蘇安梅， 鐘青梅， 余姝軼， 覃 秀， 王益林

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 廣西生物煉制重點實驗室， 廣西 南寧 530004)

碳量子點熒光猝滅法測定飲料中日落黃

蘇安梅， 鐘青梅， 余姝軼， 覃 秀， 王益林*

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 廣西生物煉制重點實驗室， 廣西 南寧 530004)

以檸檬酸為碳源制備碳量子點(CQDs)，所得碳量子點被394 nm的光激發(fā)后在484 nm處有較強的熒光發(fā)射，最大吸收波長為482 nm的日落黃能強烈猝滅碳量子點的熒光?；谠摤F(xiàn)象，發(fā)展了一種以碳量子點為熒光探針測定日落黃的分析方法，并探討了熒光猝滅機理。在選定的實驗條件下，該分析方法的線性檢測范圍為0.1～100 μmol/L，檢出限(3σ/k)為0.051 μmol/L。

碳量子點； 熒光猝滅； 日落黃

1 引 言

食用色素是食品添加劑成員之一，包括天然色素和合成色素兩大類。與天然色素相比，合成色素具有性質(zhì)穩(wěn)定、著色力強及價格低廉等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。但合成色素對人類健康存有潛在危害，世界各國對合成色素的使用種類、使用范圍及用量均進行了嚴格的規(guī)定，我國也不例外。日落黃是常用的食用合成色素之一，過量食用會引起過敏、腹瀉等癥狀，嚴重時甚至?xí)鸶螕p傷與腎衰竭。為確保食品安全，對生產(chǎn)、加工過程中日落黃的監(jiān)測及產(chǎn)品中日落黃的含量進行定量測定具有重要意義。

國家標準方法(GB/T5009.35-2003)對食品中日落黃含量的檢測采用的是高效液相色譜法和薄層色譜法。此外，檢測食品中日落黃的其他方法還有毛細管電泳法[1]、酶聯(lián)免疫分析法[2]、分光光度法[3]及電化學(xué)法[4]等。在眾多分析方法中，采用熒光法測定日落黃的研究比較少見[5-6]。碳量子點是一種新型熒光探針，已廣泛應(yīng)用于化學(xué)分析[7-8]和生物傳感[9-10]等研究領(lǐng)域。本文制備了發(fā)射光譜與日落黃吸收光譜重疊的碳量子點，建立了一種基于碳量子點熒光猝滅測定飲料中日落黃含量的新方法。

2 實 驗

2.1 主要試劑

檸檬酸(99.0%，廣州化學(xué)試劑廠)；日落黃(87%，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司)；檸檬黃(85%，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司)；抗壞血酸(分析純，廣東光華科技股份有限公司)；六偏磷酸鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀(分析純，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司)；麥芽糖、乳糖、葡萄糖、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)。佳得樂和健力寶飲料購自南寧市某超市。

2.2 實驗步驟

2.2.1 碳量子點的制備

碳量子點的制備按照文獻[11]方法進行：將裝有5.0 g檸檬酸的燒杯置于已升溫到200 ℃的恒溫干燥箱中加熱30 min，取出后用1 mol/L的NaOH溶液將其pH值調(diào)至7.0，然后轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶中并定容。

2.2.2 日落黃的測定

在系列25 mL比色管中依次加入2.0 mL碳量子點溶液、15.0 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH=8.0)和不同體積的日落黃標準溶液(濃度為500 μmol/L)，用二次去離子水定容到刻度后充分混勻。取適量溶液于比色皿中，用RF-5301型熒光分光光度計測熒光強度(I)，同時做日落黃試劑空白，熒光強度值記為I0。測定時，激發(fā)波長選用394 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫分別設(shè)置為10.0 nm和5.0 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 pH值對碳量子點熒光強度的影響

在系列25 mL比色管中各加入2.0 mL碳量子點溶液、15.0 mL不同pH值的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，然后用去離子水定容到刻度，以考察碳量子點在不同pH環(huán)境下的熒光發(fā)射特性。圖1表明，體系的pH值對碳量子點的熒光強度有強烈的影響。pH=3時，碳量子點的熒光較弱；隨著pH的升高，熒光迅速增強；當pH>7.0時，熒光強度值趨于穩(wěn)定。

圖1 緩沖液pH值對碳量子點熒光光譜的影響

Fig.1 Influence of buffer pH values on the fluorescence spectra of CQDs

3.2 日落黃對碳量子點熒光的選擇性猝滅

分別取2.0 mL 碳量子點加入到相同濃度(100 μmol/ L)的下列物質(zhì)溶液中：日落黃(SY)、六偏磷酸鉀(SHMP)、山梨酸鉀(Potassium sorbate)、苯甲酸鈉(Sodium benzoate)、檸檬酸(CA)、蔗糖(Sucrose)、乳糖(Lactose)、葡萄糖(Glc)、檸檬酸鈉(Na-Citrate)、麥芽糖(Maltose)、維生素C(VC)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氯化鉀(KCl)，并用pH=8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容到25 mL刻度，分別測定這些溶液的熒光強度，以考

