王家超 袁 婷 鄒東花 高 雪 郭奕陽 李 劍 張征崢 楊麗娟 馬翠卿

(河北醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，河北省重大疾病的免疫機制及干預(yù)重點實驗室，石家莊050017)

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

A族鏈球菌多價疫苗的完善制備及其動物免疫保護作用研究①

王家超 袁 婷②鄒東花 高 雪 郭奕陽③李 劍 張征崢 楊麗娟 馬翠卿

(河北醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，河北省重大疾病的免疫機制及干預(yù)重點實驗室，石家莊050017)

目的：完善A族鏈球菌(GAS)多價疫苗并探究其免疫保護效果。方法：構(gòu)建GAS的多肽疫苗F7M6，將其中的M6多肽克隆作為對照,表達純化后，將兩種蛋白連同本室保存的GAS M1蛋白分別免疫小鼠，末次免疫后10 d，半數(shù)小鼠行ELISPOT檢測IL-4和IFN-γ，ELISA檢測各組的IgG、IgG1、IgG2a；同時，以F7M6蛋白為診斷抗原檢測其與抗鏈“O”陽性人血清的特異性結(jié)合；致死量的M1GAS攻毒并計算存活率。結(jié)果：無論是誘導(dǎo)細胞免疫,還是誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，F(xiàn)7M6組的水平均為最高；攻毒后F7M6蛋白的生存率為66.7%。F7M6蛋白檢測抗鏈“O”陽性血清的陽性檢出率為95%。結(jié)論：GAS的多肽疫苗F7M6能誘導(dǎo)特異性細胞和體液免疫應(yīng)答，對GAS感染具有良好的保護效果，且F7M6的多價表位涵蓋于時下流行的大部分GAS的血清型中。

A族鏈球菌(GAS)；多價疫苗；M蛋白；FbaA蛋白；免疫應(yīng)答

A族鏈球菌(Group A streptococcus，GAS)是臨床上最常見也是致病性最強的革蘭陽性菌之一，它能夠引起多種化膿性感染，同時，它還可以導(dǎo)致一系列的自身免疫性疾病，如風(fēng)濕性心臟病、腎小球腎炎等[1]。隨著耐藥菌株的出現(xiàn)，鏈球菌的感染表現(xiàn)出在宿主體內(nèi)長期存活及反復(fù)發(fā)作的特點[2,3]，因此GAS感染已成為臨床治療中的棘手問題。本課題組一直致力于尋找針對GAS的有效疫苗，并篩選到了既不與人體組織發(fā)生交叉反應(yīng)又高效的多個M蛋白及FbaA的表位[4-7]。由于GAS有眾多血清型，近幾年，發(fā)現(xiàn)GAS的M12在我國多地普遍流行[8,9]，基于此，本實驗通過網(wǎng)上比對和預(yù)測，選取M12的M蛋白中既跟人無交叉反應(yīng)又具有免疫原性的表位基因片段，通過PCR將M12的含多個表位基因片段與驗證過的FbaA的7個優(yōu)勢表位和GAS M1、M3、M6和M18的M蛋白的有效表位基因及M蛋白具好的免疫原性的C端保守序列串聯(lián)在一起[10]，再在氨基端加上木馬序列(TA)和一個多聚丙氨酸DR表位(PADRE)，以促進抗原提呈及平衡Th淋巴細胞反應(yīng)，獲得重組多價疫苗基因片段命名為f7m6，及通過PCR獲得了單純的GAS 6個型別的M蛋白的重組基因片段,命名為m6，并將上述的f7m6及m6克隆至pET28a原核載體并表達。將純化的F7M6、M6及科室保存的來自GAS M1血清型的M蛋白[11]，佐以目前人用免疫效果佳的MF59佐劑，免疫動物，觀察該重組疫苗的免疫效果，并通過GAS攻擊小鼠觀察小鼠存活率來判定重組多肽對小鼠的免疫保護作用，以期探尋到適合中國地區(qū)應(yīng)用的高效GAS疫苗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、菌株及主要試劑 BALB/c雌性小鼠，4～6周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；菌株E.coli.DH5α、菌株E.coli.BL21、質(zhì)粒pET28a、菌株pET28a/F7M5、M1 GAS標(biāo)準(zhǔn)菌株皆為本室保存，GAS臨床菌株河北省兒童醫(yī)院惠贈；健康兒童血清石家莊市保健院；BamH Ⅰ、HindⅢ、T4DNA 連接酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)皆為TaKaRa公司；DNA片段回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；鎳料購自Bio-Works公司；羊抗鼠IgA-AP、羊抗鼠IgG-AP、羊抗鼠IgG1-AP、羊抗鼠IgG2a-AP皆為SouthernBiotech公司；羊抗人IgG-HRP購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.1.2 實驗動物 將48只4～6周齡雌性BALB/c小鼠隨機分成4組，每組12只，分別免疫F7M6、M6、M蛋白、PBS對照作為對照。

