王志敏

（黃河科技學(xué)院，河南鄭州450063）

絞股藍(lán)多糖運(yùn)動(dòng)飲品開發(fā)及其免疫調(diào)節(jié)功能分析

王志敏

（黃河科技學(xué)院，河南鄭州450063）

絞股藍(lán)具有緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)后免疫力水平的功效，具有潛在的運(yùn)動(dòng)飲品開發(fā)價(jià)值。以絞股藍(lán)多糖為原料，開發(fā)一種運(yùn)動(dòng)飲品，并通過小鼠實(shí)驗(yàn)和運(yùn)動(dòng)員自愿者的運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)證明這種運(yùn)動(dòng)飲品具有激活小鼠免疫狀態(tài)，改善人體免疫水平的作用，具有明顯的應(yīng)用價(jià)值，值得大力開發(fā)并廣泛推廣。

絞股藍(lán)；多糖；運(yùn)動(dòng)飲品；免疫力

運(yùn)動(dòng)性疲勞導(dǎo)致免疫功能失調(diào)，對(duì)于運(yùn)動(dòng)員，體育愛好者和普通人群的身體健康存在一定危害，甚至癥狀嚴(yán)重時(shí)可能增大呼吸道感染風(fēng)險(xiǎn)[1]。進(jìn)一步研究指出過度運(yùn)動(dòng)可明顯改變?nèi)梭w淋巴細(xì)胞的功能和數(shù)量，引起血清中免疫球蛋白含量減少，破壞細(xì)胞因子表達(dá)水平平衡，最終誘發(fā)一系列免疫相關(guān)疾病[2]。隨著競(jìng)技運(yùn)動(dòng)發(fā)展，解決過度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的免疫水平失調(diào)愈發(fā)重要，研究指出目前最佳的解決方案是在運(yùn)動(dòng)期間適量補(bǔ)充運(yùn)動(dòng)補(bǔ)劑以減少免疫水平失調(diào)現(xiàn)象的發(fā)生[3]。絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum）屬葫蘆科藤本植物，廣泛分布于我國(guó)各地。關(guān)于絞股藍(lán)多糖的研究已經(jīng)廣泛開展，已證明其具有調(diào)劑機(jī)體免疫力、抗腫瘤、降血糖和抗衰老等功能性活性[4]。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，絞股藍(lán)多糖已被證實(shí)具有增強(qiáng)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的功效[5]。因此，絞股藍(lán)多糖已經(jīng)具有作為原料開發(fā)運(yùn)動(dòng)飲品的潛在價(jià)值。本研究以絞股藍(lán)多糖為原料，開發(fā)一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的運(yùn)動(dòng)飲品，并以小鼠和運(yùn)動(dòng)員為研究對(duì)象，對(duì)其應(yīng)用性和安全性進(jìn)行分析。

1材料與方法

1.1材料

絞股藍(lán)葉、莖：購(gòu)買自當(dāng)?shù)厮幍?；山梨酸鉀、羧甲基纖維素鈉、海藻酸丙二醇酯、檸檬酸、麥芽糖醇、果膠酶（均為食品級(jí)）：購(gòu)買自當(dāng)?shù)厥称诽砑觿╀N售店；實(shí)驗(yàn)所涉及的所有化學(xué)試劑均為進(jìn)口分析純。

1.2主要儀器

KG115粉碎機(jī)：許昌豫邦；XPE210電子天平：METTLER TOLEDO；1-15P離心機(jī)：Sigma；MM-16831恒溫水浴鍋：泰亞賽福；流式細(xì)胞儀：BD Calibur；CCKF5567全自動(dòng)生化分析儀：邁瑞；Multiskan FC全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：Thermo Scientific。

