蘇 華 羅兆飛＊ 覃艷淑 韋梅良 李 娟

（1.廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心南寧530021；2.廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心南寧530021）

傾注法與涂布法對(duì)蜂蜜中嗜滲酵母計(jì)數(shù)的比較分析

蘇 華1羅兆飛1＊覃艷淑2韋梅良1李 娟1

（1.廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心南寧530021；2.廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心南寧530021）

本研究旨在建立準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定的檢測(cè)蜂蜜中嗜滲酵母計(jì)數(shù)的分析方法。分別采用GB 14963-2011中嗜滲酵母計(jì)數(shù)的涂布方法以及GB 4789.2-2010中菌落總數(shù)測(cè)定的傾注法，對(duì)蜂蜜樣品中的嗜滲酵母計(jì)數(shù)。并通過(guò)以上兩種不同方式對(duì)不同溫度下儲(chǔ)藏的蜂蜜樣品進(jìn)行比較試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一樣品、同一稀釋度、同樣的培養(yǎng)條件下，使用傾注法測(cè)得的嗜滲酵母數(shù)量比涂布法更多，差異極顯著（P＜0.01）。對(duì)經(jīng)不同溫度下儲(chǔ)藏的蜂蜜樣品進(jìn)行嗜滲酵母計(jì)數(shù)，各濃度條件下傾注法計(jì)數(shù)結(jié)果比涂布法更多，差異極顯著（P＜0.01）。

傾注法涂布法嗜滲酵母計(jì)數(shù)蜂蜜

GB14963-2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)蜂蜜》于2011年10月20日開(kāi)始實(shí)施，它代替了GB14963-2003《蜂蜜衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》以及GB18796-2005《蜂蜜》中的對(duì)應(yīng)指標(biāo)，并且在微生物限量中增加了嗜滲酵母計(jì)數(shù)限量[1-2]。在蜂蜜水分含量超過(guò)20%時(shí)，其存在的嗜滲酵母容易大量繁殖起來(lái)，造成蜂蜜酸敗，同時(shí)產(chǎn)生的二氧化碳使得盛裝蜂蜜的密閉容器氣壓過(guò)大，有發(fā)生容器爆破和蜂蜜外泄的風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。因此，新的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)增加嗜滲酵母計(jì)數(shù)限量要求，也是進(jìn)一步提高蜂蜜產(chǎn)品安全性的需要。

目前，針對(duì)嗜滲酵母計(jì)數(shù)的檢測(cè)，主要依據(jù)GB14963-2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)蜂蜜》附錄A規(guī)定的方法進(jìn)行。該方法采用的是常規(guī)取樣稀釋后，再進(jìn)行平板涂布培養(yǎng)，即在每個(gè)平板表面接種0.1mL，用無(wú)菌L型涂布棒進(jìn)行涂布，選擇菌落數(shù)量在15～150個(gè)的平板計(jì)數(shù)菌落數(shù)量[1]。樣品的最高稀釋度只能達(dá)到10-2，而GB 14963-2011中嗜滲酵母限量為≤200 CFU/g，一旦在10-2稀釋度平板上長(zhǎng)出3～14個(gè)菌落，檢測(cè)結(jié)果為超標(biāo)結(jié)果，而這些數(shù)值恰恰不在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定“選擇菌落數(shù)量在15～150個(gè)的平板，計(jì)數(shù)菌落數(shù)量”的要求中，意味著檢測(cè)過(guò)程偏離標(biāo)準(zhǔn)要求，給檢測(cè)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)及判斷評(píng)判帶來(lái)較大的風(fēng)險(xiǎn)，也給監(jiān)督執(zhí)法部門(mén)的公正執(zhí)法帶來(lái)了技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。此外，筆者在實(shí)際操作過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)該方法有操作繁瑣、同稀釋度培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果平行性差等問(wèn)題。因此，迫切需要對(duì)蜂蜜中嗜滲酵母的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

本研究擬通過(guò)先行常用的菌落計(jì)數(shù)方法--傾注法與GB14963-2011附錄A的涂布法進(jìn)行比較分析，尋找更加準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品來(lái)源購(gòu)自當(dāng)?shù)胤涿奂庸て髽I(yè)原料基地。

1.1.2 儀器恒溫培養(yǎng)箱、冰箱（2～5℃）、無(wú)菌均質(zhì)袋和均質(zhì)器、電子天平、無(wú)菌試管（18 mm× 180mm）、無(wú)菌吸管（1mL，具0.01 mL刻度；10 mL，0.1 mL刻度）、無(wú)菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌L型涂布棒、顯微鏡（10×～100×）。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑30%葡萄糖溶液（pH 6.5± 0.5）、氯硝胺18%甘油（DG18）瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 取樣以無(wú)菌操作在天平上稱(chēng)取固體或液體檢樣25 g，加入30%葡萄糖稀釋液225 g，用拍擊式均質(zhì)袋拍擊2min，制備成1∶10均勻稀釋液。