1.2 方法

1.2.1 F7M6特異性序列的基因克隆 通過對我國GAS流行病學(xué)的調(diào)查研究結(jié)果[8，9]選取M12血清型，通過美國疾病預(yù)防和控制中心(CDC)網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/str-epin-dex.htm)提供的GAS M12血清型的氨基酸序列與GenBank中包含的所有人類蛋白質(zhì)序列進行比對(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast Bla-st.cgi)，比對結(jié)果如果連續(xù)5個氨基酸殘基與人類某種蛋白的某段序列完全重合，則這5個氨基酸前面的多肽即為候選多肽[12]，將該段候選多肽插入本室前期成功構(gòu)建重組多肽疫苗F7M5基因序列中。借助primer5.0，設(shè)計引物。

引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，將反應(yīng)產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.2 M6特異性序列的基因克隆 以構(gòu)建好的f7m6序列為模板，上游引物:5′-TACAGGATCCAACGGTGACGGTAATCCGC-3′，下游引物即為P1148-1216下游引物,進行PCR擴增。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物和pET28a質(zhì)粒分別用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，37℃水浴3 h。將酶切產(chǎn)物行純化回收。酶切后的PCR產(chǎn)物克隆至pET28a酶切鑒定及測序，鑒定出陽性克隆。

1.2.4 重組質(zhì)粒的表達及純化 挑取陽性克隆單菌落接種于20 ml 含Kan的2×YT液體培養(yǎng)基中，37℃震搖過夜。次日1∶50轉(zhuǎn)種于500 ml 2×YT液體培養(yǎng)基中，搖至菌密度為 A600=0.7 時，加入IPTG(終濃度為 1 mmol/L)誘導(dǎo)表達4 h。收集菌液，8 000 r/min離心15 min，棄上清，菌體沉淀超聲破菌；采用鎳料親和層析的方法純化目的蛋白，Bradford 法定量重組蛋白，Western blot鑒定重組蛋白的特異性。

表1 PCR引物

Tab.1 Primer of PCR

GeneForwardReverseP1-1004P981-10845'-AATAGGATCCCGCAAGAAACGTCGCC-3'5'-CCATTTCTTTGGTCAGCTGCTCCTT-3'5'-GAGCAGCTGACCAAAGAAATGGCTAAAAAT5'-CTATGATCTGCTCTTACTGTAGCCGTTCCTACCACGAATAGACACTATTCGCTTAGAAA-3'GTTTTTAATTTTCTAAGCGAATAGTGTCT-3'P1065-11665'-AGTAAGAGCAGATCATAGTGATTTAGTCGC5'-ACCTTTATATCCATTTGATTTATTATCATAAGAAAAACAACGTTTAGAAGATTTAGGAC-3'GTATTGTTTTTGTCCTAAATCTTCTAAAC-3'P1148-12165'-TCAAATGGATATAAAAGAAACA-3'5'-CGAAAGCTTTTCTAATGCCTTTTCCACCTCGCAT-3'

1.2.5 在線分析F7M6表位序列的親水性及空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測 根據(jù)F7M6氨基酸順序在線預(yù)測蛋白的抗原表位(http://bio.dfci.harvard.edu/Tool/antigenic.pl)和F7M6全序列親水性分析(http://web.expasy.org/protscale/)及F7M6重組多肽空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)。

1.2.6 免疫途徑、劑量及次數(shù) 抗原與MF59佐劑1∶1比例混合并充分乳化，每只小鼠皮下免疫總量為20 μg/200 μl。間隔21 d進行第2次常規(guī)免疫，共免疫4次。對照組注射等量PBS。

