魏若堯，孫井江，李　摯，劉躍華，高　虹，孫勁旅

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京100021)

ChinJAllergyClinImmunol，2017，11(2)：142- 148

變應(yīng)性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis)是一種以半抗原-特應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)、由過(guò)敏原接觸皮膚后激發(fā)產(chǎn)生的遲發(fā)型超敏反應(yīng)性疾病(Ⅳ型超敏反應(yīng)疾病)，以抗原刺激后局部皮膚出現(xiàn)一系列的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥介質(zhì)釋放為主要特征，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，變應(yīng)性接觸性皮炎的炎癥反應(yīng)涉及許多不同的通路和免疫機(jī)制，包括大量不同的細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞因子、趨化因子和受體，還涉及局部和系統(tǒng)免疫反應(yīng)，并同時(shí)覆蓋了固有免疫系統(tǒng)和自身免疫系統(tǒng)。在致敏階段，其主要參與細(xì)胞為肥大細(xì)胞及T細(xì)胞，初始T細(xì)胞在分化過(guò)程中分泌干擾素(interferon，INF)-γ和白細(xì)胞介素(interleukin,IL)- 4等細(xì)胞因子，同時(shí)反饋于T細(xì)胞促進(jìn)分化；在激發(fā)階段，除了T細(xì)胞的再次活化，固有免疫系統(tǒng)、B細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞(natural killer T，NKT)、自然殺傷細(xì)胞(natural killer，NK)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cells，Tregs)分泌的IL- 4、IL- 10等多種細(xì)胞因子也會(huì)參與并調(diào)控整個(gè)致敏過(guò)程。

變應(yīng)性接觸性皮炎可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1- 2]。眾多研究表明：金屬鎳無(wú)論是在我國(guó)還是全球范圍，都是誘發(fā)變應(yīng)性接觸性皮炎產(chǎn)生的重要化學(xué)物質(zhì)之一[3- 4]，進(jìn)一步闡明鎳變應(yīng)性接觸性皮炎的發(fā)病機(jī)制成為目前亟待解決的重要問(wèn)題。動(dòng)物模型是研究疾病發(fā)病機(jī)制，評(píng)價(jià)治療藥物的必不可少的實(shí)驗(yàn)工具，現(xiàn)在迫切需要建立與臨床發(fā)病進(jìn)程與表現(xiàn)相一致的動(dòng)物模型用于發(fā)病機(jī)制的研究。本研究利用不同濃度的硫酸鎳為變應(yīng)原，建立小鼠急性變應(yīng)性接觸性皮炎模型，為臨床前評(píng)價(jià)鎳變應(yīng)性接觸性皮炎治療藥物提供動(dòng)物模型。

材料與方法

試劑和儀器

六水合硫酸鎳(分析純，西隴化工股份有限公司，批號(hào)：1209191)；10%中性福爾馬林(北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司)；氯化鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；小鼠IL- 4、小鼠IL- 10和小鼠INF-γ酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(abcam，96T)；DM1000顯微鏡(Leica)；Si(Li)固體探測(cè)器和譜儀分析系統(tǒng)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6小鼠30只，雄性，體質(zhì)量18～22 g。動(dòng)物均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012- 0001]。飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體動(dòng)物(specific pathogen free，SPF)級(jí)環(huán)境中，動(dòng)物設(shè)施許可證號(hào)[SYXK(京)2014- 002]。

動(dòng)物分組及致敏方法

小鼠分為5組，每組6只。分別為5%- 5%硫酸鎳組、10%- 10%硫酸鎳組、10%硫酸鎳單次刺激組、2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene, DNCB)為陽(yáng)性對(duì)照組(positive control,PC)、0.9%氯化鈉溶液(normal saline，NS)為陰性對(duì)照組(negative control,NC)。實(shí)驗(yàn)前24 h，小鼠右側(cè)腹部固定部位(1.5 cm×1.5 cm)剃毛；實(shí)驗(yàn)第0天，于小鼠右側(cè)腹部脫毛處封閉涂致敏受試物進(jìn)行誘導(dǎo)致敏一次；實(shí)驗(yàn)第2天和第3天，于同一固定脫毛部位封閉涂抹激發(fā)受試物進(jìn)行激發(fā)，各激發(fā)一次。10%- 10%硫酸鎳單次刺激組于第0天、第3天涂抹生理鹽水，僅在第2天涂抹硫酸鎳進(jìn)行刺激。

濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)評(píng)分法

采用濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)(eczema area and severity index, EASI)評(píng)分法，根據(jù)不同部位皮損癥狀嚴(yán)重程度，所占面積大小的綜合積分，具體的計(jì)算方法如下[5]。臨床癥狀的評(píng)分：臨床表現(xiàn)分為四項(xiàng)，即：紅斑(erythema，E)，硬腫(水腫)/丘疹[induration(edema)/papulation，I]，表皮剝脫(excoriation，Ex)，苔蘚化(lichenification，L)。每一臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重度以0～3分計(jì)分，0=無(wú)，1=輕，2=中，3=重。各種癥狀分值之間可記半級(jí)分，即0.5。

皮膚超聲檢測(cè)

于激發(fā)后48 h，0.2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，對(duì)激發(fā)部位皮膚進(jìn)行超聲掃描，并記錄表皮厚度變化。

組織病理學(xué)檢查

于激發(fā)后48 h剪取激發(fā)部位皮膚，10%中性福爾馬林固定，進(jìn)行組織修塊，再固定，制作石蠟切片，蘇木精-伊紅染劑(hematoxylin and eosin stain，HE)染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察皮膚的形態(tài)學(xué)變化。

細(xì)胞因子檢測(cè)

皮損組織IFN-γ、IL- 4和IL- 10的測(cè)定：分別采集5%- 5%硫酸鎳組、10%- 10%硫酸鎳組、10%硫酸鎳單次刺激組和陰性對(duì)照組第一次激發(fā)后48 h后皮損部位的皮膚組織，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗去血污，濾紙拭干，剔除附屬的結(jié)締組織，稱取200 mg 組織塊，剪成小塊后放入勻漿管中，加入2 ml PBS溶液中制成勻漿。組織處理過(guò)程均在冰上進(jìn)行。將組織勻漿于4 ℃ 12 000 r/min，離心機(jī)半徑為3 cm，離心20 min取上清備用。采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說(shuō)明書(shū)要求測(cè)定，并使用專業(yè)軟件Curve Expert1.3制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣品中待測(cè)細(xì)胞因子濃度。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

激發(fā)部位炎癥反應(yīng)

硫酸鎳激發(fā)后，各組小鼠皮膚均出現(xiàn)不同程度的炎癥反應(yīng)(圖1)。各組小鼠均為第一次激發(fā)后24 h后皮膚EASI分值最大，之后炎癥反應(yīng)逐漸降低。EASI平均分均值為：10%- 10%硫酸鎳組>5%- 5%硫酸鎳組>10%硫酸鎳單次刺激組。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，10%- 10%硫酸鎳組與陰性對(duì)照組之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，與陽(yáng)性對(duì)照組之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2)。

皮膚超聲檢測(cè)結(jié)果

激發(fā)后48 h實(shí)驗(yàn)組小鼠較陰性對(duì)照組小鼠表皮厚度均有增加，表皮厚度平均值：10%- 10%硫酸鎳組>5%- 5%硫酸鎳組>10%單次激發(fā)組。10%單次刺激組較陰性對(duì)照組表皮增厚不明顯(圖3、4)。

組織病理學(xué)結(jié)果

激發(fā)后48 h，硫酸鎳各組小鼠激發(fā)部位皮膚均表現(xiàn)為真皮淺中層水腫，棘層肥厚，基底層液化變性，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，與人類(lèi)急性炎癥癥狀一致。其中10%- 10%硫酸鎳組更為嚴(yán)重(圖5)，10%硫酸鎳單次刺激組僅表現(xiàn)為部分表皮增厚，未出現(xiàn)炎癥癥狀。

