時(shí)間、形態(tài)。對(duì)于熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒法，可多采取變溫的方法進(jìn)行脫毒。由于化學(xué)藥劑的選擇范圍廣，對(duì)不同植物脫毒效果不同，且目前研究的報(bào)道較少，所以化學(xué)脫毒法還有待進(jìn)一步的研究。傳統(tǒng)的防治方法都具有其局限性，隨著基因工程的發(fā)展，生物技術(shù)在植物病理學(xué)上得到應(yīng)用，為防治植物病毒開(kāi)辟了新途徑。在基因工程脫毒法中，可選擇多種抗性基因控制病毒或病毒復(fù)合侵染，制定抗病毒介體基因與抗病毒基因結(jié)合策略，更大程度的增加植物對(duì)病毒的抗性，減少病害的發(fā)生。在脫毒的過(guò)程中，需要考慮植物自身的性質(zhì)與病毒的特質(zhì)，這樣既不影響植物自身的生長(zhǎng)，又能得到較高的脫毒率。

［1］朱述運(yùn), 王春梅, 陳浩. 抗植物病毒天然化合物研究進(jìn)展［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2006, 22（1）：86-90.

［2］謝聯(lián)輝. 病原植物病毒學(xué)［M］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2007.

［3］許傳俊, 黃珺梅, 曾碧玉, 等. 植物組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39（3）：1318 -1320.

［4］Scholthof KBG, Adkins S, Czosnek H, et al. Top 10 plant viruses in molecular plant pathology［J］. Molecular Plant Pathology, 2011, 12（9）：938-954.

［5］Syller J. Biological and molecular events associated with simultaneous transmission of plant viruses by invertebrate and fungal vectors［J］. Molecular Plant Pathology, 2014, 15（4）：417- 426.

［6］胡淑霞. 論植物病毒的傳毒介體及傳播方式［J］. 生物學(xué)雜志, 1997, 14（5）：33-34.

［7］Du PV, Cabunagan RC, Cabauatan PQ. Yellowing syndrome of rice：etiology, current status, and future challenges［J］. Omonrice, 2007, 15：94-101.

［8］Chen HY, Chen Q, Omura T, et al. Sequential infection of rice dwarf virus in the internal organs of its insect vector after ingestion of virus［J］. Virus Research, 2001, 160（1-2）：389-394.

［9］Czosnek H, Ghanim M, et al. Whiteflies：vectors, and victims（?）,of geminiviruses［J］. Adv Virus Res, 2001, 56：291-332.

［10］ 洪健, 徐穎, 周雪平, 等. 植物病毒胞間運(yùn)動(dòng)的超微結(jié)構(gòu)研究［C］.中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第八屆會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集. 上海：中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì), 2003.

［11］李軍, 高廣春, 李白, 等. 植物組培脫毒技術(shù)及其在藥用植物藏紅花中的應(yīng)用［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2014（7）：44-48.

［12］謝禮, 呂明芳, 董峰麗, 等. 藏紅花病毒病原的分子鑒定［J］.中草藥, 2013, 44（8）：1033-1036.

［13］尤燕平, 彭詩(shī)怡, 朱文瑩, 等. 莖尖培養(yǎng)法脫除菊花B病毒的研究［J］. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 36（5）：144-148.

［14］劉輝輝. 杭白菊病毒病原鑒定及脫毒苗生物學(xué)性狀與品質(zhì)性狀分析［D］. 杭州：浙江大學(xué), 2015.

［15］Verma N, Sharma A, Ram R, et al. Detection, identification and incidence of Chrysanthemum B carlavirus in chrysanthemum in India［J］. Crop Prot, 2003, 22（2）：425-429.

［16］王國(guó)平, 洪霓, 張尊平, 等. 梨樹病毒田間指示植物鑒定初報(bào)［J］. 中國(guó)果樹, 1993（1）：15-18.

［17］ 吳凌娟, 張雅奎, 等. 用指示植物分離鑒定馬鈴薯輕花葉病毒（PVX）的技術(shù)［J］. 中國(guó)馬鈴薯, 2003, 17（2）：82-83.

［18］ 李春敏. 利用指示植物檢測(cè)核果壞死環(huán)斑病毒［J］. 河北果樹, 2003（4）：14-15.