1.2.7 血清的采集和制備 每次免疫10 d后，下頜竇靜脈采血，血液4℃放置30 min，3 000 r/min離心30 min，吸取血清，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 動物實驗免疫效果分析

1.2.8.1 體液免疫效果測定 以F7M6包被ELISA板，間接ELISA測定血清中IgG、IgG1、IgG2a抗體水平及動態(tài)變化。同時，以F7M6作為診斷抗原包被ELISA板，檢測臨床抗鏈“O”陽性血清及健康兒童血清的陽性率。酶標(biāo)儀測405nm波長下的OD值。陽性判斷：實驗組OD值/陰性對照≥2.1為陽性，效價的判定為出現(xiàn)陽性且OD值>0.15的最高稀釋度。

1.2.8.2 細胞免疫效果測定 ELISPOT檢測各組小鼠脾臟免疫細胞表達IL-4和IFN-γ的水平。在96孔濾膜板中每孔加100 μl 70%乙醇,室溫放置10 min,棄乙醇,PBS洗滌后，加100 μl/孔1∶250稀釋的IL-4和IFN-γ抗體包被該板,4℃過夜；次日棄上清,用包被緩沖液洗滌后,加200 μl/孔含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,室溫封閉1 h，棄去封閉液，加入脾細胞懸液50 μl/孔(濃度為2×107個/ml)。每只小鼠設(shè)2個組：抗原刺激組和空白組?？乖碳そM每孔補足20 μg/50 μl含相應(yīng)蛋白的RPMI1640，空白組每孔僅補RPMI1640 50 μl。置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，PBST洗滌，每孔加入100 μl 1∶250稀釋的生物素標(biāo)記的檢測抗體，室溫孵育2 h。棄上清，PBST洗滌后，每孔加100 μl 稀釋的親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶，室溫孵育45 min。棄上清，PBST洗3次。每孔加100 μl新鮮配制的AEC顯色液，室溫孵育30 min，去離子水洗滌以終止顯色，自然干燥，讀板機讀板。

1.2.8.3 鏈球菌攻擊小鼠檢測疫苗的保護率 末次免疫后10 d，每只小鼠腹腔攻擊108CFU/ml M1GAS，連續(xù)觀察45 d，記錄死亡時間和數(shù)量，計算存活率，評估疫苗的保護效率。

2 結(jié)果

2.1 F7M6和M6的成功表達 以引物自身為模板行搭橋PCR成功擴增出M12血清型中與人無交叉反應(yīng)的部分基因片段并插入本室前期合成的F7M5序列中[4]，得到F7M6重組序列，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果在1 200 bp左右出現(xiàn)基因條帶，大小與預(yù)計相符。以F7M6序列為模板，PCR擴增得到M6序列，結(jié)果在750 bp左右出現(xiàn)條帶，大小與預(yù)計相符(圖1A)。純化后的兩段PCR產(chǎn)物分別克隆至載體pET28a上，酶切鑒定條帶位置正確(圖1B)，陽性質(zhì)粒測序正確。

將鑒定陽性質(zhì)粒pET28a/F7M6和pET28a/M6轉(zhuǎn)化至表達菌株E.coli BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達產(chǎn)物主要以包涵體形式存在。行SDS-PAGE電泳，顯示F7M6蛋白約為60 kD，M6蛋白約為30 kD，結(jié)果與預(yù)期一致(圖1C)。純化復(fù)性后的兩種蛋白均可與F7M5抗體雜交(圖1C)。

2.2 網(wǎng)上在線預(yù)測F7M6的表位和結(jié)構(gòu) 網(wǎng)上在線預(yù)測F7M6多肽的表位(圖2A)及其空間結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖2B)提示F7M6中有多個表位，且重組表達的多肽能夠折疊成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)。F7M6序列親水性分析結(jié)果(圖2C)所示，提示該重組蛋白具有良好的親水性

