李 娜，顏冬梅＊＊，張金蓮，高秀梅

（1. 江西中醫(yī)藥大學藥學院 南昌 330004；2. 天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院 天津 300193）

炮制方法對補骨脂中抗骨質疏松效應成分含量的影響＊

李 娜1，顏冬梅1＊＊，張金蓮1，高秀梅2

（1. 江西中醫(yī)藥大學藥學院 南昌 330004；2. 天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院 天津 300193）

目的：探討不同炮制方法對補骨脂中抗骨質疏松有效成分含量的影響。方法：采用HPLC法測定補骨脂生品及不同炮制品中香豆素類、黃酮類、單萜酚類抗骨質疏松效應成分的含量，對炮制前后三類成分的含量進行統(tǒng)計分析。結果：補骨脂經(jīng)不同方法炮制后三類成分含量與生品相比均有極顯著變化。結論： 藥典收載的炮制法可同時提高三類化合物的含量，可能增強其治療骨質疏松的作用，與中醫(yī)認為“鹽炙能增強溫補脾腎的作用”的傳統(tǒng)觀念相吻合。

補骨脂 炮制 抗骨質疏松效應成分 影響

補骨脂為豆科植物補骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果實，其性溫，味辛，具有補腎固精，縮尿止帶，溫脾止瀉，固沖安胎之功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，補骨脂主要含有苯并呋喃苷、香豆素、黃酮、單萜酚類等成分[2]。在臨床應用方面，歷代醫(yī)家廣泛將其用于各類補腎健骨方中，治療骨質疏松癥[3，4]。現(xiàn)代藥理研究顯示，補骨脂可通過調節(jié)骨轉化，促進成骨細胞增殖活性、抑制破骨細胞的重吸收，從而對骨質疏松起到一定防治作用[5-8]。本課題組前期研究顯示，香豆素類、黃酮類和酚類化合物能激動ERα、ERβ受體[9]，而ERα與ERβ受體均參與了骨質的重建[10]。因此，三類化合物的含量高低將影響補骨脂在治療骨質疏松癥中的效應。

然而，南北朝劉宋時代的《雷公炮炙論》記載補骨脂“性本大燥，毒”，說明其雖有溫腎助陽之功效，但不宜久服，入藥均需經(jīng)過炮制，至今臨床所用補骨脂也均以炮制品為主，而補骨脂的炮制方法始載于《雷公炮炙論》：酒浸蒸以除燥毒[11，12]。后世醫(yī)藥學家在醫(yī)療實踐中繼承和發(fā)展了雷公法，發(fā)展出蒸、浸、炒、焙、煮、藥汁制等多種炮制方法[13]。因此，補骨脂炮制品種較多，古今主要炮制方法包括雷公法、酒浸炒、清炒法、鹽炙法、蒸法[14]。目前為止，對于炮制方法對補骨脂中不同類化學成分的影響，宋瀟和王增繪等[15，16]對此做了一定工作，兩者的研究均認為炮制能夠改變補骨脂中效應成分的含量，但未充分解釋治療骨質疏松癥的處方（如壯骨關節(jié)丸）選擇鹽炙品的原因。基于此，本實驗擬采用HPLC法測定補骨脂炮制前后香豆素類（補骨脂素、異補骨脂素）、黃酮類（新補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮、異補骨脂查耳酮、Corylifol A）和酚類（補骨脂酚）化合物的含量，比較不同炮制方法對補骨脂各類成分含量的影響，為各類炮制品的臨床應用提供數(shù)據(jù)參考。

1 實驗材料

DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀，自帶Ultimate 3000型自動進樣器、 Ultimate 3000型二極管陣列檢測器（美國DIONEX公司）；BT224S型萬分之一天平（瑞士Sartoris公司）；Mettle AE24型十萬分之一天平（瑞士Sartoris公司）；KQ-3200型超聲清洗器（中國浙江昆山市超聲儀器有限公司）；YF-111型二兩裝高速中藥粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）；SZ-93型自動雙重純水蒸餾器（上海雅榮生化儀器設備有限公司）。

