馬雪倩，俞佳斌，馬芳

(1.四川大學華西第二醫(yī)院出生缺陷與相關婦兒疾病及西部婦幼研究院四川大學-香港中文大學生殖醫(yī)學聯(lián)合實驗室，成都 610000；2.四川大學華西第二醫(yī)院婦產科，成都 610041；3.東南大學臨床醫(yī)學院，南京 210009；4.浙江大學醫(yī)學院附屬婦產科醫(yī)院，杭州 31006)

女性垂體促性腺激素糖基化修飾的含量及作用機制研究進展

馬雪倩1，4，俞佳斌3，馬芳1，2*

(1.四川大學華西第二醫(yī)院出生缺陷與相關婦兒疾病及西部婦幼研究院四川大學-香港中文大學生殖醫(yī)學聯(lián)合實驗室，成都 610000；2.四川大學華西第二醫(yī)院婦產科，成都 610041；3.東南大學臨床醫(yī)學院，南京 210009；4.浙江大學醫(yī)學院附屬婦產科醫(yī)院，杭州 31006)

卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)在正常女性生理周期中的含量變化呈現(xiàn)一定的波動性，并且其肽鏈末端糖基(唾液酸以及磺化乙酰半乳糖胺)的含量也相對出現(xiàn)一些變化?，F(xiàn)已明確，這兩種激素上的唾液酸和磺化乙酰半乳糖胺均是在蛋白合成之后，由半乳糖轉移酶和乙酰半乳糖胺轉移酶在FSH及LH 的肽鏈末端通過天門冬氨酸殘基誘導形成。由于這兩種酶對FSH及LH 的相對活性不同，使得FSH的性質主要受唾液酸影響，而LH則主要受磺化乙酰半乳糖胺影響。這兩種糖基也通過不同的機制影響著女性垂體促性腺激素的半衰期、酸堿性、穩(wěn)定性等性質，并通過下游的信號通路對后面的性激素合成等帶來改變。

卵泡刺激素； 黃體生成素； 唾液酸； 磺化乙酰半乳糖胺

(JReprodMed2017，26(2)：183-187)

卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)是女性重要的促性腺激素，它們除了具有調節(jié)女性生理周期、誘導排卵等作用以外，也是目前臨床上用于促排卵及疾病治療等操作的關鍵藥物[1-2]。雖然近年這兩種藥物提取與制造工藝不斷改進，但是其臨床效果卻往往隨著劑量、類型的不同有著較大的差異。目前最新研究認為，這種效果上的差異很可能來源于其糖基化(主要是唾液酸化和磺化)的類型與數(shù)目的不同[3]。一直以來關于這兩種激素糖基化的含量改變、功能原理的文獻并不多，以致于學術界對這個問題并沒有充分地認識及解決。本文將總結近年來關于女性垂體促性腺激素糖基化的相關文章，對其規(guī)律、特點、功能及相關假說進行概述，期望能夠給相關的研究及應用提供總結式參考，并對如何提高臨床上排卵成功率等問題帶來一些建議或思考。

一、促性腺激素糖基化修飾概述

FSH和LH均由垂體的嗜堿性細胞合成和分泌。FSH分子量約33 000，LH約30 000，均是異二聚體，由α和β兩個亞基組成。兩者的α亞基相似，由同一個基因所編碼，92個氨基酸構成，其作用主要是決定和維持多肽鏈的生物活性；而β亞基則略有不同，這也是造成兩者功能性質上差異的原因之一[4]。

在女性體內，F(xiàn)SH及LH由垂體進行脈沖式發(fā)放進入血液循環(huán)到達卵巢，通過與成熟卵泡的相互作用從而達到調節(jié)女性生理周期、誘導排卵、調節(jié)性激素以及調節(jié)妊娠等作用[5]。此外，F(xiàn)SH也一直是臨床上體外受精(IVF)中用于促排卵的主要藥物[6]。歷史上先后用過多種來源的FSH，從孕馬尿、孕婦尿到提取的尿源性FSH、實驗室純化以及重組合成的FSH進行治療[7]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，絕經婦女尿中提取的垂體促性腺激素與體外重組的垂體促性腺激素，以及正常年輕女性垂體促性腺激素相比，其肽鏈末端特定位置的糖基化有一定的差異[8-9]。提示不同的糖基化修飾會在一定程度上影響FSH及LH的性質與功能。研究表明，在正常的FSH及LH 分子上，其β亞基含有2個N連接的糖基化位點以及4個O連接的糖基化位點，糖基化數(shù)量或位置的差異往往會對其性質造成影響[10]。通過電泳等方式，確定這兩種激素末端的糖基主要有唾液酸(sialic acids)及磺化的乙酰半乳糖胺(sulfonated N-acetylgalactosamine，sulfonated GalNAc)。這兩種陰離子糖基對FSH和LH的半衰期、穩(wěn)定性、酸堿性及功能有重要影響[11-12]。

