楊 丹 王 哲 李心慰 杜希良

(1.吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林長春 130062；2.天津市動物疫病預防控制中心，天津 300402)

圍產(chǎn)期酮病奶牛與健康奶牛相關氧化狀態(tài)分析比較

楊 丹1，2王 哲1*李心慰1杜希良1

(1.吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林長春 130062；2.天津市動物疫病預防控制中心，天津 300402)

奶牛酮病是處于圍產(chǎn)期奶牛機體內(nèi)碳水化合物以及脂肪無法正常代謝并使能量達到負平衡狀態(tài)逐漸演變而成的營養(yǎng)代謝失調(diào)性常見多發(fā)病，本文通過相關實驗對酮病奶牛與健康奶牛氧化狀態(tài)進行分析比較，為深入研究氧化應激的相關性奠定基礎。

圍產(chǎn)期 酮病奶牛 健康奶牛 氧化狀態(tài)

隨著我國畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，奶牛存欄量逐年提高，隨之出現(xiàn)的營養(yǎng)代謝性疾病也越來越多，奶牛酮病即為其中一種。奶牛酮病是處于圍產(chǎn)期奶牛機體內(nèi)碳水化合物以及脂肪無法正常代謝并使能量達到負平衡狀態(tài)逐漸演變而成的營養(yǎng)代謝失調(diào)性常見多發(fā)病，患牛表現(xiàn)出“三酮”（酮血、酮尿、酮乳）、“三低”（低血糖、消化能力降低、產(chǎn)乳量降低）癥狀[1]，而且神經(jīng)功能水平可能會有所降低。本病主要發(fā)生在產(chǎn)后剛開始泌乳或每天乳汁分泌量在30kg以上的母牛群體中[2]，多發(fā)生于泌乳性能良好的高產(chǎn)奶牛[3]，乳汁分泌消耗體內(nèi)能量，母牛需要補充的更多，而補充能量有兩種途徑，一種是加大食物攝入量，另一種是將體內(nèi)的脂肪轉換為能量。由于生產(chǎn)初期奶牛攝食量不能馬上恢復，過分依賴于第二種途徑，會使得肝臟無法進行正常的糖類以及脂肪代謝，引起血液里面酮體（β-羥丁酸、乙酰乙酸、丙酮）含量上升，進入到能量負平衡狀態(tài)，如果機體無法通過自身的功能糾正這種狀態(tài)，其體內(nèi)就會合成并釋放更多的酮體，最終患上酮病[4]。在健康機體體內(nèi)，活性氧的含量能夠保持在一定的平衡狀態(tài)，其合成和消耗基本相當，從而避免含量過高給機體造成毒害作用。不過患病后，這種平衡狀態(tài)會被打破，活性氧含量迅速提高，嚴重影響機體的健康。進入到圍產(chǎn)期的奶牛，代謝水平較高，存在生理性氧化應激的癥狀。而且，部分患上酮病的奶牛面臨病理性氧化應激的問題，導致器官受到氧化作用功能水平降低。為進一步弄清奶牛酮病與氧化應激的存在的相關性。本實驗隨機選取某牛場健康奶牛，臨床型酮病奶牛及亞臨床型酮病奶牛各10頭，給予相同飼料喂養(yǎng)，再對其血液進行一系列實驗，根據(jù)實驗結果進行酮病基本特征，生化特性，氧化狀態(tài)的相關分析。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

國內(nèi)某奶牛養(yǎng)殖場抽取圍產(chǎn)期奶牛樣本30頭，其中在泌乳初期呈健康狀態(tài)以及確診亞臨床型、臨床型酮病的奶牛分別10頭。

1.2 材料與方法

抽取血液進行分析。早晨飼喂前頸靜脈采血，肝素鈉抗凝，3000rpm離心5min，將血漿轉移到1.5ml離心管，-20℃保存。血漿樣品中葡萄糖（GLU）、非酯化脂肪酸（NEFA）、β-羥丁酸（BHBA）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、極低密度脂蛋白（VLDL）、高密度脂蛋白（HDL）、堿性磷酸酶（ALP）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、膽堿酯酶（CHE）、乳酸脫氫酶（LDH）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、Ca、Mg、P 生化試劑盒采用 Roche公司產(chǎn)品，由吉林大學第四附屬醫(yī)院 7170 型全自動生化分析儀（HITACHI）測定。在測量血液含有的丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（TAC）、黃嘌呤氧化酶（XOD）、過氧化氫（H2O2）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）等物質(zhì)含量以及抑制羥自由基能力時，用到上海江萊生物有限公司生產(chǎn)的試劑盒。