補骨脂藥材購自江西樟樹藥材市場（產(chǎn)地：河南），經(jīng)江西中醫(yī)藥大學付曉梅副教授鑒定為豆科植物補骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果實。補骨脂素（10070-201302）、異補骨脂素（10521-201302）、異補骨脂查耳酮（493-201304）、補骨脂二氫黃酮（20494-201304）、Corylifol A（20495-201304）、新補骨脂異黃酮（20492-201304）及補骨脂酚（20491-201302）均購自江西南昌貝塔生物技術有限公司，純度＞98%；乙腈（德國Merck公司）、甲酸均為色譜純（美國Fisher公司）；陳年塔牌紹興花雕酒（浙江塔牌紹興酒有限公司，酒精度≥15.5%，酒齡1-3年）；精制深井鹽（江西省鹽業(yè)公司）。

2 實驗方法與結果

2.1 不同炮制品的制備

2.2.1 酒浸炒

取凈制補骨脂500 g，用1 500 mL黃酒浸泡一天，過濾，瀝干，分次加入鐵鍋中（每次約50 g），用文火炒至微黃，膨脹，有香氣，迸裂。取出，放涼，即得。

2.1.2 藥典法

取凈制補骨脂500 g，加入20%食鹽溶液，悶潤4 h，分次加入鐵鍋中（每次約100 g），用文火炒至微黃，膨脹，有香氣，迸裂。取出，放涼，即得。（100 kg藥材用2 kg食鹽）。

2.1.3 蒸法

按照廣州的方法，取補骨脂 500 g加鹽水（鹽l2 g -l00 mL）悶潤過夜，蒸2 h。

2.1.4 清炒法

取凈制補骨脂500 g，分次加入鐵鍋中（每次約100 g），用文火炒至微黃，膨脹，有香氣，迸裂。取出，放涼，即得。

2.1.5 雷公法

取凈制補骨脂500 g，先用1 500 mL黃酒浸泡1天，濾去黃酒，加入1 500 mL清水浸泡3天，過濾，瀝干，置于鍋中，隔水蒸6 h，取出，曬干，即得。

以上炮制品分別置搪瓷盤中，充分晾干，置干燥器備用。

2.2 色譜條件

Hypersil ODS2（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0-30 min，90%-50% A；30-45 min，50%-40% A；45-55 min，40%-30% A；55-60 min，30%-20% A，保持2 min，樣品分析結束后平衡15 min；流量體積：1 mL·min-1；檢測波長：246 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。實驗結果見圖1。

2.3 對照品儲備液的配制

精密稱取適量補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮、異補骨脂查耳酮、Corylifol A和補骨脂酚標準品，用甲醇配成濃度分別為3.008、2.848、1.556、0.780、1.772、1.286、15.00 mg·mL-1的溶液，上述儲備液均置于棕色容量瓶中，并于4 ℃保存。

2.4 供試品溶液的制備

補骨脂藥材粉碎過100目篩，精密稱取0.1 g置10 mL容量瓶中，加9 mL甲醇超聲提取30 min（室溫），定容至10 mL，取部分溶液于離心機中，室溫下12 000 rpm離心10 min，移取上層有機相2 mL，稀釋至10 mL，取上清液20 μL注入HPLC色譜儀，記錄相應化合物的峰面積。

2.5 線性關系和檢出限考察

分別準確移取“2.3”項對照品儲備液適量，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋，制得混合對照品溶液，其中補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮、異補骨脂查耳酮、Corylifol A和補骨脂酚的濃度分別為300.8、284.8、155.6、78、177.2、128.64、1 500 μg·mL-1，并逐級稀釋成一系列不同濃度的對照品溶液，進樣20 μL測定。以對照品濃度X（μg·mL-1）對峰面積Y進行線性回歸；以信噪比3為檢出限，實驗結果見表1。結果表明，7個化合物在各自的濃度范圍內線性關系良好。

