施伽+楊浩+楊思文+李麗

摘 要：該文采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化黃精多糖脫除蛋白的最佳條件。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蛋白脫除時(shí)間、三氯乙酸濃度、蛋白脫除溫度、蛋白質(zhì)濃度為自變量，以黃精多糖中蛋白脫除率為考察指標(biāo)，通過L9（34）正交試驗(yàn)得出黃精多糖蛋白脫除率的最佳工藝條件為：蛋白脫除時(shí)間40min、三氯乙酸濃度6%、蛋白脫除溫度80℃、蛋白質(zhì)濃度0.11mg/mL，在該條件下黃精多糖蛋白的脫除率為93.51%。

關(guān)鍵詞：黃精多糖；三氯乙酸法；蛋白脫除

中圖分類號 TS252.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）06-0029-03

Deproteinization of Polygonatum Polysaccharide by Trichloroacetic Acid

Shi Jia et al.

（Tongren University，Tongren554300，China）

Abstract：Optimization of the optimum conditions for deproteinization of polygonatum polysaccharide by orthogonal design.Orthogonal design was employed to evaluate the significance of four crucial variables including reaction time，concentration of trichloroacetic acid，deproteinization temperature，protein concentration，and to determine the effect of prime factors on the rate of deproteinization.The optimum conditions were reaction time 40min，concentration of trichloroacetic acid 6%，deproteinization temperature 80℃，and protein concentration 0.11mg/mL.Under these conditions，the rate of deproteinization was 93.51%.

Key words：Polygonatum polysaccharide；Trichloroacetic acid；Deproteinization

黃精又名老虎姜、雞頭參、玉竹[1]，為百合科黃精屬多年生草本植物，在我國主要產(chǎn)于云南、貴州、四川、廣西等地，已有2 000多年的藥用歷史[2-4]。黃精多糖是黃精重要的活性成分之一，含量達(dá)到17.79%，具有降血糖、降血壓、調(diào)脂等生理功能[5]。傳統(tǒng)方法提取的黃精多糖，殘留有一定的蛋白，分離蛋白的方法主要有：乙醇醇沉法、大孔樹脂吸附法、三氯乙酸法、Sevag法及酶法脫蛋白等[6]，其中三氯乙酸法脫蛋白效果好，但容易引起多糖損失[7-8]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 新鮮黃精，二年生，采于銅仁市印江縣梵凈山下，在55℃烘箱烘中干燥至恒重后，用鋼磨打粉機(jī)粉碎為粉末后備用。無水乙醇，三氯乙酸，磷酸，乙醚（均為分析純）。牛血清蛋白（購于源葉生物），考馬斯亮蘭（購于Solarbio）。

1.2 儀器與設(shè)備 分光光度計(jì)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，高速離心機(jī)，鋼磨打粉機(jī)，索式提取器。

1.3 方法

1.3.1 黃精多糖的提取 改進(jìn)徐渭沉[9-11]等多糖提流程：準(zhǔn)確稱量10g黃精粉末用乙醚回流2h脫脂后取渣，于50℃干燥黃精渣，用于多糖的提取，熱水提取多糖條件：溫度80℃，固液比1∶15，提取時(shí)間4h，提取次數(shù)1次，提取結(jié)束后。用高速離心機(jī)8 000r/min離心10min后取其上清液，在80℃濃縮至20mL，加入5倍95%的乙醇，醇沉過夜，通過離心機(jī)離心取其沉淀，制得黃精多糖溶液備用。

1.3.2 黃精多糖的蛋白質(zhì)測定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 采用考馬斯亮藍(lán)法[12-13]。（1）考馬斯亮蘭G-250染料試劑（0.1mg/mL）：稱0.01g考馬斯亮蘭G-250，溶于5mL、95%的乙醇，再在乙醇溶液中加入10mL、85%的磷酸，用蒸餾水溶解定容于100mL棕色容量瓶后過濾備用。（2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（0.1mg/mL）：稱0.01g牛血清蛋白，加水稀釋至100mL。精確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL于10mL試管中，加入5mL考馬斯亮蘭G-250染料試劑然后定溶至6mL靜至3min備用。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別在595nm處測出吸光度[14-15]，以吸光度值為縱坐標(biāo)（Y），以牛血清蛋白質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)（X），生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=6.4962x+0.0028，相關(guān)系數(shù)為0.9959，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合度良好，表明測定吸光度與牛血清蛋白濃度呈良好的線性關(guān)系，如圖1所示。

1.3.2.2 黃精多糖中的蛋白質(zhì)的測定 取1mL多糖溶液于試管中，加入5mL考馬斯亮蘭G-250染料試劑，靜置3min后，用分光光度計(jì)在595nm處測定其吸光度值。將吸光度值帶入回歸方程y=6.492x+0.0028中計(jì)算出多糖溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量，并計(jì)算蛋白脫除率。