激發(fā)部位細(xì)胞因子變化

小鼠第一次激發(fā)后48 h內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組皮損部位皮膚組織IFN-γ、IL- 4和IL- 10的水平均發(fā)生變化。各組INF-γ、IL- 4和IL- 10均值水平為10%- 10%硫酸鎳組>5%- 5%硫酸鎳組>10%硫酸鎳單次刺激組>陰性對(duì)照組。其中，10%- 10%硫酸鎳組的IL- 4均值水平與陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

圖1小鼠鎳變應(yīng)性皮炎模型各組24 h時(shí)間點(diǎn)皮膚反應(yīng)

Fig1Inflammatory reaction of NiSO4treated skin in experiment and control groups

圖2　小鼠鎳變應(yīng)性皮炎模型不同時(shí)相皮膚炎癥反應(yīng)(EASI評(píng)分)Fig 2　Value of EASI for NiSO4 treated skin in experiment and control groups

圖3　小鼠鎳激發(fā)48 h后各組表皮厚度Fig 3　Thickness of epidermis for NiSO4 treated skin in experiment and control groups

圖4小鼠鎳激發(fā)48 h后皮膚超聲圖片

Fig4Picture for NiSO4treated skin in experiment and control groups

圖5鎳變應(yīng)性皮炎小鼠模型腹部皮膚病理(HE染色×100)

Fig5Histopathology of nickel-treated skin on experimental group(HE×100)

分組干擾素?γ白細(xì)胞介素?4　白細(xì)胞介素?105%?5%硫酸鎳組12168±6839818±43814787±864310%?10%硫酸鎳組18455±100071486±139?26744±555910%硫酸鎳單次刺激組6809±　697338±02112079±869陰性對(duì)照組4686±2769219±12411195±6992陽(yáng)性對(duì)照組9441±3457924±19914469±7412

*與陰性對(duì)照組比較，P<0.05

討　　論

變應(yīng)性接觸性皮炎是目前世界上職業(yè)性皮膚病的最大難題之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)約占職業(yè)性疾病發(fā)病率的20%[6]，這種職業(yè)性的接觸性過(guò)敏不僅存在于產(chǎn)業(yè)工人中，也常見(jiàn)于醫(yī)護(hù)人員、銀行職員中[7]，在中國(guó)變應(yīng)性接觸性皮炎的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)[8]。變應(yīng)性接觸性皮炎的臨床特點(diǎn)在發(fā)病初期為紅斑、丘疹和水皰，隨后可能會(huì)出現(xiàn)脫皮和皮膚干燥，常自覺(jué)劇烈瘙癢、燒灼或腫脹感，多有糜爛滲出或結(jié)痂，易反復(fù)發(fā)作，可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。變應(yīng)性接觸性皮炎的炎癥反應(yīng)涉及許多不同的通路和免疫機(jī)制，包括大量不同的細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞因子、趨化因子和受體，還涉及局部和系統(tǒng)免疫反應(yīng)，并同時(shí)覆蓋了固有免疫系統(tǒng)和自身免疫系統(tǒng)。這使得接觸性超敏反應(yīng)模型為許多機(jī)制的研究提供了合適的研究模型。