［19］ 王國(guó)平, 王煥玉, 張尊平, 等. 幾種木本指示植物對(duì)蘋果潛隱病毒敏感性的研究［J］. 北方果樹, 1992（2）：8-9.

［20］ 吳雅琴, 章德明. 用離體微嫁接法快速檢測(cè)蘋果潛隱病毒［J］.落葉果樹, 2001（2）：4-6.

［21］ Kausche GA, Pfankuch E, Ruska H. Die Sichtbarmachung von pflanzlichem Virus im übermikroskop［J］. Naturwissenschaften, 1939, 27：292-299.

［22］ 韋石泉, 徐慧民. 應(yīng)用負(fù)染色技術(shù)電鏡觀察快速檢測(cè)植物病毒粒子的研究［J］. 微生物學(xué)雜志, 1985, 5（4）：7-10.

［23］ 謝禮, 劉文洪, 洪健, 等. 復(fù)合侵染的蠶豆黃花葉病毒病原診斷［J］. 電子顯微學(xué)報(bào), 2006, 25：167-171.

［24］ 朱文釧, 孔繁德, 林祥梅, 等. 免疫膠體金技術(shù)的應(yīng)用及展望［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2010（4）：80-87.

［25］ 李紅葉, 洪健, 周雪平, 等. 葡萄扇葉病毒引起的寄主細(xì)胞病變研究［J］. 植物病理學(xué)報(bào), 2002, 32（26）：65-70.

［26］洪健, 徐穎, 等. 蕪菁花葉病毒（TuMV）侵染對(duì)寄主植物光合作用的影響［J］. 電子顯微學(xué)報(bào), 2002,（2）：110-113.

［27］張成良, 張作芳, 胡偉貞, 等. 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)豆類種傳病毒的研究［J］. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 1982, 9（1）：9-14.

［28］周雪平, 璞祖芹. 應(yīng)用斑點(diǎn)法檢測(cè)植物病毒的研究［J］. 病毒學(xué)雜志, 1990, 3：317-321.

［29］Hibi T, Saito Y. A Dot Immunobinding assay for the detection of tobacco mosaic virus in infected tissues［J］. Journal of General Virology, 1985, 66：1191-1194.

［30］鄭光宇, Wiehai K, David J. 應(yīng)用斑點(diǎn)免疫結(jié)合法檢測(cè)植物病毒［J］. 病毒學(xué)報(bào), 1988, 4（2）：150-156.

［31］ Xie Y, Jiao XY, Zhou XP, et al. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies［J］. Virol J, 2013, 10：142-151.

［32］陳繼峰, 李紹華. 血清學(xué)病毒檢測(cè)方法在果樹上的應(yīng)用［J］.北方果樹, 2004（6）：1-4.

［33］Noorani MS, Awasthi P, Shanma MP, et al. Simultaneous detection and identification of four cherry viruses by two step multiplex RTPCR with an internal control of plant nad5 mRNA［J］. Journal of Virological Methods, 2013, 193：103-107.

［34］郭立新, 向本春, 段維軍, 等. 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR一步法檢測(cè)蘋果莖溝病毒［J］. 植物病理學(xué)報(bào), 2006, 36（1）：57-61.

［35］陳紅霞, 邵建柱, 孫建設(shè), 等. 兩步多重RT-PCR快速檢測(cè)蘋果潛隱性病毒［J］. 果樹學(xué)報(bào), 2012, 29（4）：695-701.

［36］高雅紅, 王進(jìn)忠, 等. 李痘病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立［J］. 生物技術(shù)通訊, 2011, 22（1）：77-80.

［37］陳定虎, 鄧叢良, 楊雷亮, 等. 運(yùn)用納米磁珠技術(shù)結(jié)合RTPCR方法檢測(cè)李痘病毒［J］. 植物檢疫, 2010（3）：17-19.

［38］李健, 熊煒, 方雪恩, 等. 豬瘟病毒RT-LAMP 檢測(cè)方法的建立［J］. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué), 2010, 40（10））：1033-1038.

［39］張?chǎng)┠? 李晉玉, 田金艷, 等. 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)大豆花葉病毒［J］. 大豆科學(xué), 2014（3）：422-428.