1.3制備流程

1.3.1絞股藍(lán)多糖的制備

將購(gòu)買的絞股藍(lán)進(jìn)行充分清洗、烘干，使用粉碎機(jī)處理成1 cm長(zhǎng)顆粒，按照體積比（1∶10）加入純水，在100℃恒溫水浴鍋中提取40min，重復(fù)3次。將提取液使用紗布過濾，之后加入乙醇（95%）體積比（1∶3）在4℃冰箱中沉淀過夜。第2日早晨使用低溫離心機(jī)離心（12 000 g，30min），之后收集上清液并再次使用紗布過濾。采用Sevag法脫蛋白去色素，得到粗提絞股藍(lán)多糖干粉。采用蒸餾水重新溶解絞股藍(lán)多糖，制備成濃度為10%溶液，再次高速離心去除果膠等雜質(zhì)（18 000 g，20 min），經(jīng)過梯度濃度乙醇（90%、80%、70%）沉淀，干燥箱充分干燥，得到精制無色絞股藍(lán)多糖干粉，簡(jiǎn)要提取流程如圖1所示。

圖1 絞股藍(lán)多糖運(yùn)動(dòng)飲品制備流程圖Fig.1 Gynostemma polysaccharidesportsdrinkspreparation flow chart

1.3.2絞股藍(lán)多糖飲品制備

將絞股藍(lán)多糖干粉使用蒸餾水溶解，調(diào)配成5%濃度溶液，按比例加入果糖、山梨酸鉀，羧甲基纖維素鈉，海藻酸丙二醇酯，檸檬酸，麥芽糖醇，果膠酶，制備成絞股藍(lán)多糖飲品，按照200mL/罐進(jìn)行滅菌、脫氣、灌裝處理，冷卻至室溫后，進(jìn)行感官評(píng)分，之后放于4℃冰箱中備用，簡(jiǎn)要制備流程如圖1所示。

1.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.4.1動(dòng)物運(yùn)動(dòng)模型建立

選擇健康ICR小鼠40只（體重19 g～20 g，5周齡，雄性），隨機(jī)分成2組，每組20只，分別為試驗(yàn)組和對(duì)照組。兩組小鼠均進(jìn)行負(fù)重游泳訓(xùn)練，每天訓(xùn)練30min，連續(xù)訓(xùn)練4周，負(fù)重重量從自重4%提升至12%，每周遞增2%，訓(xùn)練水深＜45 cm，水溫維持在27℃～30℃。實(shí)驗(yàn)組小組在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過程中全程灌胃服用絞股藍(lán)多糖飲品，訓(xùn)練前2 h服用，根據(jù)小鼠體重服用5%體重量的飲品。

1.4.2功能性分析

1.4.2.1胸腺和脾臟增大指數(shù)分析

4周訓(xùn)練結(jié)束后，處死小鼠，分離免疫器官（胸腺、脾），稱重計(jì)算，計(jì)算公式如下：胸腺指數(shù)=胸腺重量/體重；脾臟指數(shù)=脾臟重量/體重[6-7]。

1.4.2.2淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率分析

將分離自兩組小鼠的脾臟置于無菌環(huán)境，使用無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗，之后剪碎、研磨脾臟，將研磨液過200目篩網(wǎng)，得到脾細(xì)胞懸液，采用Hank’s液洗滌2次后，離心（800 g，10min），采用臺(tái)盼藍(lán)法計(jì)算存活率，鋪板（1×106cell/mL）。采用ConA法計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率，具體方法參考文獻(xiàn)[8]，比較試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的免疫水平狀態(tài)。

1.4.3安全性分析

在進(jìn)行小鼠試驗(yàn)的過程中，嚴(yán)格觀察小鼠狀態(tài)，對(duì)任何不良反應(yīng)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)記錄。

1.5運(yùn)動(dòng)員實(shí)驗(yàn)分析

1.5.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象選擇

選擇北京體育大學(xué)游泳專業(yè)學(xué)生20名參與實(shí)驗(yàn)，全部人員均為男性，年齡為20歲～22歲，體重為62.43 kg～65.33 kg，身高為172.54 cm～177.46 cm，均為有5年以上游泳訓(xùn)練經(jīng)驗(yàn)人員。隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組兩組，每組10人。