圖2 碳量子點在不同物質(zhì)溶液中的相對熒光強度,各物質(zhì)的濃度均為100 μmol/L。

Fig.2 Relative fluorescence intensity of CQDs in different species, the concentration of species are all 100 μmol/L.察不同物質(zhì)對碳量子點熒光光譜的影響。結(jié)果如圖2所示。圖2數(shù)據(jù)表明，日落黃能有效猝滅碳量子點的熒光，而其他物質(zhì)則幾乎沒有響應(yīng)。進一步研究表明，日落黃對碳量子點的熒光猝滅程度隨濃度的升高而增強(圖3)。日落黃可以猝滅碳量子點熒光的實驗事實表明，以碳量子點為熒光探針對溶液中日落黃進行定量測定是可行的。

圖3 日落黃濃度對碳量子點熒光光譜的影響,從上到下日落黃濃度依次為0,10，30，50 μmol/L。

Fig.3 Fluorescence spectra of CQDs in the presence of sunset yellow. From top to bottom, the concentrations of sunset yellow are 0, 10, 30, 50 μmol/L, respectively.

3.3 日落黃的測定

3.3.1 測定條件的選擇

與文獻[12]報道一樣，本文制備的碳量子點的熒光發(fā)射波長也隨激發(fā)波長的變化而變化。我們認為產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能與碳量子點的粒度分布比較寬有關(guān)。一定波長的光激發(fā)一定粒度的碳量子點發(fā)射一定波長的熒光。光譜測量表明，本實驗制備的碳量子點在394 nm光的激發(fā)下具有最強的熒光發(fā)射，熒光光譜的最強發(fā)射峰位于484 nm處，而日落黃的最大激發(fā)波長是303 nm，在394 nm光的激發(fā)下沒有熒光(圖4)。因此，本實驗所用激發(fā)光波長為394 nm。

圖5為碳量子點及碳量子點-日落黃體系在不同pH條件下的熒光強度。可以看出，二者的熒光強度都隨pH值的升高而上升，最后保持穩(wěn)定不變。當pH值在7.0～8.0范圍內(nèi)時，量子點熒光猝滅程度最大。本文選擇在pH=8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中進行實驗。

圖6是碳量子點及碳量子點-日落黃體系在不同時間間隔下的熒光強度。數(shù)據(jù)表明，在碳量子點溶液中加入日落黃后會立即引起熒光猝滅，在60min內(nèi)，體系的熒光強度非常穩(wěn)定。本文選擇在60 min內(nèi)完成全部測試。

圖4 在394 nm激發(fā)下，碳量子點(CQDs)和日落黃(SY)的熒光光譜。

Fig.4 Fluorescence spectra of CQDs and SY solution under 394 nm excitation

圖5 不同pH值條件下添加與未添加日落黃時的碳量子點的熒光響應(yīng)

Fig.5 Fluorescence responses of CQDs in the absence and presence of sunset yellow at different pH values

圖6 pH=8.0、日落黃濃度為10 μmol/L時，不同反應(yīng)時間下的碳量子點的熒光響應(yīng)。

Fig.6 Fluorescence responses of CQDs in 10 μmol/L SY solution with pH=8.0 at different reaction time

當體系的熒光強度很高時，少量日落黃的加入使熒光的猝滅程度很小，分析的靈敏度低；當體系的熒光較弱時，少量日落黃的加入使熒光的猝滅程度較大，靈敏度高，但線性范圍窄[13]。為兼顧線性和范圍靈敏度，本文選擇在25 mL比色管中加2.0 mL碳量子點，定容到刻度后進行熒光測定。

3.3.2 共存物的影響

在選定的實驗條件下，考察了多種共存物對10 μmol/L日落黃測定結(jié)果的影響。當相對誤差在±5%范圍內(nèi)時，允許的共存物倍數(shù)為：500倍的蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖；300倍的甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、賴氨酸、蘇氨酸；5倍的檸檬黃。數(shù)據(jù)表明，該方法具有較好的選擇性。