2 結果

表1三組奶牛胎次無顯著差異，和健康組對比來看，其他兩組樣本產(chǎn)奶量、體況得分明顯更低，組間對比具有顯著性差異。

Table 1 The basic description of the ketotic，subclinical ketotic and healthy dairy cows

表2血糖水平在臨床型和亞臨床型牛群血液中含量都顯著的下降，臨床型2.95±0.42mM比亞臨床型3.23±0.22mM更為明顯，NEFA及BHBA的值相對于健康奶牛，臨床型和亞臨床型則升高明顯。

Table2 Serum biochemical indices of ketotic，subclinical ketotic and non-ketotic cows

表3兩種轉氨酶（丙氨酸轉氨酶、谷草轉氨酶）的量在臨床型酮病奶牛中含量明顯高于亞臨床型酮病牛及健康牛，亞臨床酮病奶牛轉氨酶雖變化不顯著，但仍高于健康組。同時TC、HDL、VLDL、LDH在酮病奶牛出現(xiàn)顯著降低或升高。

Table 3 Serum biochemical indices of ketotic，subclinical ketotic and non-ketotic cows

表4與健康組相比，其他兩組血漿樣本里面MDA含量更高（P＜0.05），而SOD、CAT的活性更低。以健康組為標準來看，臨床組血漿里面維生素C含量更低（P＜0.05），血漿所含有的尿酸以及阻礙羥自由基能力更是顯著低于健康組（P＜0.01），H2O2濃度比健康組、亞臨床組更高（P＜0.01）。

Table 4 Biomarkers of oxidative status of ketotic，subclinical ketotic and non-ketotic cows

3 討論

對三組奶牛給予相同配方的飼料，產(chǎn)奶量出現(xiàn)明顯差異，以健康奶牛產(chǎn)奶量為最高，亞臨床型奶牛次之，臨床型酮病奶牛最少，產(chǎn)量減少非常明顯，與相關研究指出奶牛酮病直接或間接引起泌乳量下降相符合。同時臨床酮病奶牛體況評分也出現(xiàn)了明顯的差異。符合臨床型酮病所表現(xiàn)出的體況變化，而亞臨床型酮病相對癥狀不明顯，需要根據(jù)血液中酮體水平相關數(shù)據(jù)進行辨別。酮病奶牛表現(xiàn)為血液中高NEFA及BHBA，低血糖。轉氨酶的顯著差異表明奶牛酮病造成肝臟不同程度損傷，同時TC、HDL、VLDL、LDH顯著變化提示肝臟出現(xiàn)脂質(zhì)蓄積。根據(jù)血漿中氧化劑和抗氧化劑含量情況顯示患有亞臨床型、臨床型酮病的奶牛，抗氧化能力顯著降低，呈氧化還原失衡狀態(tài)。