［40］丁小蘭, 趙竹, 馬占鴻, 等. 馬鈴薯帚頂病毒RT-LAMP檢測(cè)方法的建立［J］. 植物檢疫, 2014, 28（5）：59-64.

［41］Morel G, Martin C. Guérison de dahlias atteints d’une maladieá virus［J］. C R Hebd Seances Acad Sci, 1952, 235：1324-1325.

［42］Miller PW, Belkengren RO. Elimination of yellow edge, crinkle, and vein banding viruses and certain other virus complexes from strawberries by excision and culturing of apical meristems［J］. Plant Disease Reporter, 1963, 47（2）：298-300.

［43］ 毛碧增, 李德葆. 草莓脫病毒法：中國(guó), ZL200510062199. 1［P］. 2005-10-06.

［44］ 高慧卿, 樊蘭瑛, 王秀紅, 等. 莖尖培養(yǎng)及熱處理技術(shù)在百合脫毒中的應(yīng)用研究［J］. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2010, 30（6）：529-532.

［45］Kawarabayashi W, Asahira T. In vitro Multiplication of virus- free bulbs of Lilies［J］. Japan Soc Hort Sci, 1989, 58：195-209.

［46］平培元, 葛勝娟, 徐美玲, 等. 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)杭白菊根芽誘導(dǎo)的影響［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2003, 39（6）：619-623.

［47］何歡樂(lè), 蔡潤(rùn), 潘俊松, 等. 草莓莖尖培養(yǎng)脫毒效果研究［J］.北方園藝, 2005（5）：79-81.

［48］ 何新民, 蔣菁, 唐洲萍, 等. 甘薯莖尖培養(yǎng)與脫毒技術(shù)研究［J］.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 40（8）：964-968.

［49］ 黃遠(yuǎn)新, 張凱, 趙勇, 等. 葉原基形態(tài)對(duì)甘薯莖尖脫毒培養(yǎng)的影響［J］. 西南大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 36（1）：18-23.

［50］趙軍良. 植物莖尖培養(yǎng)與無(wú)毒種苗生產(chǎn)［J］. 北方園藝, 1995（6）：10- 11.

［51］孫秀梅. 馬鈴薯莖尖剝離脫毒效果的影響因素分析［J］. 中國(guó)馬鈴薯, 2005, 19（4）：42-45.

［52］楊家書, 劉丹紅, 俞孕珍, 等. 唐菖蒲病毒的研究［J］. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1995, 26（4）：342-347.

［53］董雅鳳, 張尊平, 張少瑜, 等. 蘋果和梨樹莖尖培養(yǎng)結(jié)合熱處理脫病毒研究［J］. 北方果樹, 2002（2）：9-11.

［54］Previati J, Alberto M, et al. In vitro production of virus-free chrysanthemum stock plants for cut flowers［J］. Jordan Journal of Biological Sciences, 2010, 3（3）：101-110.

［55］王莉, 王際軒, 楊艷敏, 等. 草莓脫病毒技術(shù)的研究與應(yīng)用淺析［J］. 落葉果樹, 2012, 44（3）：20-22.

［56］ 趙霜. 菊花病毒脫除與檢測(cè)技術(shù)研究［D］. 北京：北京林業(yè)大學(xué), 2013.

［57］ 晏娜. 化學(xué)處理和熱處理脫除蘋果潛隱病毒的研究［D］. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

［58］ 孫琦, 張春慶. 植物脫毒與檢測(cè)研究進(jìn)展［J］. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2003, 34（2）：307-310.

［59］劉衛(wèi)平, 李玉華, 孫秀梅. 馬鈴薯離體莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)對(duì)幾種培養(yǎng)因子的生長(zhǎng)反應(yīng)［J］. 中國(guó)馬鈴薯, 2001（2）：81-82.

［60］謝嘉華, 袁建軍. 中國(guó)水仙（Narcissutazetta var. Chinese）的組織培養(yǎng)［J］. 生物學(xué)雜志, 2002, 19（3）：30-34.

［61］Sharmas S, Singh B, Rani G, et al. Production of indian citrus ringspot virus free plants of kinnow employing chemotherapy coupled with shoot tip grafting［J］. Journal of Central European Agriculture, 2007, 8（1）：1-8.