1.2.2 梯度稀釋用滅菌吸管吸取1∶10稀釋液1 mL，注入含有9 mL 30%葡萄糖稀釋液的試管內(nèi)，置于漩渦混懸儀上混勻，制備1∶100稀釋液。另取1mL滅菌吸管，按前述操作依次制備10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1 mL滅菌吸管。

1.2.3 涂布法根據(jù)對(duì)檢樣污染情況的估計(jì)，選擇2～3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，接種0.1 mL稀釋液于DG18瓊脂平板上，接著用無(wú)菌的L型涂布棒進(jìn)行瓊脂表面涂布，接種2個(gè)平板。同時(shí)在1個(gè)DG18瓊脂平板表面接種0.1 m L稀釋液作為空白對(duì)照。

1.2.4 傾注法按照GB 4789.2-2010《菌落總數(shù)測(cè)定》[5]，選擇2～3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，在每個(gè)培養(yǎng)皿接種1 mL，將15～20 mL冷卻至40℃左右的DG18培養(yǎng)基傾注到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。同時(shí)接種1mL稀釋液作為空白對(duì)照。

1.2.5 培養(yǎng)接種完成后盡快將全部平板置25℃± 1℃恒溫箱內(nèi)避光培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)勿翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿。為防止出現(xiàn)霉菌過(guò)度生長(zhǎng)蔓延而掩蓋目標(biāo)菌落，培養(yǎng)48 h后即開(kāi)始每日觀察平板上真菌生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)7 d結(jié)束。

1.2.6 菌落計(jì)數(shù)選擇菌落數(shù)量在15～150個(gè)的平板，計(jì)數(shù)菌落數(shù)量。如出現(xiàn)霉菌菌落干擾時(shí)，不應(yīng)計(jì)數(shù)絲狀菌落。

2 結(jié)果

2.1 涂布法和傾注法進(jìn)行蜂蜜中嗜滲酵母計(jì)數(shù)對(duì)同一蜂蜜樣品分別采用涂布法和傾注法檢測(cè)嗜滲酵母的數(shù)量，選擇菌落數(shù)在15～150個(gè)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。結(jié)果顯示（見(jiàn)表1），傾注法檢出嗜滲酵母的數(shù)量要高于涂布法的檢出量，差異極顯著（P＜0.01），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖1為兩種方法檢測(cè)蜂蜜中嗜滲酵母數(shù)量較典型的平板結(jié)果。

2.2 不同溫度儲(chǔ)藏下，蜂蜜中嗜滲酵母數(shù)量的變化分別無(wú)菌稱(chēng)取25 g蜂蜜樣品原料于無(wú)菌均質(zhì)袋中，綁好無(wú)菌均質(zhì)袋口，分別置于4℃、25℃、30℃、37℃、42℃環(huán)境下儲(chǔ)藏48 h，接著無(wú)菌加入225 g 30%葡萄糖溶液，測(cè)定蜂蜜中嗜滲酵母的數(shù)量。結(jié)果見(jiàn)表2、圖2-圖3，儲(chǔ)藏溫度在25～37℃時(shí)，嗜滲酵母的增殖速度加快，但是≥42℃后，嗜滲酵母的死亡率急劇加快。而相應(yīng)溫度下傾注法的嗜滲酵母計(jì)數(shù)結(jié)果比涂布法更多，4℃、25℃、30℃、37℃、42℃下，涂布法與傾注法間存在極顯著差異（P＜0.01）。

表1 涂布法和傾注法檢測(cè)蜂蜜中嗜滲酵母的結(jié)果

圖1 涂布法和傾注法蜂蜜中嗜滲酵母平板結(jié)果

表2 不同溫度儲(chǔ)藏下，涂布法和傾注法蜂蜜中嗜滲酵母檢測(cè)結(jié)果

圖2 不同溫度儲(chǔ)藏下，涂布法和傾注法檢測(cè)蜂蜜中嗜滲酵母數(shù)量的變化

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)涂布法和傾注法比較蜂蜜中嗜滲酵母計(jì)數(shù)結(jié)果的差異，得出以下結(jié)果。

1）同一樣品、同一稀釋度、同樣的培養(yǎng)條件下，使用傾注法所測(cè)得的嗜滲酵母數(shù)量比涂布法更多，差異極顯著（P＜0.01）。

2）涂布法操作過(guò)程中，由于每個(gè)平板上加入的樣品稀釋液體積僅為0.1 mL，吸樣過(guò)程使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定1 mL吸管吸取，容易產(chǎn)生吸量誤差；此外，使用涂布棒進(jìn)行涂布的過(guò)程中，涂布棒本身會(huì)吸取一定量的樣品稀釋液，且涂布過(guò)程由于涂布棒的不均勻吸附效應(yīng)，造成實(shí)際樣品體積小于0.1 m L，且每個(gè)平板間存在偏差。上述兩步操作后，引起實(shí)際能夠用于培養(yǎng)的樣品稀釋液體積產(chǎn)生了較大的偏差，因而造成涂布法計(jì)數(shù)結(jié)果偏低、且同一稀釋度的兩個(gè)平板計(jì)數(shù)結(jié)果較難平行。

