樊琛++徐旺燁++曾慶華++王會(huì)++李燕++王雷++郭興峰

摘要：采用雞胚致死對(duì)HL11、HL32、SD27雞源大腸桿菌（Escherichia coli）的致病性進(jìn)行測(cè)定，并檢測(cè)其血清抗性及iss基因序列。結(jié)果表明，3株大腸桿菌為致病性、血清補(bǔ)體敏感菌株，iss基因序列與已知禽大腸桿菌iss基因序列同源性為99.0%～99.7%。

關(guān)鍵詞：雞源大腸桿菌（Escherichia coli）；iss基因；致病性；血清抗性

中圖分類號(hào)：S831 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）22-5969-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.060

Detection of iss Gene of Three Avian E.coli Strains

FAN Chen1，XU Wang-ye2，ZENG Qing-hua1，WANG Hui1，LI Yan1，WANG Lei1，GUO Xing-feng1

（1.Agricultural School，LiaoCheng University，Liaocheng 252059，Shandong，China；

2.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Abstract：The virulence of avian E.coli strains HL11，HL32，SD27 were detected by embryo lethality assay. The presence of iss gene and complement resistance were tested. Results showed that three strains are pathogenic and complement sensitive. The iss sequences have 99.0%～99.7% identity with reference sequence.

Key words：avian E.coli； iss gene； virulence； complement resistance

大腸桿菌（Escherichia coli）是食品污染程度的重要指標(biāo)，某些血清型的大腸桿菌對(duì)人類和動(dòng)物具有致病性，對(duì)嬰幼兒以及家禽尤為明顯[1，2]。大腸桿菌病為人畜共患病，受到大腸桿菌污染的食物被食用后，可以導(dǎo)致食物中毒甚至是嚴(yán)重的敗血癥，并增加其他病原體感染機(jī)會(huì)，如痢疾、霍亂或者傷寒等腸道疾病，對(duì)食品安全有較大影響[2-4]。大腸桿菌的血清型繁多，但不同血清型的大腸桿菌有共同的致病物質(zhì)基礎(chǔ)[4，5]。研究發(fā)現(xiàn)，與大腸桿菌毒力相關(guān)的致病因子有1型菌毛、毒素、外膜蛋白、ColV質(zhì)粒、補(bǔ)體抗性、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等[6-9]。

在大腸桿菌諸多致病因子中，菌毛在致病性大腸桿菌侵入機(jī)體，并在體內(nèi)定居、增殖、釋放毒力因子的過(guò)程中起著重要的作用。但細(xì)菌進(jìn)入機(jī)體血流后，將面對(duì)血液中的殺菌物質(zhì)，如補(bǔ)體等。細(xì)菌抵抗血液中殺菌物質(zhì)的能力，對(duì)細(xì)菌致病力有重要影響。研究表明，iss基因（Increased serum survival gene，iss gene）存在于ColV質(zhì)粒上，iss基因編碼的蛋白Iss屬于外膜蛋白的一部分，與細(xì)菌抗補(bǔ)體作用有關(guān)，可增強(qiáng)大腸桿菌的血清抗性[10]。本試驗(yàn)對(duì)雞源大腸桿菌HL11、HL32、SD27進(jìn)行了致病性檢測(cè)，并對(duì)iss基因進(jìn)行序列測(cè)定，探討iss基因序列與大腸埃希菌致病力的相互關(guān)系，為iss基因作為毒力標(biāo)志基因在大腸桿菌毒力判定、食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 HL11、HL32為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院分離，30%甘油-20 ℃保存；SD27為聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)院分離，30%甘油-20 ℃保存。