2.6 精密度考察

取同一濃度的混合對照品溶液20 μL，按“2.2”項所述色譜條件連續(xù)進樣6次測定，補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮、異補骨脂查耳酮、Corylifol A和補骨脂酚峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為 1.96%、1.99%、2.03%、2.02%、1.87%、2.35%和1.74%，表明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

圖1 混合對照品（A）和供試品（B）

表1 補骨脂中7個化合物的回歸方程、相關系數(shù)和檢測限

取同一補骨脂炮制品供試品溶液，按“2.4”供試品溶液制備方法處理，分別于0、2、6、12、24、48 h進樣20 μL測定，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮、異補骨脂查耳酮、Corylifol A和補骨脂酚峰面積的RSD分別為2.72%、2.58%、2.49%、2.62%、2.44%、2.37%和2.03%。結果表明，供試品溶液室溫放置48 h基本穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

取同一補骨脂炮制品粉末0.1 g，按“2.4”供試品溶液制備方法平行處理5份，按“2.2”項所述色譜條件分別進樣測定，記錄補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮、異補骨脂查耳酮、Corylifol A和補骨脂酚的峰面積，RSD分別為2.43%、2.29%、2.76%、2.87%、2.65%、2.58%和1.91%。

2.9 加樣回收率試驗

取蒸法補骨脂炮制品粉末0.05 g，共6份，分別準確加入與樣品中含量相當?shù)难a骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮、異補骨脂查耳酮、Corylifol A和補骨脂酚對照品儲備液，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，計算加樣回收率（表2）。

2.10 樣品含量測定

分別稱取補骨脂生品及不同炮制品粉末約0.1 g，按“2.4”項方法制備供試品溶液，每批平行處理兩份，按“2.2”項下色譜條件測定。計算樣品中各成分的含量，實驗結果見表3。所有的實驗數(shù)據(jù)均以ˋx表示，采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件繪制各化合物含量柱狀圖（圖2）。

2.11 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件，對各炮制品的香豆素類化合物（補骨脂素和異補骨脂素含量的平均值）、黃酮類化合物（新補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮、異補骨脂查耳酮、Corylifol A含量的平均值）及單萜酚化合物（補骨脂酚的含量）的含量進行主成分分析，綜合主成分值分別為：生品-0.279 13、酒浸炒品1.619 66、藥典法品（鹽炙品）0.686 69、蒸法品-1.137 16、清炒品-0.18 235、雷公制品-0.70 771（表3）。由此可知，酒浸炒法和藥典法對三類成分都為正影響，而其他炮制方法對三類成分的影響不一致。

表2 補骨脂中7個化合物的加樣回收率（n=6）

圖2 補骨脂不同炮制品中7個化合物的含量（±s，n=3）

2.12 實驗結果

綜合以上分析可知，補骨脂經(jīng)不同方法炮制后各類成分含量均有變化：酒浸炒法、藥典法、清炒法和雷公法炮制后香豆素類化合物的總含量極顯著升高，順序為酒浸炒法＞雷公法＞清炒法＞藥典法＞生品，但蒸法使香豆素類化合物的總含量極顯著降低；對于黃酮類化合物，酒浸炒法和藥典法使其總含量顯著升高，順序為酒浸炒法＞藥典法＞生品，而蒸法、清炒法和雷公法使其極顯著降低，降低程度順序為雷公法＞清炒法＞蒸法；而酚類化合物，酒浸法、藥典法和清炒法使其含量顯著升高，順序為清炒法＞酒浸法＞藥典法＞生品，但蒸法和雷公法使其顯著性降低，且雷公法降低幅度大于蒸法。從以上分析可以得出以下結論：目前所采用的6種炮制方法中，綜合三類化合物的含量來看，唯有藥典法即鹽炙法和酒浸炒法對三類化合物的含量均具升高作用，這與王增繪等[16]的研究結果有一點不同，該研究結果顯示鹽炙使補骨脂酚含量明顯下降。

