趙淑媛，曾娟梅，扈會平

1.珠海市麗珠單抗生物技術(shù)有限公司質(zhì)量部，廣東珠海 519000；2.麗珠集團麗珠制藥廠QC部，廣東珠海 519000；3.麗珠集團麗珠制藥廠技術(shù)部，廣東珠海 519000

鼠神經(jīng)生長因子生物學(xué)活性測定方法的研究

趙淑媛1，曾娟梅2，扈會平3

1.珠海市麗珠單抗生物技術(shù)有限公司質(zhì)量部，廣東珠海 519000；2.麗珠集團麗珠制藥廠QC部，廣東珠海 519000；3.麗珠集團麗珠制藥廠技術(shù)部，廣東珠海 519000

目的 建立一個簡單、穩(wěn)定、重復(fù)性好的雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法測定mNGF活性的實驗方法。方法 通過對雞胚運輸溫度控制、神經(jīng)節(jié)分離和接種時間限制、培養(yǎng)結(jié)果觀察時間摸索、活性測定的濃度范圍、重復(fù)性等試驗，建立了鼠神經(jīng)生長因子生物學(xué)活性的測定方法。 結(jié)果 該方法具有操作簡便，靈敏度高、重復(fù)性好、測試結(jié)果準確的特點。結(jié)論 采用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法可有效測定鼠神經(jīng)生長因子的生物學(xué)活性。

鼠神經(jīng)生長因子；mNGF；雞胚背根神經(jīng)節(jié)；生物學(xué)活性測定

神經(jīng)生長因子（nerve gowth factor，NGF）是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一，能夠促進神經(jīng)元的分化，維持神經(jīng)元的存活[1]。鼠神經(jīng)生長因子mNGF是一種從小鼠頜下腺分離出來的非共價鍵連接的多聚體蛋白。其生物學(xué)活性表現(xiàn)在能維持神經(jīng)節(jié)細胞存活、誘導(dǎo)外周神經(jīng)節(jié)外周突起生長[2]。鼠神經(jīng)生長因子的生物學(xué)活性測定是其結(jié)構(gòu)和功能研究的基礎(chǔ)。目前,國際上用于NGF活性測定的方法主要有2種,即雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法和PC12細胞(Pheochromocytoma cells,大鼠腎上腺嗜鉻細胞)培養(yǎng)法[3-4]。由于細胞培養(yǎng)法對操作人員的經(jīng)驗、細胞庫管理、細胞培養(yǎng)環(huán)境、檢測儀器等方面要求較高且設(shè)備設(shè)施投入大，故國內(nèi)神經(jīng)生長因子生物學(xué)活性測定的方法還是主要以雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法為主。但是雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法也存在干擾因素多，實驗結(jié)果重復(fù)性較差的現(xiàn)象，故該文通過對雞胚運輸溫度控制、神經(jīng)節(jié)分離和接種時間限制、培養(yǎng)結(jié)果觀察時間摸索、活性測定的濃度范圍、重復(fù)性等試驗，建立了一個簡單、穩(wěn)定、重復(fù)性好的鼠神經(jīng)生長因子生物學(xué)活性的測定方法，有效地為鼠神經(jīng)生長因子的生產(chǎn)過程監(jiān)控和產(chǎn)品質(zhì)量判定提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

CO2培養(yǎng)箱，解剖顯微鏡，超凈工作臺、，倒置顯微鏡等。

1.2 試劑

雞胚：購于珠海東坑雞場的石歧雞種蛋；鼠神經(jīng)生長因子樣品：麗珠集團麗珠制藥廠自制；鼠神經(jīng)生長因子標準品：來自中國藥品生物制品檢定所，1 000 Au/支；DMEM：購于INVITROGEN公司；鼠尾膠：麗珠集團麗珠制藥廠自制。

2 實驗方法

2.1 鼠尾膠原的涂布

取自制鼠尾膠原均勻涂布于培養(yǎng)瓶中。將殘留液吸盡后，于37℃生化培養(yǎng)箱中干燥。在接種神經(jīng)節(jié)前，培養(yǎng)瓶先用DMEM培養(yǎng)基浸洗，接種前將DMEM培養(yǎng)基倒盡。

2.2 DMEM培養(yǎng)基配制

取DMEM 1包，加葡萄糖0.60 g，L-谷氨酰胺0.02 g，1.5MHEAPS溶液1 mL加純化水溶解，加青霉素1 000 U、鏈霉素10 000U，用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH=7.0后定容至1 000 mL，無菌過濾使用。