2.3 F7M6誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生情況 小鼠末次后，ELISA檢測小鼠血清IgG抗體水平結(jié)果顯示：檢測到蛋白免疫組小鼠誘導(dǎo)出了高水平IgG抗體，且均顯著高于PBS對照組(P<0.001)(圖3A)。計算各組效價，F(xiàn)7M6組達到6.7×105，M6組達到5.8×104，M蛋白組達到3.3×104，(圖3B)。對第1次、第2次和第3次免疫后的血清1∶3 000稀釋后檢測IgG動態(tài)變化顯示，各蛋白免疫組的IgG水平隨著免疫次數(shù)的增加逐漸增高(圖3C)。

圖1 F7M6和M6重組序列的構(gòu)建和表達Fig.1 Construction and expression of recombinant F7M6 and M6Note: A.Amplification of F7M6 gene and M6 gene sequence by PCR；B.Recombinant plasmid pET28a/F7M6 or pET28a/M6 digested by BamH Ⅰ/Hind Ⅲ；C.Expression detection of F7M6 and M6 by SDS-PAGE and Western blot.

圖2 網(wǎng)上在線預(yù)測F7M6多肽的表位Fig.2 Online prediction results of F7M6Note: A.The predicted epitopes of F7M6 gene；B.The schematic diagram of F7M6 protein；C.The hydrophilic analysis of F7M6 protein.

圖3 ELISA檢測小鼠免疫血清中特異性IgG抗體水平Fig.3 Detection of specific IgG,IgG1 and IgG2a antibody levels in mouse sera by ELISANote: A.Analysis of IgG binding to the three proteins using immunized sera on day 10 post-last vaccination；B.IgG antibody levels of the three group.*.P<0.05 vs PBS；C.Detection of serum IgG antibodies specific to the three proteins following three immunizations.*.P<0.05；D,E.Detection of IgG1(D) and IgG2a(E) antibody levels in three groups.*.P<0.05 vs PBS.

間接ELISA檢測小鼠血清中IgG1和IgG2a的水平，結(jié)果顯示：末次免疫后F7M6組、M6組、M組小鼠血清IgG1均顯著高于PBS組(P<0.001)，但三組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(圖3D)。三組小鼠血清IgG2a水平亦均高于PBS組(P<0.001)，同時，F(xiàn)7M6組顯著高于M6組(P=0.009)，但F7M6和M蛋白組間，M6和M蛋白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3E)。以上結(jié)果提示：F7M6多肽疫苗可誘導(dǎo)高效價IgG及誘發(fā)平衡的IgG1/IgG2a(Th2細胞/Th1細胞)免疫反應(yīng)。

2.4 F7M6誘導(dǎo)了高水平IL-4和IFN-γ的表達 取免疫后的小鼠脾細胞懸液，行ELISPTO，結(jié)果顯示，IL-4水平(圖4A)和IFN-γ水平(圖5B)表達趨勢一致：F7M6、M6和M蛋白組均顯著高于PBS組(P<0.001)，且F7M6均高于M6組(P<0.001)和M蛋白組(P<0.01)，而M蛋白組亦高于M6組(P<0.05)。

2.5 F7M6與抗鏈“O”陽性血清具有高特異性結(jié)合能力 以F7M6蛋白為診斷抗原檢測抗鏈“O”陽性的病人血清及健康兒童血清，結(jié)果顯示抗鏈“O”陽性人血清的陽性檢出率為95%，而健康兒童血清的陽性檢出率為47.3%，二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖5 。

圖4 ELISPOT檢測小鼠脾臟免疫細胞表達IL-4和IFN-γ水平Fig.4 Analysis IL-4(A) and IFN-γ(B) of spleen cell suspension from immunized by ELISPOTNote: *.P< 0.05 vs PBS.

圖5 ELISA分析F7M6蛋白與抗鏈“O”陽性血清的特異性結(jié)合能力Fig.5 Binding capacity analysis of F7M6 protein with sera from ASO-positive patients by ELISANote: The line on the column graph represents the positive threshold (OD450 =0.612).

圖6 M1 GAS攻毒免疫小鼠并計算其存活率Fig.6 Survival rate of immunized and control mice following challenge with M1 GASNote: Immunized and control mice were challenged with GAS bacterial suspension (equivalent to 1×108 CFU) on day 10 after the last immunization.Mice were monitored every day and calculated the survival rates.