3 討論

從古至今，補骨脂在臨床被歷代醫(yī)家廣泛用在治療骨質疏松癥的各類補腎健骨方中[3，4]。現(xiàn)代藥理研究顯示，補骨脂可通過調節(jié)骨轉化，促進成骨細胞增殖活性、抑制破骨細胞的重吸收，從而對骨質疏松起到一定防治作用[5-8]。相關研究發(fā)現(xiàn)，ERα與ERβ受體在骨質疏松癥的治療中都參與了骨質的重建[10]。而補骨脂所含的化學成分能激動ERα與ERβ受體，按激動受體類型不同可分為兩類：選擇性激動ERα受體的和同時激動ERα和ERβ受體，但對ERβ的激動作用大于ERα的，第一類主要是香豆素類化合物，第二類包括黃酮類和酚類化合物[9]。本課題組前期研究顯示，補骨脂酚在補骨脂中所占比例達4%左右，黃酮類成分占2%左右[17]，兩者在治療骨質疏松癥中發(fā)揮的作用是不容忽視的。

表3 各位化合物含量值及主成分分析綜合主成分值

本研究的實驗結果顯示，要使補骨脂在治療骨質疏松癥中發(fā)揮最大藥效，即要求所采用的炮制方法能使香豆素類、黃酮類、單萜酚類化合物的含量升高。而煎煮溶劑的選擇對化合物的煎出率影響較大。補骨脂湯劑（水煎煮）入藥，會導致其水溶性小的黃酮及單萜酚類成分較難提取出來；而對于含補骨脂的中成藥，其提取方法較多水提、醇提、粉末入藥，或多種方法的綜合運用。這就為炮制品的選擇帶來了一定難度。我們希望能在炮制品效應成分含量高低與提取方法的選擇之間找到一個平衡點。綜合以上信息，可以看出鹽炙品、酒浸炒品在6種炮制品種占絕對優(yōu)勢。相對于鹽炙品，酒浸炒品效果雖佳，但可操作性及經(jīng)濟性較鹽炙品差。綜上所述，本研究認為現(xiàn)行版中國藥典選擇以鹽水炒有一定科學依據(jù)。

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Effects of Different Processing Methods on the Antiosteoporotic Effective Compositions of Psoralea corylifolia L.

Li Na1, Yan Dongmei1, Zhang Jinlian1, Gao Xiumei2
(1. School of Pharmacy, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China; 2. The TCM Research Centre of Tianjin University of TCM, Tianjin 300193, China)

This study aimed at evaluating the effect of different processing methods on the contents of antiosteoporotic compositions inP. corylifolia. HPLC method adopted to analyze the contents of antiosteoporotic compositions， including coumarin (psoralen and isopsoralen)， flavonoids (neobavaisoflavone， corylifolin，corylifolinin and corylifol A) and meroterpenes (bakuchiol) inP. corylifolia. The contents were analyzed before and after the processing methods. Results： The results showed that the content of coumarin ， flavonoids and meroterpenes obviously changed in different processedP. Corylifoliain comparison with the crude drugs. In conclusion， it was demonstrated that the therapeutic efficacy of osteoporosis was enhanced by CP method which increased all of the three compositions. The testimony tallied with the Chinese medical theory： stir-frying with salt-water could enhance the effect of the tonification of spleen and kidney.

Psoralea corylifoliaL.， processing method， antiosteoporotic composition， effect

10.11842/wst.2017.01.019

R283.1

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2015-12-08

修回日期：2016-12-16

＊ 國家自然科學基金委青年科學基金項目（81202911）：補骨脂炮制前后骨質疏松藥效的變化及相關炮制機理研究，負責人：顏冬梅。

＊＊ 通訊作者：顏冬梅，講師，主要研究方向：中藥學教學及科研。