3.3.3 方法的線性范圍、檢出限和精密度

根據(jù)實驗方法，測定了碳量子點在不同濃度日落黃溶液中的熒光光譜。在選定的實驗條件下，日落黃濃度在0.1～100 μmol/L范圍內(nèi)與體系相對熒光強度的對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系(圖7)。線性回歸方程為log(I0/I) =9.1×10-3C+0.056 (C為日落黃的濃度，單位：μmol/L)，相關(guān)系數(shù)為0.993，方法檢出限(3σ/k)為0.051 μmol/L。對含10 μmol/L 日落黃的溶液連續(xù)測定5次，測定結(jié)果的相對標準偏差為3.6%，說明該方法的靈敏度和精密度較高。

a～q：C(sunset yellow)=0, 0.1, 0.2, 0.3, 1, 4, 10, 14, 16, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 100 μmol/L

圖7 日落黃濃度對碳量子點熒光光譜的影響。插圖： Log(I0/I)與日落黃的濃度在0.1～100 μmol/L范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。

Fig.7 Fluorescence response of various concentrations of sunset yellow in pH=8 buffer solution. Inset shows the linear relationship between log(I0/I) and sunset yellow concentration within the range of 0.1-100 μmol/L, pH=8.0.

3.3.4 分析應(yīng)用

將市售的液體飲料樣品通N2除去其中的CO2，分別取1.0 mL置于已加入2.0 mL碳量子點溶液的比色管中，用緩沖溶液(pH=8.0)定容到25 mL刻度后測其熒光強度。同時按實驗方法做工作曲線，根據(jù)工作曲線求得各試液中日落黃的濃度，并進一步計算出在樣品中的含量，所得結(jié)果見表1。數(shù)據(jù)表明，所測飲料中日落黃的含量低于0.1 g/kg，符合食品添加劑衛(wèi)生標準(GB2760- 2011)。在所測樣品中分別加入不同濃度的日落黃標準溶液，進行加標回收率實驗。表1數(shù)據(jù)表明，平均回收率在98.5%～103%之間，說明該方法的準確度很高。

表1 飲料中日落黃的測定結(jié)果

3.4 碳量子點熒光猝滅機理探討

熒光猝滅可通過電荷轉(zhuǎn)移或能量轉(zhuǎn)移等多種方式進行。電荷轉(zhuǎn)移猝滅是猝滅劑與熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移而引起的，能量轉(zhuǎn)移猝滅是熒光分子(供體)所發(fā)射的熒光被猝滅劑(受體)吸收而引起的。只有當供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜重疊時才能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移猝滅[14]。本實驗所用碳量子點在394 nm光激發(fā)下的最大發(fā)射波長為484 nm，而日落黃的最大吸收波長位于482 nm處，二者的光譜有很大部分重疊(圖8)。因此，我們認為碳量子點的熒光猝滅是因能量轉(zhuǎn)移所致。

圖8 日落黃(SY)吸收光譜與碳量子點發(fā)射光譜的重疊

Fig.8 Overlap of absorption spectra of sunset yellow and fluorescence spectra of carbon quantum dots

4 結(jié) 論

以檸檬酸為碳源制備了水溶性碳量子點?；谔剂孔狱c發(fā)射光譜與日落黃吸收光譜相重疊而發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的原理，發(fā)展了一種碳量子點熒光猝滅測定日落黃含量的分析方法并應(yīng)用于飲料樣品的測定，測定結(jié)果令人滿意。本研究既拓展了碳量子點的應(yīng)用范圍，又為日落黃的測定提供了一種新方法，其準確度、精密度能滿足飲料中日落黃色素測定的要求。

[1] LI Y, XUE F, WANG Y,etal.. Simultaneous determination of seven adulterants in functional foods by high-performance capillary electrophoresis [J].Chin.J.Anal.Chem., 2011, 39(11):1716-1720.

[2] XING Y, MENG M, XUE H Y,etal.. Development of a polyclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of Sunset Yellow FCF in food samples [J].Talanta, 2012, 99:125-131.

[3] EL-SHAHAWI M S, HAMZA A, AL-SIBAAI A A,etal.. A new method for analysis of sunset yellow in food samples based on cloud point extraction prior to spectrophotometric determination [J].J.Ind.Eng.Chem, 2013, 19(2):529-535.

[4] WANG J, YANG B B, WANG H W,etal.. Highly sensitive electrochemical determination of Sunset Yellow based on gold nanoparticles/graphene electrode [J].Anal.Chim.Acta, 2015, 893:41-48.

[5] 劉宇, 謝志海, 蔡清, 等. 熒光光譜法測定飲料中的日落黃 [J]. 分析科學(xué)學(xué)報, 2012, 28(4):535-538. LIU Y, XIE Z H, CAI Q,etal.. Determination of sunset yellow in beverage by fluorescence spectroscopy [J].J.Anal.Sci., 2012, 28(4):535-538. (in Chinese)

[6] YUAN Y S, ZHAO X, QIAO M,etal.. Determination of sunset yellow in soft drinks based on fluorescence quenching of carbon dots [J].Spectrochim.ActaA:Mol.Biomol.Spectrosc., 2016, 167:106-110.