在本實(shí)驗(yàn)中，5%- 5%、10%- 10%硫酸鎳組在激發(fā)后皮膚均出現(xiàn)紅斑反應(yīng)，而10%硫酸鎳單次刺激組僅出現(xiàn)輕度表皮粗糙，并未產(chǎn)生嚴(yán)重的紅斑反應(yīng)。根據(jù)紅斑分級(jí)評(píng)分，實(shí)驗(yàn)組紅斑指數(shù)為10%- 10%硫酸鎳組>5%- 5%硫酸鎳組。其中，10%- 10%硫酸鎳組與陰性對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與陽(yáng)性對(duì)照組之間差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而10%單次刺激組紅斑反應(yīng)不明顯，與陰性對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第一次激發(fā)后48 h，5%- 5%硫酸鎳組和10%- 10%硫酸鎳組小鼠激發(fā)部位皮膚均表現(xiàn)為真皮淺中層水腫，棘層肥厚，基底層液化變性，其中5%- 5%硫酸鎳組出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，10%- 10%硫酸鎳組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)更為嚴(yán)重。兩組病理表現(xiàn)與人類(lèi)急性炎癥癥狀一致。10%- 10%硫酸鎳單次刺激組僅表現(xiàn)為部分表皮增厚，未出現(xiàn)炎癥癥狀。通過(guò)超聲掃描， 實(shí)驗(yàn)組小鼠較陰性對(duì)照組小鼠表皮厚度均有增加，表皮厚度平均值為：10%- 10%硫酸鎳組>5%- 5%硫酸鎳組>10%單次激發(fā)組。10%單次刺激組較陰性對(duì)照組表皮增厚不明顯。同時(shí)，各硫酸鎳實(shí)驗(yàn)組皮損部位皮膚組織IFN-γ、IL- 4和IL- 10水平發(fā)生變化。各組IFN-γ、IL- 4和IL- 10均值水平為10%- 10%硫酸鎳組>5%- 5%硫酸鎳組>10%硫酸鎳單次刺激組>陰性對(duì)照組。其中，10%- 10%硫酸鎳組的IL- 4與陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。10%單次刺激組各細(xì)胞因子檢測(cè)均值與陰性對(duì)照比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。綜上所述，對(duì)大體反應(yīng)、病理變化、超聲掃描和細(xì)胞因子進(jìn)行綜合分析，5%- 5%、10%- 10%硫酸鎳刺激組成功誘發(fā)小鼠鎳接觸性皮炎，10%- 10%硫酸鎳組皮膚炎癥更為嚴(yán)重。而10%單次刺激組與陰性對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示并未產(chǎn)生小鼠刺激性皮炎，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)5%- 5%、10%- 10%硫酸鎳組誘導(dǎo)出的是過(guò)敏性接觸性皮炎，小鼠鎳接觸性皮炎模型建立成功。

現(xiàn)階段動(dòng)物模型包括人工誘導(dǎo)模型和自發(fā)性疾病模型。此前接觸性皮炎的研究多用反復(fù)暴露于2,4-二硝基氟苯(dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型，這種接觸敏感性的半抗原會(huì)造成緩發(fā)型變應(yīng)性接觸性皮炎[9]。在1995年，Kitagaki 等[10]人報(bào)道表皮重復(fù)接觸另一種接觸敏感性半抗原：2,4,6-硝基氯代苯(trinitrochlorobenzene，TNCB)引起的皮炎反應(yīng)由遲發(fā)型轉(zhuǎn)變?yōu)榱怂侔l(fā)型。這一類(lèi)的模型操作方便，可以為人類(lèi)的特應(yīng)性皮炎的研究提供模型。本實(shí)驗(yàn)也用此模型作為陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。此前，小鼠鎳致敏性模型大都采用皮下注射致敏物的方式，不便操作且與臨床致病方式存在差異。Maruyama等[11]在2003年建立的小鼠鎳過(guò)敏模型，在2010年由Johansen等[12]證明是由鎳鹽的刺激性而非致敏性引起的，即此小鼠模型并非真正的Ⅳ型接觸性皮炎。在本實(shí)驗(yàn)中，按照預(yù)先實(shí)驗(yàn)，首次采用與人類(lèi)接觸變應(yīng)原相同的途徑進(jìn)行涂抹致敏和激發(fā)，建立了一種與人類(lèi)發(fā)病進(jìn)程相同的主動(dòng)致敏的小鼠鎳變應(yīng)性接觸性皮炎動(dòng)物模型，為研究鎳致敏性皮炎的臨床發(fā)病進(jìn)程、臨床表現(xiàn)及整個(gè)免疫機(jī)制的研究提供了重要的工具。