1.5.2實(shí)驗(yàn)方案

所有參與實(shí)驗(yàn)人員均按照大運(yùn)會(huì)備賽標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行訓(xùn)練，訓(xùn)練強(qiáng)度大，要求高，每日訓(xùn)練時(shí)間不少于6 h，連續(xù)進(jìn)行4周。試驗(yàn)組人員每日服用絞股藍(lán)多糖飲品2次，每次1罐，在訓(xùn)練前2 h服用1罐，訓(xùn)練過程中服用1罐，連續(xù)服用至訓(xùn)練結(jié)束。

1.5.3 功能分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求安排訓(xùn)練計(jì)劃，在訓(xùn)練過程中對(duì)參與實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行觀察。樣本采集兩次，包括實(shí)驗(yàn)開始前所有參與實(shí)驗(yàn)人員采集一次，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后所有參與實(shí)驗(yàn)人員采集一次。具體的采集方法為晨起空腹采集靜脈血5mL，分別進(jìn)行免疫球蛋白含量，血清細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)。

1.5.3.1血清免疫球蛋白檢測(cè)方法

血清中免疫球蛋白的含量采用免疫投射比濁法進(jìn)行，主要通過全自動(dòng)生化分析儀（日立7600-200）完成，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作指南進(jìn)行。

1.5.3.2血清細(xì)胞因子檢測(cè)

采用商品化ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)血清中的白介素（IL-6、IL-8、IL-10）和腫瘤壞死因子α的表達(dá)水平進(jìn)行檢查，檢測(cè)方法嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行。

1.5.3.3淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)

運(yùn)動(dòng)員淋巴細(xì)胞亞群分群情況檢測(cè)主要通過流式細(xì)胞儀（BD calibur）進(jìn)行，配合絕對(duì)計(jì)數(shù)管和淋巴細(xì)胞亞群免洗分析試劑盒進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。

1.5.4安全性分析

所有參與實(shí)驗(yàn)的人員在訓(xùn)練和生活過程中均進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)控，如發(fā)生任何不良反應(yīng)，第一時(shí)間采取積極手段救治，并詳細(xì)記錄。

1.6數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析均采用spss18.0，計(jì)量資料進(jìn)行采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1運(yùn)動(dòng)飲品感官評(píng)價(jià)

10名評(píng)審人員在進(jìn)行比較后，一致認(rèn)為絞股藍(lán)多糖運(yùn)動(dòng)飲品色、香、味俱佳，在此配方下具有優(yōu)秀的感官體驗(yàn)。

2.2小鼠脾臟和胸腺指數(shù)以及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況比較

小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1 小鼠胸腺和脾臟指數(shù)以及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化比較Table1 Compared the thym usand spleen indexesand lymphocyte transfomation inm ice

實(shí)驗(yàn)組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率檢測(cè)結(jié)果（吸光度）均顯著高于對(duì)照組小鼠，P＜0.05，差異顯著。

2.3運(yùn)動(dòng)員淋巴細(xì)胞含量檢測(cè)

運(yùn)動(dòng)員淋巴細(xì)胞含量檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2 運(yùn)動(dòng)員淋巴細(xì)胞含量檢測(cè)結(jié)果比較Table2 Com pared the resultsof lymphocyte content test

實(shí)驗(yàn)組人員的嗜堿性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比和中性粒細(xì)胞百分比均處于標(biāo)準(zhǔn)參考值范圍內(nèi)，與對(duì)照組人員相比，顯著高于對(duì)照組人員，P＜0.05，差異顯著。

2.4運(yùn)動(dòng)員免疫球蛋白含量比較

運(yùn)動(dòng)員免疫球蛋白含量檢測(cè)結(jié)果如表3所示。

表3 運(yùn)動(dòng)員免疫球蛋白含量比較Table3 Com pared the contentof immunoglobulin of athletes