1.1.2 引物 參考GenBank中的禽大腸桿菌iss基因核苷酸序列（登入號(hào)：AF042279）設(shè)計(jì)兩對(duì)引物。引物1上游：5agctatcgtttaattattatcac3；引物1下游5gtagggagcccagaagtat3；引物2上游：5cgcggatccag

gattctgccgttttta3；引物2下游：5cgcgtcgaccatatcgatggg

caacta3[11]。

1.1.3 試劑 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、生化試驗(yàn)鑒定管等購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。蛋白酶K、RnaseA、rTaq酶、pMD18-T克隆載體及相關(guān)試劑均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的活化 無(wú)菌條件下將樣本分別接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基置37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后，挑取紫黑色帶金屬光澤的菌落于麥康凱瓊脂平板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。挑取麥康凱瓊脂平板上桃紅色典型菌落。進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，取另一半接種于LB普通營(yíng)養(yǎng)斜面培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，用于生化鑒定。

1.2.2 生化鑒定 取細(xì)菌純培養(yǎng)物分別接種于吲哚試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、枸櫞酸鹽試驗(yàn)管中，并進(jìn)行三糖鐵試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂穿刺試驗(yàn)、淀粉試驗(yàn)，其中觸酶試驗(yàn)立刻觀察，其他試驗(yàn)分別置37 ℃溫箱搖床培養(yǎng)。吲哚試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂穿刺試驗(yàn)、淀粉試驗(yàn)于24 h觀察，VP試驗(yàn)于48 h滴加試劑觀察，枸櫞酸鹽試驗(yàn)于96 h觀察。取細(xì)菌純培養(yǎng)物接種6種糖類微量發(fā)酵管（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、木糖發(fā)酵管），置37 ℃培養(yǎng)24～48 h后進(jìn)行觀察。

1.2.3 對(duì)雞胚的致病性試驗(yàn) 將待測(cè)菌接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。收集細(xì)菌用PBS溶液洗2次，并用PBS溶液倍比稀釋。取0.1 mL稀釋液經(jīng)尿囊腔注射12日齡SPF雞胚，大約100～300 CFU，每組10只。同時(shí)取0.1 mL稀釋液涂板，做細(xì)菌計(jì)數(shù)。對(duì)照組分兩組，一組注射PBS溶液，一組不注射。每日檢蛋，記錄每日死亡數(shù)，至第四天，計(jì)算胚胎致死率。

1.2.4 擴(kuò)增模板制備 將待測(cè)菌劃板，挑取平板上的單菌落，加入40 μL lysing Buffer（10 mmol/L Tris-Cl pH 7.5，1 mmol/L EDTA）和蛋白酶K（終濃度為50 μg/mL），混勻，置于55 ℃溫育10 min后再置80 ℃溫育10 min，最后加80 μL滅菌三蒸水，-20 ℃保存。

1.2.5 iss基因的PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，上、下游引物（50 pmol/μL）各1 μL，DNA模板 5 μL，滅菌ddH2O 33.5 μL，rTaq酶 0.5 μL，共50 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：97 ℃預(yù)變性5 min；97 ℃變性1 min，47 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸30 s，9個(gè)循環(huán)；再經(jīng)95 ℃變性1 min， 48 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。然后再進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增反應(yīng)，套式PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系同上，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序： 95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃退火30 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.6 iss基因鑒定 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法純化PCR產(chǎn)物，并進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.7 血清抗性檢測(cè) 細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，OD600 nm=0.5，相應(yīng)于10個(gè)細(xì)菌數(shù)/mL；于0.06 mmol/L NaCl中洗3次，重懸于0.9%NaCl至106個(gè)活菌數(shù)/mL；將細(xì)菌懸液與雞血清相混合，使血清終濃度為80%；混合物于37 ℃溫育，分別于0、2 h取樣，用鹽溶液稀釋后涂板，37 ℃培養(yǎng)18 h，計(jì)活菌數(shù)。計(jì)算菌株2 h時(shí)活菌數(shù)與0 h時(shí)活菌數(shù)的對(duì)數(shù)差，判定菌株血清抗性強(qiáng)弱。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成紫黑色帶金屬光澤的菌落；在麥康凱瓊脂上形成圓形、中等大小均一，表面光滑濕潤(rùn)中央輕微隆起、桃紅色菌落；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上37 ℃培養(yǎng)24～48 h后，形成中等大小、圓形微凸起、表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、半透明灰白色菌落；在SS瓊脂上生長(zhǎng)較差，呈粉紅色。在肉湯中培養(yǎng)18～24 h，呈均勻混濁，管底有灰白色黏性沉淀。革蘭氏染色可見(jiàn)兩端鈍圓、多數(shù)散在排列、革蘭氏陰性短桿菌。葡萄糖、麥芽糖、乳糖、木糖、甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)均產(chǎn)酸產(chǎn)氣；MP、吲哚試驗(yàn)，淀粉試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)呈陽(yáng)性；枸櫞酸鹽試驗(yàn)、尿酶試驗(yàn)、VP、蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)呈陰性；三糖鐵試驗(yàn)符合大腸桿菌特征，無(wú)H2S產(chǎn)生。