二、促性腺激素及糖基化含量

研究人員通過大量實驗，研究處于月經周期的不同時段的正常女性、絕經后婦女、多囊卵巢綜合征(PCOS)患者血液里FSH、LH糖基的含量，以及肽鏈末端磺化乙酰半乳糖胺和唾液酸個數(shù)的波動狀況。

1.正常月經周期：現(xiàn)已明確，血清中FSH及LH的濃度在上一周期結束的時候，均達到整個周期的最低點。此后均以不同的速率及波動幅度上升，大約在月經中期，即排卵前后，分別達到峰值，之后再緩慢下降。而這兩種激素上唾液酸和乙酰半乳糖胺的含量變化則相對復雜。

Wide等[13]研究表明在正常月經周期中FSH上唾液酸糖基的表達成明顯的M形，其在月經中期以及周期首尾最低，而在三個低谷之間，也就是在排卵期前后含量最高；另一方面，磺化乙酰半乳糖胺在LH上明顯表達為V形，在月經中期達最低點，其前后表現(xiàn)為迅速下降或上升。提示FSH及LH上的唾液酸糖基及乙酰半乳糖胺基團的含量波動可能與排卵的發(fā)生有關聯(lián)。其作為影響這兩種促性腺激素與靶細胞受體相互作用的重要糖基，可協(xié)助誘導在靶細胞內產生cAMP(環(huán)化一磷酸鳥苷)或IP(磷酸肌醇)作為第二信使向下游進行信號轉導，從而影響卵泡的發(fā)育和調節(jié)類固醇激素的產生。

2.絕經后：實驗人員對絕經后婦女血清中FSH、LH進行了測定[14]。結果表明，絕經后女性FSH及LH的酸性較其他階段女性的明顯增強，兩種分子上的唾液酸含量均在絕經后達到最高，而乙酰半乳糖胺含量則相對濾泡期和黃體期明顯降低，僅相當于月經中期的含量。在這個時期，F(xiàn)SH的穩(wěn)定性也顯著上升，提示唾液酸糖基數(shù)的增加或乙酰半乳糖胺的減少對于激素本身的半衰期、酸堿性等帶來影響。而在人工促排卵、體外受精的操作過程中，曾經使用絕經婦女的尿液中提取出的FSH，但其效果與后來體外重組得到的FSH相比略有差異，除了提取工藝造成的濃度、純度差異以外，目前認為其上這兩種糖基的含量及分布差異是更重要的原因[8]。

3.PCOS患者：PCOS患者血清中典型的促性腺激素變化是FSH低下伴隨LH升高，LH甚至高于濾泡期。但LH分子上的乙酰半乳糖胺明顯下降，而唾液酸含量則有所上升，高于濾泡期和黃體期[15]，這個現(xiàn)象與絕經后婦女表現(xiàn)出一定的相似性。此外，發(fā)現(xiàn)PCOS患者血清中FSH的唾液酸成分增多并伴隨乙酰半乳糖胺的減少，甚至出現(xiàn)了相當比例(92%)的不含后者的FSH分子[14]。

將PCOS患者按照體重指數(shù)(BMI)的不同分為肥胖與非肥胖，發(fā)現(xiàn)這兩類患者FSH及LH上乙酰半乳糖胺的含量變化與BMI呈現(xiàn)一定的相關性，肥胖患者FSH和LH分子上乙酰半乳糖胺的含量總體而言高于非肥胖患者[14]。提示對于PCOS患者，盡管臨床癥狀主要由下丘腦-垂體-卵巢軸的激素紊亂造成，但唾液酸的增多以及乙酰半乳糖胺的減少同樣與患者的卵泡發(fā)育異常及排卵障礙的發(fā)生有關，并會通過一定的機制影響癥狀的表現(xiàn)強度[16]。