2.6 攻毒存活率 末次免疫10 d后，小鼠腹腔攻擊M1 GAS，結(jié)果顯示，F(xiàn)7M6組和M蛋白組的存活率為66.7%，M6組為33.3%，PBS組則全部死亡(圖6)，統(tǒng)計學(xué)分析顯示三組均顯著高于PBS組(P<0.05)，且F7M6組和M蛋白組高于M6組(P<0.05)。

3 討論

早在上個世紀(jì)，全球范圍內(nèi)就對GAS疫苗進行了大規(guī)模的研究。對GAS疫苗的開發(fā)，著重于不同型別GAS表面能引起廣泛保護性應(yīng)答的共同分子的研究，包括C5a肽酶、外毒素B、鏈球菌纖維纖連蛋白結(jié)合蛋白1(Sfb1)和纖維纖連蛋白結(jié)合蛋白54(FBP54)等[13，14]，但至今仍沒有安全、經(jīng)濟、有效的疫苗問世。

對GAS疫苗研究的一個重要方向是GAS表面的M蛋白，其為GAS的主要毒力因子，也是GAS的保護性抗原，但與此同時，M蛋白與人體多種蛋白存在交叉免疫反應(yīng)。M蛋白C端為高度保守區(qū)，N端為高變區(qū)A區(qū)和半可變區(qū)B區(qū)，有研究發(fā)現(xiàn)，M蛋白的調(diào)理性表位與自身免疫性表位是相分隔開的[15]，所以對M蛋白的研究有三種方向：一是以M蛋白不同血清型N端可變區(qū)片段制備多價表位疫苗；二是以M蛋白C端保守區(qū)片段制備多價表位疫苗；三是將M蛋白融合GAS其他表面蛋白制備多價多肽融合疫苗，本研究將以上三種方法融合起來，即將與人體組織無交叉反應(yīng)的可變區(qū)、C端的保守區(qū)及GAS的其他表面蛋白FbaA的有效表位串聯(lián)在一起，制備出多價重組疫苗。

FbaA是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種新的GAS表面蛋白，它存在于近乎90%不同血清型的GAS表面，且在不同血清型中表現(xiàn)出較高的同源性[10，16]。有報道顯示，F(xiàn)baA通過結(jié)合Fn可以介導(dǎo)GAS對HEp-2細胞的內(nèi)化[17]，表明FbaA有助于GAS逃避中性粒細胞的吞噬，幫助其進入人體上皮細胞并且也具有較好的免疫原性和免疫保護性[18,19]。此外，F(xiàn)baA中含有非M樣蛋白，可以結(jié)合FH和FHL-1，表明FbaA可能有助于GAS逃避補體攻擊。因此，F(xiàn)baA蛋白也成為GAS疫苗候選蛋白。

根據(jù)我國部分地區(qū)GAS最新的流行病學(xué)調(diào)查顯示，GAS感染患兒的M蛋白分型中，M12血清型所占比例幾乎高達50%[8，9]。在本實驗中我們將M12的保護性表位插入到本室保存的重組質(zhì)粒F7M5中[4]，重新構(gòu)建出重組表達質(zhì)粒F7M6和M6，誘導(dǎo)表達純化出相應(yīng)蛋白后，將F7M6蛋白、M6蛋白和本室保存的M蛋白分別免疫小鼠，小鼠血清抗體IgG水平隨免疫次數(shù)逐漸增長，各實驗組均能誘導(dǎo)高水平IgG,但以F7M6組效價升高最為明顯，提示F7M6可以更有效地誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。

在本研究中，我們采用了MF59佐劑，大量研究表明，MF59作為一種可以人用的新型佐劑，其效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的鋁佐劑[20，21]。MF59免疫原性的增強作用并不依賴于與抗原的結(jié)合，而主要是通過誘導(dǎo)局部免疫活化的環(huán)境，刺激并放大免疫信號，促進免疫調(diào)節(jié)細胞因子/趨化因子和免疫細胞的募集，增強樹突狀細胞對抗原的攝取和提呈能力，從而達到增強體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答的作用[22]。盡管GAS有多種途徑進入人體，但在本實驗中F7M6多價疫苗在MF59佐劑的協(xié)助下可更好地通過誘導(dǎo)Th1細胞活化CTL細胞來抵抗胞內(nèi)感染。IL-4促進Th細胞向Th2型分化。IL-4通過與IFN-γ共同作用，可以促進B細胞的活化，誘導(dǎo)IgG1的產(chǎn)生。加之，F(xiàn)7M6多價疫苗同時誘導(dǎo)了高效價的IgG1及IgG2，由此分析得知，F(xiàn)7M6可以誘導(dǎo)均衡的Th1/Th2免疫應(yīng)答。相比之下，M6和M蛋白組只能誘導(dǎo)高水平的IgG1，顯示F7M6疫苗優(yōu)于另兩組疫苗。