2.2 胚胎致死及血清抗性鑒定結(jié)果

雞胚接種細(xì)菌后，各試驗(yàn)組在觀察期內(nèi)均有死亡，而對(duì)照組無(wú)死亡。菌株在終濃度為80%的含補(bǔ)體雞血清中溫育，2 h與0 h的活菌對(duì)數(shù)差為-5.37至-4.67，3株菌株為致病性大腸桿菌及補(bǔ)體敏感菌株，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 iss基因序列鑒定結(jié)果

套式PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物大小為309 bp的核苷酸序列，如圖1所示。3條序列由上至下分別為HL11、HL32、SD27菌株iss基因核苷酸序列。iss基因核酸序列用DNAStar軟件進(jìn)行比對(duì)，與參考序列比較，HL11的同源性為99.7%，HL32的同源性為99.4%，SD27的同源性為99.0%。3條序列預(yù)測(cè)編碼Iss蛋白的氨基酸序列，HL11第35位由丙氨酸變?yōu)槔i氨酸；HL32的82位亮氨酸變?yōu)楸奖彼?、?8位苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼?；SD27氨基酸序列與參考序列一致。

3 小結(jié)與討論

雞大腸桿菌HL11、HL32、SD27雞胚致死率分別為50%、60%、30%，雞胚致死率低于15%判為無(wú)致病性/低致病性[9]，因此3株菌株均判斷為致病性菌株。但其血清抗性試驗(yàn)中，2 h與0 h的活菌對(duì)數(shù)差均低于-2.12[11]，判定為血清敏感菌株。iss基因序列分析結(jié)果表明，HL11、HL32、SD27菌株iss基因序列與禽大腸桿菌iss基因參考序列同源性達(dá)99.0%～99.7%，個(gè)別位點(diǎn)存在核苷酸差異。HL11、HL32、SD27菌株為致病性菌株，血清補(bǔ)體敏感，且iss基因在核苷酸序列上與已知強(qiáng)毒株存在差異。3株菌株在血清抗性、致病性方面與參考序列菌株O2的差異，是否與iss基因的變異有關(guān)還需要更多菌株的iss基因檢測(cè)進(jìn)一步探討。

正常機(jī)體具有抗病原微生物侵襲的能力。致病性大腸桿菌要發(fā)揮其致病作用，必須首先突破機(jī)體的天然屏障，即首先在局部吸附并定居繁殖，進(jìn)而侵入體內(nèi)，因此大多數(shù)研究基于大腸桿菌菌毛的研究。但細(xì)菌定居后不斷增殖形成集落（局部增殖），在條件適合時(shí)侵入機(jī)體組織，并進(jìn)入血流。大腸桿菌從肺泡毛細(xì)血管進(jìn)入血循環(huán)，引起菌血癥；在全身組織內(nèi)增殖，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)，大腸桿菌大量繁殖，引起敗血癥。補(bǔ)體在機(jī)體血液中發(fā)揮殺菌作用，細(xì)菌的補(bǔ)體抗性與毒力高度相關(guān)，是重要的致病因素[8，9]。對(duì)iss基因序列及基因拷貝水平的進(jìn)一步研究可能揭示大腸埃希菌iss基因在致病力及血清補(bǔ)體抗性方面的作用。

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