三、促性腺激素糖基化機制研究現(xiàn)狀

研究表明FSH和LH的亞基的N端附近均含有數(shù)目不等的由天門冬酰胺(Asn)連接的單糖，這其中包括著唾液酸以及磺化乙酰半乳糖胺[17]。在磺化的單糖附近往往會有SO4-4GalNAcβ1，4GlcNAcβ1，2Manα這樣的序列誘導形成單或雙磺化結構，用以誘導形成磺化糖基[13]。而相比之下，唾液酸單糖結構的附近序列則表現(xiàn)出很強的結構差異性。

FSH和LH在垂體嗜堿性細胞中完成蛋白前體的合成與初步修飾之后，會在N端的乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)的引導下進入中間高爾基網，在高爾基網反面將不同的糖基催化連接到特定的Asn上，共同作為之后糖基化的底物。此處有兩種糖基化的關鍵酶，分別是半乳糖轉移酶(β1-4galactosyltransferase)催化形成唾液酸基團，以及乙酰半乳糖胺轉移酶(β1-4GalNAc-transferase)催化生成磺化乙酰半乳糖胺基團[18]。在肽鏈的N端具體形成哪一種糖基則取決于兩種酶的相對活性。乙酰半乳糖胺轉移酶可以識別LH分子β亞基上的脯氨酸-亮氨酸-精氨酸(Pro-Leu-Arg)三肽結構，后者可以誘導增強該酶的活性，從而生成更多的磺化乙酰半乳糖胺[19-20]。而這種三肽序列并沒有表達在FSH的β亞基上，此外，F(xiàn)SH的α亞基上這一序列也因為一些原因被掩蓋住，使其無法誘導乙酰半乳糖胺轉移酶的活性。因此在FSH上半乳糖轉移酶的作用更加明顯，使得FSH上唾液酸化相對更強[21]。也因此認為唾液酸對FSH的性質和功能的影響更強，而磺化乙酰半乳糖胺對LH的影響則較為顯著。

四、糖基化影響促性腺激素性質的生化機制研究進展

唾液酸與磺化乙酰半乳糖胺連接在這兩種促性腺激素的肽鏈N端，通過不同的機制來影響后者的理化性質和功能，如半衰期、穩(wěn)定性、受體結合特性、下游信號轉導以及促分泌作用等，并參與其在卵巢中的各種功能[22]。

唾液酸分子存在于FSH兩種亞基上，可以隱藏分子上的抗原性位點，而后者能夠誘導激活部分分解代謝的受體，從而避免FSH被巨噬細胞或肝細胞上的Gal識別受體所識別結合而被降解掉，延長分子的半衰期，增加穩(wěn)定性[23]?，F(xiàn)已通過嚙齒類動物證明，存在于LH分子表面上的磺化乙酰半乳糖胺，同樣可以被肝細胞表面特異性受體識別結合，使得LH分子被肝細胞代謝清除[24]，破壞LH的穩(wěn)定性與縮短半衰期。此外，糖基化的存在會影響FSH與LH的酸堿性。前已述及，絕經婦女及PCOS患者血中FSH及LH的酸性均較育齡期正常女性的高[14]，這與兩種蛋白表面酸性的唾液酸單糖分子含量上升，乙酰半乳糖胺下降有關。

另一方面，由于糖基化的存在，使得這兩種激素的α與β 亞基分別有了不同的特性。α亞基以及兩種亞基上的糖基化修飾顯著影響激素與受體結合的親和性與反應活性，去糖基化的α、β亞基生物活性會被明顯抑制，甚至出現(xiàn)拮抗效應[25]。Martin等[26]已通過定點突變及轉染等方式對由Asn介導的糖基化位點的相關特性進行探究，結果表明αAsn78上糖基化活性較低，數(shù)量較少，其產生的作用相對不明顯。Davis 等[27]研究表明，αAsn52位是重要的唾液酸化位點，在此位點上不同形式和數(shù)目的唾液酸化會給FSH的結構帶來較大的改變。Baenziger[21]的研究也表明，αAsn52位上的糖基可協(xié)助刺激下游信號轉導產生cAMP或IP信使分子，從而進一步影響固醇的合成。