疫苗的研究需要綜合考慮許多因素，包括人群的地理分布，疾病亞型的變異等。本研究有望為我國GAS疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

[1] Olivier C.Rheumatic fever--is it still a problem? [J].J Antimicrob Chemother,2000,45 (2):13-21.

[2] Pichichero ME,Casey JR.Systematic review of factors contributing to penicillin treatment failure in Streptococcus pyogenes pharyngitis [J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg,2008,137(6):851-857.

[3] Lucilla B,Roberta C,Simona R,etal.Therapeutic failures of antibiotics used to treat macrolide-susceptible Streptococcus pyogenes infections may be due to biofilm formation [J].J Clin Microbiol,2006,44(8):2721-2727.

[4] Ma C,Zheng L,Li W,etal.FbaA-and M protein-based multi-epitope vaccine elicits strong protective immune responses against group A streptococcus in mouse model [J].Microbes Infect,2014,16(5):409-418.

[5] 郭奕陽,馬翠卿,魏 澎,等.A 族鏈球菌 (GAS) Fba 蛋白單克隆抗體對應(yīng)表位核心氨基酸的確定 [J].中國免疫學(xué)雜志,2009,25(12):1059-1062.

[6] 馬翠卿,顧海燕,郭奕陽,等.A 族鏈球菌表面蛋白 Fba 單克隆抗體的制備及其對應(yīng)表位的初步鑒定 [J].中國免疫學(xué)雜志，2008，24(11):1046-1048.

[7] 魏 澎,馬翠卿,郭奕陽,等.A 族鏈球菌表面蛋白 Fba 保護性區(qū)段的鑒定 [J].中華傳染病雜志,2010，28(5): 257-261.

[8] 梁云梅,常賀生,沈敘莊,等.北京地區(qū)兒童攜帶的釀膿鏈球菌emm分型和超抗原speA及speC的相關(guān)性研究 [J].中華實用兒科臨床雜志,2010，25(22):1700-1702.

[9] 梁云梅,常賀生,沈敘莊,等.致兒童咽扁桃體炎釀膿鏈球菌emm分型 [J].臨床兒科雜志,2011，29(4):382-385.

[10] Terao Y,Kawabata S,Kunitomo E,etal.Fba,a novel fibronectin-binding protein from Streptococcus pyogenes,promotes bacterial entry into epithelial cells,and the fba gene is positively transcribed under the Mga regulator [J].Mol Microbiol,2001,42(1):75-86.

[11] Cui QM,Cai HL,Xiu RW,etal.Similar ability of FbaA with M protein to elicit protective immunity against group A streptococcus challenge in mice [J].Cell Mol Immunol,2009,6(1):73-77.

[12] Goodman RE.Practical and predictive bioinformatics methods for the identification of potentially cross-reactive protein matches [J].Mol Nutr Food Res,2006,50(7):655-660.

[13] Courtney HS,Hasty DL,Dale JB.Serum opacity factor (SOF) of Streptococcus pyogenes evokes antibodies that opsonize homologous and heterologous SOF-positive serotypes of group A streptococci [J].Infect Immun,2003,71(9):5097-5103.

[14] Mcarthur J ,Medina E ,Mueller A ,etal.Intranasal vaccination with streptococcal fibronectin binding protein Sfb1 fails to prevent growth and dissemination of Streptococcus pyogenes in a murine skin infection model [J].Infect Immun,2004,72(12):7342-7345.

[15] Samanidou VF,Nika MK,Papadoyannis IN.HPLC as a tool in medicinal chemistry for the monitoring of tricyclic antidepressants in biofluids [J].Mini Rev Med Chem,2008,8(3):256-275.