[7] HAMISHEHKAR H, GHASEMZADEH B, NASERI A,etal.. Carbon dots preparation as a fluorescent sensing platform for highly efficient detection of Fe(Ⅲ) ions in biological systems [J].Spectrochim.ActaA:Mol.Biomol.Spectrosc., 2015, 150:934-939.

[8] ZHAO J J, ZHAO L M, LAN C Q,etal.. Graphene quantum dots as effective probes for label-free fluorescence detection of dopamine [J].Sens.ActuatorB:Chem., 2016, 223:246-251.

[9] 馬紅燕, 王艷妮. 石墨烯量子點熒光探針測定腎上腺色腙 [J]. 發(fā)光學(xué)報, 2016, 37(2):230-236. MA H Y, WANG Y N. Detection of carbazochrome by graphene quantum dot fluorescence probe [J].Chin.J.Lumin., 2016, 37(2):230-236. (in Chinese)

[10] WANG G L, FANG X, WU X M,etal.. Label-free and ratiometric detection of nuclei acids based on graphene quantum dots utilizing cascade amplification by nicking endonuclease and catalytic G-quadruplex DNAzyme [J].Biosens.Bioelectron., 2016, 81:214-220.

[11] DONG Y Q, SHAO J W, CHEN C Q,etal.. Blue luminescent graphene quantum dots and graphene oxide prepared by tuning the carbonization degree of citric acid [J].Carbon, 2012, 50(12):4738-4743.

[12] LU L Q, ZHU Y C, SHI C,etal.. Large-scale synthesis of defect-selective graphene quantum dots by ultrasonic-assisted liquid-phase exfoliation [J].Carbon, 2016, 109:373-383.

[13] 王柯敏, 王益林, 李朝輝, 等. CdTe量子點熒光猝滅法測定銅離子的研究 [J]. 湖南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2005, 32(3):1-5. WANG K M, WANG Y L, LI Z H,etal.. Studies on fluorescence quenching method for the determination of copper ions with CdTe quantum dots [J].J.HunanUniv. (Nat.Sci.), 2005, 32(3):1-5. (in Chinese)

[14] POON C Y, LI Q H, ZHANG J L,etal.. FRET-based modified graphene quantum dots for direct trypsin quantification in urine [J].Anal.Chim.Acta, 2016, 917:64-70.

蘇安梅(1992-)，女，廣西百色人，碩士研究生，2015年于廣西大學(xué)獲得學(xué)士學(xué)位，主要從事量子點熒光材料的合成與應(yīng)用的研究。

E-mail: 962240842@qq.com 王益林(1968-)，男，湖南邵陽人，博士，副教授，2010年于廣西大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事量子點熒光材料的合成與應(yīng)用的研究。

E-mail: theanalyst@163.com

Fluorescence Quenching Method for Determination of Sunset Yellow in Drinks with Carbon Quantum Dots

SU An-mei, ZHONG Qing-mei, YU Shu-yi, QIN Xiu, WANG Yi-lin*

(GuangxiKeyLaboratoryofBiorefinery,SchoolofChemistryandChemicalEngineering,GuangxiUniversity,Nanning530004,China)*CorrespondingAuthor,E-mail:theanalyst@163.com

Water-soluble carbon quantum dots (CQDs) were prepared by using citric acid as carbon source. The obtained CQDs showed a strong emission at the wavelength of 484 nm, with an optimum excitation of 394 nm. Sunset yellow with maximum absorption wavelength at 482 nm could selectively quench the fluorescence of CQDs. Based on this principle, a fluorescent probe was developed for sunset yellow determination. Furthermore, the quenching mechanism of the CQDs was elucidated. A linear relationship was found in the range of 0.1-100 μmol/L sunset yellow with the detection limit (3σ/k) of 0.051 μmol/L. Satisfactory results were achieved when the method was submitted to the determination of sunset yellow in liquid samples.

carbon quantum dots; fluorescence quenching; sunset yellow

1000-7032(2017)04-0530-05

2016-10-27；

2016-11-24

廣西自然科學(xué)基金(2014GXNSFAA118328)； 廣西生物煉制重點實驗室開放基金(GXKLB-2)； 廣西大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃(201610593162)資助項目 Supported by Natural Science Foundation of Guangxi Province(2014GXNSFAA118328); Open Fund of Key Laboratory of Biorefinery of Guangxi(GXKLB-2); Innovation and Entrepreneurship Training Program of Guangxi University(201610593162)

O611.4

A

10.3788/fgxb20173804.0530