2.3 雞胚背根神經(jīng)節(jié)的分離和接種

取孵育7～9 d雞蛋，于超凈臺中，取出雞胚置于無菌培養(yǎng)皿中。于解剖顯微鏡下，從脊柱兩側(cè)分離出背根神經(jīng)節(jié)，接種置培養(yǎng)瓶中。每瓶至少3個，于CO2培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2條件下溫育至少1 h。

2.4 實驗與培養(yǎng)

樣品組（共6個培養(yǎng)瓶）每瓶分別加入含逐級3倍稀釋的不同終濃度鼠神經(jīng)生長因子的DMEM培養(yǎng)基各3 mL；標準品組（共5個培養(yǎng)瓶）每瓶分別加入含逐級3倍稀釋的不同終濃度鼠神經(jīng)生長因子標準品的DMEM培養(yǎng)基各3 mL；陰性對照組加入DMEM培養(yǎng)基3 mL。將培養(yǎng)瓶放入CO2培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。

2.5 結(jié)果觀察

在倒置顯微鏡下觀察，用電子目鏡拍攝。依神經(jīng)節(jié)突起生長不同程度分為5個等級。神經(jīng)節(jié)突起生長4個象限、呈樹杈狀為“++++”；神經(jīng)節(jié)突起生長3個象限、呈樹杈狀為 “+++”；神經(jīng)節(jié)突起生長 2個象限者為“++”；神經(jīng)節(jié)突起只有幾根生長者為“+”；無突起生長者為“-”。

2.6 結(jié)果判定及校正

2.6.1 結(jié)果判定 以神經(jīng)節(jié)突起生長為“++++”時的樣品稀釋倍數(shù)計算效價（AU/mL）。

3 實驗結(jié)果與討論

3.1 雞胚運輸溫度條件實驗

由于溫度變化對雞胚的生長發(fā)育有較大的影響，在氣溫較低的冬季，將種蛋分別用普通紙皮運輸箱和采用保溫泡沫箱內(nèi)加電暖寶裝置控制箱內(nèi)溫度在37℃左右的包裝方式進行種蛋運輸。取不同包裝箱內(nèi)的雞胚摘取神經(jīng)節(jié)接種后加入1 AU/mL的mNGF溶液或DMEM培養(yǎng)基后，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后進行觀察神經(jīng)節(jié)的生長情況。結(jié)果見表1。

表1 雞胚運輸溫度條件實驗結(jié)果

實驗數(shù)據(jù)顯示，雞胚運輸過程中采取保溫泡沫箱內(nèi)加電暖寶裝置控制運輸箱內(nèi)溫度在37℃左右，可以保證運輸過程中雞胚不被凍傷，接種后神經(jīng)節(jié)不會脫落或因受傷神經(jīng)節(jié)生長狀態(tài)不好，造成實驗結(jié)果差異較大。

3.2 神經(jīng)節(jié)分離和接種時間控制實驗

由于神經(jīng)節(jié)需要在一定的溫度、濕度下才能正常生長、發(fā)育。為保證神經(jīng)節(jié)的生長成活率，進行了分離接種時間（神經(jīng)節(jié)分離、接種到培養(yǎng)瓶放入CO2培養(yǎng)箱中）長短，對神經(jīng)節(jié)的生長成活率的影響實驗。取神經(jīng)節(jié)接種后加入1 AU/mL的mNGF溶液后，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察神經(jīng)節(jié)的生長的存活率情況。結(jié)果見表2。

表2 神經(jīng)節(jié)分離和接種時間控制實驗結(jié)果

經(jīng)過多次實驗，觀察到由于接種時間太長會造成神經(jīng)節(jié)生長緩慢或因凍傷或失水而死亡，從而造成活性檢測時出現(xiàn)樣品無活性或無梯度等情況。認為保證在30 min內(nèi)完成神經(jīng)節(jié)分離、接種并進行溫育，是本實驗的關(guān)鍵步驟。對于在冬季氣溫較低的條件下進行mNGF活性檢測；雞胚背根神經(jīng)節(jié)分離接種操作不熟練者；或同時進行多批次檢品檢測需接種較多培養(yǎng)瓶時時間控制顯得尤其重要。因此，為保證神經(jīng)節(jié)的成活率應(yīng)將接種后的培養(yǎng)瓶及時放入CO2培養(yǎng)箱中進行溫育。