[16] Ramachandran V,Mcarthur JD,Behm CE,etal.Two distinct genotypes of prtF2,encoding a fibronectin binding protein,and evolution of the gene family in streptococcus pyogenes [J].J Bacteriol,2004,186(22):7601-7609.

[17] Cue D ,Dombek PE,Lam H ,etal.Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells [J].Infect Immun,1998,66(10):4593-4601.

[18] 李彩虹,馬翠卿,王 錦,等.A族鏈球菌表面新發(fā)現(xiàn)蛋白Fba真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答 [J].中國免疫學(xué)雜志,2007,23(9):835-838.

[19] 馬翠卿,李彩虹,王秀榮,等.A族鏈球菌表面蛋白Fba的原核表達及免疫原性分析 [J].中華傳染病雜志,2008,26(3):146-150.

[20] Traquina P ,Morandi M ,Contorni M ,etal.MF59 adjuvant enhances the antibody response to recombinant hepatitis B surface antigen vaccine in primates [J].J Infect Dis,1996,174(6):1168-1175.

[21] Granoff DM,Mchugh YE,Raff HV,etal.MF59 adjuvant enhances antibody responses of infant baboons immunized with haemophilus influenzae Type b and Neisseria meningitidis group C oligosaccharide-CRM197 conjugate vaccine [J].Infect Immun,1997,65(5):1710-1715.

[22] O′Hagan DT,Ott GS,Gregorio ED,etal.The mechanism of action of MF59-an innately attractive adjuvant formulation [J].Vaccine,2012,30(29):4341-4348.

[收稿2016-06-08 修回2016-07-11]

(編輯 張曉舟)

Optimization and evaluation of multi-epitopes vaccine and its immune protection against to GAS infection

WANGJia-Chao，YUANTing,ZOUDong-Hua,GAOXue,GUOYi-Yang,LIJian,ZHANGZheng-Zheng,YANGLi-Juan,MACui-Qing.

DepartmentofImmunology,HebeiMedicalUniversity,KeyLaboratoryofImmuneMechanismandInterventiononSeriousDiseaseinHebeiProvince,Shijiazhuang050017,China

Objective:To optimize group A streptococcus (GAS) polyvalent epitope-based vaccine，and explore its immune protection effect.Methods: Psolyvalent vaccine of GAS,F7M6,was constructed and expressed,in which the M6 peptide was constructed as control.12 mice of each group were immunized with 20 μg per dose of purified F7M6,M6 or M protein (stored in our lab),and PBS as negative control.Half of the mice in each group were sacrificed on 10 days of the last immunization,and the levels of IgG,IgG1 and IgG2a,were detected by ELISA and the levels of IL-4 and IFN-γ were detected by ELISPOT.At the same time,the left immunized animals were challenged with a lethal dose of M1GAS,and determined the protective effect of the vaccine.Besides,the specific binding ability of F7M6 protein with the sera from ASO-positive patients was detected by ELISA.Results: In F7M6 group,the levels of not only sera IgG,IgG1,IgG2a,but also IL-4 and IFN-γ were the highest one compared with other groups.Following challenge with type M1 GAS,the survival rates of F7M6 group was 66.7%.Additionally,when F7M6 acted as diagnostic antigen,the positive detective rate of ASO-positive patient sera was 95%.Conclusion: Polypeptides F7M6,could elicit the best humoral and cell-mediated immune response than other groups,and induce a protective effect in immunized mice against M1 GAS infection.Excitedly,the epitopes of F7M6 protein covers the most of GAS serotypes at present.

Group A streptococcus(GAS);Multi-epitope vaccine;M protein;FbaA protein;Immune response

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.016

①本文受國家自然科學(xué)基金 (31370914和 81172810)和河北省自然科學(xué)基金(H2016206516)資助。

王家超(1990年-)，男，在讀碩士，主要從事感染免疫與分子免疫研究，E-mail:865444893@qq.com。

及指導(dǎo)教師：馬翠卿(1974年-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事感染免疫與分子免疫研究，E-mail：macuiqing@sina.com。

R392

A

1000-484X(2017)03-0392-06

②共同第一作者。

③河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊050017。