實(shí)驗(yàn)組人員的IgA、IgG、IgM含量均處于標(biāo)準(zhǔn)參考值范圍內(nèi)，與對(duì)照組人員相比，顯著高于對(duì)照組人員，P＜0.05，差異顯著。

2.5運(yùn)動(dòng)員細(xì)胞因子表達(dá)水平分析

運(yùn)動(dòng)員細(xì)胞因子含量檢測(cè)結(jié)果如表4所示。

表4 運(yùn)動(dòng)員細(xì)胞因子含量比較Table4 Compared the contentof cytokinesofathletes

實(shí)驗(yàn)組人員的IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α含量均處于標(biāo)準(zhǔn)參考值范圍內(nèi)，與對(duì)照組人員相比，顯著高于對(duì)照組人員，P＜0.05，差異顯著。

2.6安全性分析

參與實(shí)驗(yàn)的小鼠和運(yùn)動(dòng)員均未發(fā)生任何不良反應(yīng)事件，證明實(shí)驗(yàn)具有足夠的安全性。

3討論

隨著我國(guó)居民收入水平提高，對(duì)生活質(zhì)量和身體健康的期望也逐日增加，人們?cè)谫?gòu)買飲品時(shí)不僅考慮其口感、營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)對(duì)其功能性要求逐漸增高。運(yùn)動(dòng)功能多糖飲品廣泛采取天然活性多糖作為原料，具有多種功能活性，已經(jīng)成為市場(chǎng)上備受追捧的熱點(diǎn)。在本研究中，通過小鼠實(shí)驗(yàn)和運(yùn)動(dòng)員自愿者實(shí)驗(yàn)，證明我們制備的絞股藍(lán)多糖運(yùn)動(dòng)飲品在保證安全性的前提下，可以有效激活經(jīng)過運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練小鼠的免疫系統(tǒng)，同時(shí)對(duì)運(yùn)動(dòng)員自愿者的淋巴細(xì)胞、免疫球蛋白和細(xì)胞因子含量較對(duì)照組人員明顯改善。

[1]田峰.對(duì)中樞與外周運(yùn)動(dòng)性疲勞的再認(rèn)識(shí)[J].中國(guó)組織工程研究, 2015(42):6849-6854

[2]顧久賢,王為民.梅花鹿茸提取物對(duì)緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用[J].華僑大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,37(2):230-233

[3]吳振.富含支鏈氨基酸的低膽固醇雞蛋粉沖調(diào)飲品的研制[J].肉類研究,2010(6):82-85

[4]張濤,張育松,袁弟順,等.微波水提絞股藍(lán)保健成分的研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,30(5):903-907

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[6]李雅晶,茹建甫.絞股藍(lán)復(fù)合液對(duì)小鼠抗運(yùn)動(dòng)疲勞能力的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(29):14200-14201

[7]周石瓊,盧俊求,李桂芝,等.絞股藍(lán)多糖對(duì)小鼠胸腺和脾臟影響的研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,52(17):4156-4160

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Development and Immune Regulating Function Analysis of Gynostemma Pentaphyllum Polysaccharides Sport Drink

WANGZhi-min
（Huanghe S&TCollege，Zhengzhou 450063，Henan，China）

Gynostemma pentaphyllum could relieve the exercise-induced fatigue effectand enhancing the level of immunity after exercise，and thathad the potential value for sports drink development.In this study，a sport drink based on the Gynostemma pentaphyllum polysaccharide had been developed.Bymouse sportsexperiment and the athlete volunteer sportsexperiment，thathad proved that the effectof activating the immune state and improved the human immune levelofsports drinks.The Gynostemma pentaphyllum polysaccharides sportdrink had obviousapplication value，itwasworth vigorously developed andwidely promoted.

Gynostemmapentaphyllum；polysaccharide；sportsdrink；immunity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.044

2016-10-20

王志敏（1979—），男（漢），講師，碩士，研究方向：體育教育訓(xùn)練學(xué)。