［62］唐敏. 運(yùn)用超低溫技術(shù)脫除梨離體植株潛隱病毒研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

［63］ Brison M, et al. Effect of cryopreservation on the sanitary state of a cv Prunus rootstock experimentally contaminated with Plum Pox Potyvirus［J］. Plant Science, 1997, 123：189-196.

［64］王壯偉. 蘋果潛隱性病毒的檢測(cè)與脫除技術(shù)研究［D］. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2003.

［65］白建明, 陳曉玲, 等. 超低溫保存法去除馬鈴薯X病毒和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒［J］. 分子植物育種, 2010（3）：12-15.

［66］符國(guó)芳, 李青. 植物組織培養(yǎng)脫毒方法綜述［J］. 福建林業(yè)科技, 2007, 34（3）：255-258.

［67］許莉萍, 陳如凱, 李躍平. 利用愈傷組織培養(yǎng)和莖尖培養(yǎng)去除甘蔗花葉病毒［J］. 福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 1994, 23（3）：253-256.

［68］覃蘭英, 鄧世秀, 李青. 培育草毒脫毒苗方法的研究［J］. 園藝學(xué)報(bào), 1988, 15（3）：175-179.

［69］曹有龍, 等. 枸杞脫毒苗的誘導(dǎo)及光合特性的分析研究［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2001, 38（4）：550- 553.

［70］孟志卿. 草莓花藥組織培養(yǎng)脫毒快繁技術(shù)研究［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36（2）：440- 441.

［71］高慶玉, 李光裕, 周恩. 關(guān)于草莓脫毒技術(shù)的研究［J］. 東北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 1993（3）：231-236.

［72］李紅葉, 等. 柑橘病毒與類似病毒分子生物學(xué)和抗病育種基因工程研究進(jìn)展［J］. 果樹科學(xué), 2002, 17（2）：131-137.

［73］Abel PP, Nelson RS, De B, et al. Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene［J］. Science, 1986, 232（4751）：738-743.

［74］Gargouri-Bouzid R, Jaoua L, Mansour RB, et al. PVY resistant transgenic potato plants（cv. Claustar）expressing the viral coat protein［J］. Journal of Plant Biotechnology, 2005, 3：143-148.

［75］ 田桂英. 植物抗病毒的基因工程［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 1995（5）：3-6.

［76］馬麗, 周玉亮, 張春慶. 植物抗病毒基因工程研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào), 2006（3）：14-19.

［77］ 劉佳, 吳忠義, 張秀海, 等. 植物抗病毒基因工程研究進(jìn)展［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2009, 25（1）：30-38.

［78］劉科宏, 周彥, 李中安. 柑橘莖尖嫁接脫毒技術(shù)研究進(jìn)展［J］.園藝學(xué)報(bào), 2016, 43（9）：1665-1674.

［79］楊俊玲, 侯義龍, 李雄. 果樹脫毒及病毒檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)水土保持, 2004（3）：17-19.

（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Research Advances on Plant Virus Detection and Virus-elimination Methods

CHI Hui-rong MAO Bi-zeng
（College of Agriculture & Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou 310058）

Virus is known as one of the smallest creatures in nature，its morphology and size can only be observed and identified by electron microscopy enlarging it by tens of thousands or even hundreds of thousands of times. The virus is strictly parasitic so that its growth and reproduction depend on the host cell. Plant viruses are an important part of the virus family. The plant virus disease，which affects the growth and development of plants and decreases the yield and quality，is increasingly serious year by year. Due to the numerous varieties of viruses and complex damage mechanisms，it is difficult to prevent and control the viral diseases. This article reviews the major methods of detecting plant virus as well as the technologies of virus-elimination and its application in recent years. Further，the article discusses the issues which need to be paid attention to in the virus-elimination. Finally，the article forecasts the future research direction for providing references and theoretical basis for further study.

plant virus；plant disease detection；virus-elimination method

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0253

2017-03-31

浙江省農(nóng)業(yè)中藥材新品種選育重大科技專項(xiàng)（2016C02058）

遲惠榮，女，碩士研究生，研究方向：植物病理學(xué)；E-mail：21616114@zju.edu.cn

毛碧增，女，博士，研究員，研究方向：中藥材品種選育與品質(zhì)改良；E-mail：maobz@zju.edu.cn