3.3 培養(yǎng)結(jié)果觀察時間摸索實驗

由于神經(jīng)節(jié)的培養(yǎng)時間不同，其生長狀況不一樣。通過不同培養(yǎng)時間下對實驗結(jié)果的觀察，認為培養(yǎng)24～36 h為觀察結(jié)果的最佳時間。培養(yǎng)時間＜24 h，神經(jīng)節(jié)的生長狀況未到達最佳狀況，并且常常會因為培養(yǎng)瓶的反復(fù)移動造成神經(jīng)節(jié)突起貼壁不牢固而出現(xiàn)回卷、包節(jié)的現(xiàn)象，以至于影響結(jié)果判斷。培養(yǎng)時間＞48 h，神經(jīng)節(jié)的突起生長會變得更細、更長，出現(xiàn)活性梯度不明顯同時也會因為神經(jīng)節(jié)自身的抽絲生長背景較高而干擾結(jié)果判定。

3.4 mNGF量效學(xué)關(guān)系實驗

采用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法，摸索不同濃度的mNGF或不同效價單位的mNGF對神經(jīng)節(jié)的生長狀況的影響。結(jié)果見表3和圖1。

圖1 mNGF量效學(xué)關(guān)系實驗神經(jīng)節(jié)生長狀況

表3 mNGF量效學(xué)關(guān)系實驗結(jié)果

利用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法，在培養(yǎng)24 h后觀察：在mNGF終濃度為0.1 ng/mL或0.03 AU/mL時，僅有少量神經(jīng)節(jié)細胞突起生長為 “+”；在mNGF終濃度為10 ng/mL或1 AU/mL時，有大量神經(jīng)節(jié)突起呈放射生長為“+++”或“++++”，其神經(jīng)節(jié)突起生長狀況呈現(xiàn)出最好的狀態(tài)。在mNGF終濃度＞30 ng/mL或1AU/mL時，神經(jīng)節(jié)突起生長受抑制為“+++”或“++”。

3.5 重復(fù)性測定

采用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法，對3批產(chǎn)品的生物學(xué)活性測定進行了重復(fù)實驗，檢測6次結(jié)果，CV值小于20%。實驗數(shù)據(jù)見表4。

表4 mNGF效價測定重復(fù)性測定實驗結(jié)果

4 結(jié)語

雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法實驗條件要求簡單，易于開展，并且可以觀察到mNGF對神經(jīng)節(jié)突起生長的促進作用。采用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法mNGF生物學(xué)活性測定時需控制雞胚37℃保溫運輸條件，并在30 min內(nèi)完成神經(jīng)節(jié)分離、接種溫育，培養(yǎng)24 h后進行結(jié)果觀察；且在mNGF的終濃度為0～30 ng/mL時，隨著mNGF的終濃度升高神經(jīng)節(jié)突起生長增多、增長；在mNGF的終濃度高于100 ng/mL或3AU時，神經(jīng)節(jié)突起生長變密、變短、生長受到抑制；而在不加mNGF時，神經(jīng)節(jié)則無突起或僅有少量突起生長。通過控制上述實驗條件，該測定方法的CV值為%，因此，可采用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法，進行鼠神經(jīng)生長因子生物學(xué)活性的限量或半定量測定。該方法適合生產(chǎn)過程中對mNGF原液和制劑的質(zhì)量控制。

[1]柳川,李晉萍,華仲慰,等.小鼠頜下腺2.5S神經(jīng)生長因子的純化與活性鑒定[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1987，11(1)：28-33.

[2]王國華,陳南春,惠宏襄,等.小鼠領(lǐng)下腺神經(jīng)生長因子的制備和活性鑒定[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1998，19(6)：646-648. [3]徐天瑞,董躍偉,熊郁良.兩種測定神經(jīng)生長因子活性方法的比較研究[J].藥物分析雜志，2000，20(1)：17-19.

[4]劉少平,楊國成,孟祥平,等.小鼠頜下腺2.5S神經(jīng)生長因子生活學(xué)活性評估標準的建立[J].廣西醫(yī)學(xué)，2005，27(1)：50-51.

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R95

A

1672-5654（2017）02（b）-0052-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.05.052

2016-11-15）

趙淑媛（1972.3-），女，湖南衡陽人，本科，制藥工程師，主要從事藥品質(zhì)量控制與質(zhì)量保證工作。