對于β亞基，Keutmann等[28]實驗證明，β亞基在高濃度作用時即可與卵泡顆粒細胞上的受體結合并通過下游信號轉導刺激后續(xù)的固醇類激素產生。說明在與受體結合時，主要由β亞基的肽鏈結構決定與受體結合的特異性。Nguyen等[29]證實βAsn13及βAsn30糖基非常豐富，并且相比之下，前者在促進性激素分泌上的作用更明顯。此外，有研究認為在低濃度糖基化時促進生成cAMP分子，在高濃度時則偏向于通過IP信號通路影響下游的信息傳遞[30]。

五、糖基化的差異在輔助生殖技術中的影響

值得一提的是，F(xiàn)SH是國內外輔助生殖技術中用于促排卵的關鍵藥物，然而目前各大輔助生殖中心對于FSH類型與來源的選擇不盡相同?，F(xiàn)在最常見的有由絕經婦女的尿中所提取純化出的高純度尿源性FSH(uFSH)以及利用重組技術合成的重組人FSH(rhFSH)，前者含有比例較高的酸性FSH亞型，相比之下后者的酸性則較低，穩(wěn)定性較差[31]。有報道認為，酸性較高的uFSH在促排卵的生物活性低于rhFSH，后者的臨床有效率及妊娠率高于前者[32]。葉虹[33]研究提示，uFSH與rhFSH的主要差異即來源于其上糖基化的不同。而鑒于LH在輔助生殖技術中的直接應用較少，通常是利用HCG代替或利用其它藥物避免LH峰的發(fā)生，故對LH的糖基化差異在輔助生殖中的研究較少。

綜上所述，目前僅有少部分研究將目光聚集在垂體促性腺激素的糖基化上，包括糖基化的數(shù)目和影響后期與卵泡相互作用的分子機制。通過對相同的FSH、LH肽鏈上進行不同的糖基化，有望在一定程度上調節(jié)其性質并作為用相關疾病藥物治療，如臨床上促排卵、PCOS治療等的新的改進入手點。遺憾的是，到目前為止還沒有將這個問題完全解釋清楚。本文通過總結近年來關于FSH和LH糖基化的相關文獻，盡量將目前的研究成果進行完善和梳理。希望本文能從一個新的方向上對相關臨床用藥和實驗室研究帶來啟發(fā)與思考，并對女性促性腺激素作為藥物對疾病治療的發(fā)展做出貢獻。

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[編輯：羅宏志]

Study on development of female pituitary gonadotrophin glycosylation content and its mechanism

MAXue-qian1，4，YUJia-bin3，MAFang1，2*

1.SichuanUniversity-theChineseUniversityofHongKongJointLaboratoryforReproductiveMedicine，KeyLaboratoryofObstetric，GynecologicandPediatricDiseasesandBirthDefectsofMinistryofEducation，WestChinaSecondUniversityHospital，SichuanUniversity，Chengdu610000 2.DepartmentofObstetrics&Gynecology，WestChinaSecondUniversityHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041 3.ChinaSoutheastUniversityMedicalCollege，Nanjing210009 4.Women'sHospitalSchoolofMedicineZhejingUniversity,Hangzhou310006

The contents of FSH and LH show a certain degree of volatility in normal menstrual cycle，while the contents of sialic acids and sulfonated N-acetylgalactosamine also show fluctuant changes.Now the scientific research has proved that sialic acids and sulfonated N-acetylgalactosamine are synthesized by β1-4galactosyltransferase and β1-4GalNAc-transferase though aspartic acid induction at the end of peptide chain of FSH and LH after the peptides synthesis of the two hormones.As the relative activity of the two enzymes on FSH and LH is different，the nature of FSH is mainly influenced by sialic acid and LH by the sulfonated acetyl-galactosamine.Therefore the glycosyls influence the properties of hormones such as half-life，stability through different mechanism.They also bring some changes in the synthesis of sex hormone through the downstream signal pathway.

FSH； LH； Sialic acid； Sulfonated N-acetylgalactosamine

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.02.017

2016-05-23；

2016-07-11

四川省科技廳項目(2015SZ0173)

馬雪倩，女，陜西西安人，碩士研究生，婦產科生殖醫(yī)學專業(yè).(*

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