奶牛酮病是一種高發(fā)的營養(yǎng)代謝紊亂性疾病，這種疾病是在能量負平衡（Negative Energy Balance，NEB）基礎上發(fā)展而來的，在NEB狀態(tài)下，奶牛因生產(chǎn)和繁殖就有可能患上這種疾病。處于圍產(chǎn)期的奶牛，食欲降低，干物質(zhì)攝入量不足，而胎兒成長、乳汁分泌會消耗更多的葡萄糖，分娩后短期內(nèi)丙酸鹽合成量太少，從而引發(fā)NEB[5]。研究結果顯示，奶牛在尚未發(fā)生酮病時血糖水平較低，脂肪動員供能，血液里面NEFA含量因此而上升。本實驗表明，和健康組相比，亞臨床組、臨床組血液樣本里面的葡萄糖含量更低，而NEFA、BHBA兩種物質(zhì)含量則更高，這和現(xiàn)有的研究結論是相符的，這些癥狀可以作為確診NEB的依據(jù)。處于圍產(chǎn)期的奶牛，體內(nèi)氧化劑增加，處于病理性氧化應激狀態(tài)。機體里面最主要的抗氧化酶物質(zhì)是SOD和GSH-Px。前者是機體防御氧化應激的第一道屏障，它可以和超氧陰離子發(fā)生反應從而形成過氧化氫，GSH-Px也是一種重要的抗氧化物質(zhì)，它能夠有效地阻礙自由基傷害細胞?，F(xiàn)有的研究結論表明，血漿里面GSH-Px的活性，和脂質(zhì)過氧化物的濃度存在關聯(lián)，因此可以以后者作為評價氧化應激狀態(tài)的指標。健康細胞進行新陳代謝后會釋放自由基，比如超氧陰離子（O2-）、H2O2、羥自由基（OH-）和一氧化氮（NO）等。在健康機體中，自由基的形成和消耗能夠保持平衡，任何原因?qū)е逻@種平衡狀態(tài)被打破，就會出現(xiàn)氧化應激的癥狀。和健康組相比，其他兩組血液樣本中總膽固醇含量更低，不過三組樣本TG含量基本一致，導致膽固醇含量降低的原因是肝臟未能釋放出足夠的膽固醇。對于反芻動物而言，肝臟提供脂蛋白，而脂蛋白能夠分解成為膽固醇?；加兄靖渭膊『?，奶牛血液里面VLDL含量有所下降，這或許代表著機體可能患上酮病。本實驗結果顯示，和健康組相比，其他兩組血液樣本里面VLDL濃度明顯更低，這或許是因為肝臟無法正常地輸出TG。本實驗結果表明，和健康組相比，亞臨床組、臨床組血漿樣本含有的SOD、GSH-Px活性水平更低，充分證明酮病使奶?？寡趸δ苁艿接绊?。另外，CAT在機體抗氧化方面也發(fā)揮著重要的作用，它的功能是和過氧化氫發(fā)生反應，得到的產(chǎn)物為H2O和O2。生物體內(nèi)的抗氧化劑包括了維生素C、維生素E以及尿酸，這三種物質(zhì)對維持機體健康來說非常重要。目前有足夠的證據(jù)證明，可以使用血液里面維生素C、維生素E和尿酸的含量，評價分娩后母體氧化狀態(tài)的改變。本研究結果顯示，患有酮病后，機體血液所含有的維生素C、維生素E和尿酸量會大幅下降，充分證明這種疾病會給奶?？寡趸芰碡撁娴挠绊?。而且，和健康組相比，其他兩組血漿樣本里面H2O2含量更高，證明患有這種疾病后機體氧化水平有所上升。脂質(zhì)過氧化會釋放出一系列的產(chǎn)物，MDA即為其中之一，其在血液中含量的提高，是機體存在脂質(zhì)過氧化的有力證據(jù)。所以，以MDA為指標揭示氧化應激狀態(tài)程度高低在實踐中得到了廣泛的應用。本實驗結果顯示，和健康組相比，其他兩組血液樣本中MDA濃度明顯更高符合相關結論。

[1] 王愛紅，楊玉平，胡喜斌.奶牛酮病的防治措施[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2011，27（4）：133.

[2] Shaw J C. Studies on ketosis in dairy cattle. VII. The efficacy of B vitamins and methionine in the treatment of ketosis[J]. Journal of Dairy Science，1946，29（3）：131-139.

[3] 張振國.奶牛酮病病因及綜合防治措施[J].中國畜禽種業(yè)，2015，（12）：74-75.

[4] HERDT T H．Ruminant adaptation to negative energy balance． Influences on the etiology of ketosis and fatty liver[J].Vet Clin North Am Food Anim Pract，2000，16（2）：215-230．

[5] 李玉.奶牛酮病氧化應激致肝細胞凋亡的信號轉導機制研究[D].吉林大學，2014.

王哲