1.3.3 黃精多糖脫除蛋白條件單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 蛋白脫除時(shí)間選擇試驗(yàn) 準(zhǔn)確量取蛋白質(zhì)濃度為0.06mg/mL的多糖溶液10mL，脫蛋白溫度為70℃，加入濃度為6%三氯乙酸3mL，考察脫蛋白時(shí)間為10min、20min、30min、40min、50min條件下多糖蛋白脫除率。

1.3.3.2 三氯乙酸濃度選擇試驗(yàn) 蛋白脫除溫度為70℃，脫蛋白時(shí)間為30min，加入三氯乙酸3mL，考察三氯乙酸濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%條件下多糖的蛋白脫除率。

1.3.3.3 蛋白質(zhì)濃度選擇試驗(yàn) 準(zhǔn)確量取不同濃度的蛋白質(zhì)多糖溶液10mL，溫度為70℃，時(shí)間為30min，加入濃度為6%三氯乙酸3mL，考察蛋白質(zhì)濃度分別為0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL條件下多糖蛋白脫除率。

1.3.3.4 脫除蛋白溫度選擇試驗(yàn) 準(zhǔn)確量取蛋白質(zhì)濃度為0.06mg/mL的多糖溶液10mL，脫蛋白時(shí)間為30min，加入濃度為6%三氯乙酸3mL，考察脫蛋白溫度為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃條件下多糖蛋白脫除率。

1.3.3.5 正交試驗(yàn)法優(yōu)化黃精多糖脫蛋白條件 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以脫蛋白時(shí)間、脫蛋白溫度、蛋白質(zhì)濃度、三氯乙酸濃度作為研究的4因素，每因素取3個(gè)水平，以黃精多糖脫蛋白作為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫蛋白時(shí)間對蛋白脫除率的影響 由圖2得出，隨著脫蛋白時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)脫除率呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)脫蛋白時(shí)間在10～40min范圍時(shí)隨著時(shí)間的的延長蛋白質(zhì)脫除率逐漸增加，在40min時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率有了顯著的提高（P<0.05），達(dá)到最大值82.49%。之后隨著時(shí)間的增長，蛋白脫除率逐漸降低，所以蛋白脫除時(shí)間不宜過長。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用30、40、50min進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.2 三氯乙酸濃度對蛋白脫除率的影響 由圖3得出，隨著三氯乙酸濃度的增加，蛋白脫除率逐漸增大，在6%時(shí)，有顯著提升（P<0.05），隨著三氯乙酸濃度繼續(xù)升高，蛋白脫除率不再有顯著的變化。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用4%、6%、8%進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.3 蛋白質(zhì)濃度對蛋白脫除率的影響 由圖4可得出，隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，蛋白質(zhì)脫除率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度上升至0.07mg/mL時(shí)，脫除率有了顯著的提高，但隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，脫除率逐漸降低，脫除率顯著下降（p<0.05）。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用0.06、0.07、0.08mg/mL進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.4 溫度對蛋白脫除率的影響 由圖5可得出，隨著溫度的增加，蛋白質(zhì)脫除率呈先升后降的趨勢，當(dāng)脫蛋白溫度為70℃時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到最大值為80.95%，當(dāng)溫度高于70℃后蛋白質(zhì)脫除率逐漸降低。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用60、70、80℃進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.5 最佳工藝條件的確定 由表2正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析可以看出，蛋白脫除條件為A2B2C3D3時(shí)，即脫蛋白時(shí)間為40min、三氯乙酸濃度為6%、脫蛋白溫度為80℃、蛋白質(zhì)濃度為0.11mg/mL，黃精多糖蛋白的蛋白質(zhì)脫除率效果最佳。且由極差分析可知，各因素對黃精多糖蛋白的蛋白質(zhì)脫除率效果影響的主次順序?yàn)椋篋>C>B>A，即蛋白質(zhì)濃度>脫蛋白溫度>三氯乙酸濃度>脫蛋白時(shí)間。其中由方差分析結(jié)果可知，脫蛋白時(shí)間這一因素對多糖提取率有顯著的影響（p<0.05）。正交試驗(yàn)使黃精多糖中蛋白質(zhì)的脫除工藝得到了優(yōu)化，最優(yōu)組合為A2B2C3D3。由于最優(yōu)組在正交實(shí)驗(yàn)中沒有出現(xiàn)，所以進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)分析所得出的提取條件，進(jìn)行了3次重復(fù)試驗(yàn)，平均蛋白脫除率為 93.51%，高于單因素實(shí)驗(yàn)的提取得率，表明此優(yōu)化工藝可行。

3 結(jié)論

通過單因素及L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，確定了三氯乙酸法脫除黃精多糖中蛋白質(zhì)的最佳條件為三氯乙酸濃度6%，脫除時(shí)間40min，脫除溫度80℃，蛋白質(zhì)濃度0.08mg/mL，此條件下黃精多糖中蛋白的脫除率達(dá)93.51%，是一種效率高、試劑用量少的脫除黃精多糖蛋白質(zhì)的有效方法。

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