3）采用傾注法進(jìn)行測(cè)定的過(guò)程，由于使用1 mL吸管吸取1 mL樣品稀釋液，傾注的體積較涂布法多，且更容易移液準(zhǔn)確，操作過(guò)程造成的樣品稀釋液體積偏差較小，因此，檢測(cè)結(jié)果更能夠?qū)嶋H反映樣品中嗜滲酵母的數(shù)量，結(jié)果更具有代表性。

4）通過(guò)不同溫度儲(chǔ)藏蜂蜜樣品的比較試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蜂蜜在不同溫度儲(chǔ)藏下，儲(chǔ)藏溫度在25～37℃時(shí)，嗜滲酵母的增殖速度加快，但是≥42℃后，嗜滲酵母的存活率急劇下降，大部分嗜滲酵母不能長(zhǎng)時(shí)間耐受超過(guò)42℃的溫度，這也許是當(dāng)時(shí)制定國(guó)標(biāo)方法考慮使用涂布法的原因，是為了防止傾注的培養(yǎng)基會(huì)殺滅樣品中的嗜滲酵母。而本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，在使用傾注法操作過(guò)程中，培養(yǎng)基溫度雖然在45℃左右，但屬于短時(shí)間的高溫作用于樣品，且對(duì)嗜滲酵母的殺滅作用還受到其本身對(duì)溫度的耐受能力、蜂蜜中的水分和糖類(lèi)等導(dǎo)熱介質(zhì)的影響，未產(chǎn)生對(duì)嗜滲酵母的殺滅作用。對(duì)經(jīng)不同溫度下儲(chǔ)藏的蜂蜜樣品進(jìn)行嗜滲酵母計(jì)數(shù)，各濃度條件下傾注法計(jì)數(shù)結(jié)果比涂布法更多，也更穩(wěn)定可靠。

圖3 不同溫度儲(chǔ)藏下，涂布法和傾注法蜂蜜中嗜滲酵母平板結(jié)果

綜上所述，蜂蜜中嗜滲酵母計(jì)數(shù)方法的比較結(jié)果表明，傾注法比涂布法更加準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，更能確保公正地執(zhí)行GB14963-2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)蜂蜜》的限量要求，最大可能減少監(jiān)督執(zhí)法檢測(cè)過(guò)程中對(duì)企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量的誤判，同時(shí)建議對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)附錄A的方法進(jìn)行修訂，以保護(hù)各相關(guān)方的利益。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB14963-2011食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-蜂蜜[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2011.

[2]張敬惠.對(duì)新的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-蜂蜜GB14963-2011的解讀[J].蜜蜂雜志,2012(3):36.

[3]魏穎.蜂蜜國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)探討[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2015,41(1): 235-239.

[4]尤守智,蔣波.蜂蜜結(jié)晶與發(fā)酵問(wèn)題解析[J].中國(guó)蜂業(yè), 2008,59(3):30.

[5]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB4789.2-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2011:2.

Com parative analysis of the osmophilic yeast counting in honey by pouring method and coatingmethod

Su Hua1Luo Zhaofei1*Qin Yanshu2WeiMeiliang1Li Juan1
（1.Guangxi entry-exit inspection and quarantine inspection and quarantine technology center,Nanning 530021; 2.Guangxi-ASEAN food and drug safety inspection and testing center,Nanning 530021）

The aim of this study was to establish an accurate,reliable and stablemethod for the detection of osmophilic yeast in honey. The coatingmethod(GB 14963-2011)and the pouringmethod(GB 4789.2-2010)were used to detect the osmophilic yeast in honey. And using the two kind ofmethods to detect and analyze the osmophilic yeast in honey samples thatwere stored at different temperatures.The results showed that,for the same dilution ratio of the same sample,the number of osmophilic yeast in honey detected by pouringmethod was higher than that detected by coatingmethod in the same culture conditions,the difference was significant(P＜0.01).For the honey samples which were stored under different temperatures,the number of osmophilic yeast in honey detected by pouringmethod was higher than that detected by coatingmethod in the same dilution ratio,and the differencewas significant(P＜0.01).

Pourmethod Coatingmethod Osmophilic yeast Honey

A

1003-4331（2017）02-0009-04

廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局項(xiàng)目資助（食品檢驗(yàn)復(fù)檢路徑的設(shè)計(jì)與應(yīng)用）。

蘇華（1991-），女，碩士，助理工程師，主要從事微生物檢驗(yàn)工作。E-mail:1932196279@qq.com。

＊通信作者：羅兆飛（1979-），男，碩士，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事食品檢驗(yàn)工作。E-mail:975558@qq.com。