有文獻(xiàn)表明脂多糖會(huì)增加由鎳引起的反應(yīng)[13- 14]，最近又有研究表明，由于小鼠的Toll樣受體4(Toll-like receptors，TLR- 4)受體缺少在人類(lèi)中發(fā)現(xiàn)的鎳結(jié)合組氨酸[15]，因此，小鼠中的鎳過(guò)敏只有在和其他刺激物或者輔助作用下才會(huì)發(fā)生。然而，Vennegaard等[15]分別在TLR- 4完整的和TLR- 4缺失的C3H/HeN小鼠上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示脂多糖不應(yīng)答，而C3H/HeJ小鼠排除了鎳致敏應(yīng)答是由于脂多糖污染，以上研究表明，至少在小鼠中，鎳致敏是由于固有免疫中其他機(jī)制引起的，并不是通過(guò)TLR- 4受體。同時(shí)，也說(shuō)明了鎳致敏反應(yīng)對(duì)于小鼠MyD88的依賴性。因?yàn)樵谌祟?lèi)皮膚暴露于鎳之后，鎳元素主要集中在表皮中，而TLR- 4受體通常不在人類(lèi)皮膚細(xì)胞中表達(dá)。綜上所述，這些研究可以解釋筆者能夠在非脂多糖暴露的情況下，建立了變應(yīng)性接觸性皮炎急性小鼠模型。

[1]晉紅中, 譯. 費(fèi)舍爾接觸性皮炎. Robert LR, Joseph FF. Fisher’s Contact Dermatitis[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2010: 599- 654.

[2]黃曙海, 龐維群, 湯俊豪. 細(xì)胞因子在過(guò)敏性接觸性皮炎病變過(guò)程中的表達(dá)[J]. 中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué), 2007, 34: 53- 55.

[3]Holness DL. Occupational skin allergies: testing and treatment (the case of occupational allergic contact dermatitis) [J]. Curr Allergy Asthma Rep, 2014, 14:410.

[4]Lee SW, Cheong SH, Byun JY, et al. Occupational hand eczema among nursing staffs in Korea: self-reported hand eczema and contact sensitization of hospital nursing staffs[J]. J Dermatol, 2013, 40: 182- 187.

[5]Hanifin JM, Thurston M, Omoto M, et al. The eczema area and severity index (EASI):assessment of reliability in atopic dermatitis.EASI Evaluator Group[J]. Exp Dermatol,2001,10: 11- 18.

[6]Sibbald B, Rink E. Epidemiology of seasonal and perennial rhinitis: clinical presentation and medical history[J]. Thorax, 1991, 46: 895- 901.

[7]Huang C, Liu W, Hu Y,et al. Updated prevalences of asthma, allergy, and airway symptoms, and a systematic review of trends over time for childhood asthma in Shanghai, China[J]. PLoS One, 2015, 10: e0121577.

[8]Peiser M, Tralau T, Heidler J,et al. Allergic contact dermatitis: epidemiology, molecular mechanisms, in vitro methods and regulatory aspects. Current knowledge assembled at an international workshop at BfR, Germany[J]Cell Mol Life Sci, 2012, 69: 763- 781.

[9]Nagai H, Matsuo A, Hiyama H,et al. Immunoglobuilin E production in mice by means of contactnsensitization with a simple chemical,hapten[J]. J allergy Chin Immunol,1997, 100: S39- 44.

[10] Kitagaki H, Fujisawa S, Watanabe K,et al. Immediate-type hypersensitivity response followed by a late reaction is induced by repeated epicutanceous application of conract sensitizing agents in mice[J]. J Invest Dermatol,1995,105: 749- 755.

[11] Maruyama T,Kataoka H,Semma M,et al.Evaluation of nickel allergy in mice[J]. Yakugaku Zasshi,2003,123:707.

[12] Johansen P, W?ckerle-Men Y, Senti G,et al.Nickel sensitisation in mice:A critical appraisal[J]. J Dermatol Sci,2010,58:186- 192.

[13] Sato N,Kinbara M,Kuroishi T,et al. Lipopolysaccharide promotes and augments metal allergies in mice, dependent on innate immunity and histidine decarboxylase[J]. Clin Exp Allergy,2007,37:743- 751.

[14] Schmidt M, Raghavan B, Muller V, et al. Crucial role for human toll-like receptor 4 in the development of contact allergy to nickel[J]. Nat Immunol,2010,11: 814- 819.

[15] Vennegaard MT, Dyring-Andersen B, Skov L, et al. Epicutaneous exposure to nickel induces nickel allergy in mice via a yD88-dependent and interleukin- 1-dependent pathway[J]. Contact Dermatitis,2014,71:224- 232.