趙龍飛，周文和

（1.商丘師范學院生物與食品學院，河南商丘476000；2.河南林河酒業(yè)有限公司，河南商丘476000）

傳統(tǒng)白酒發(fā)酵過程中微生物種類及功能研究進展

趙龍飛1，周文和2

（1.商丘師范學院生物與食品學院，河南商丘476000；2.河南林河酒業(yè)有限公司，河南商丘476000）

發(fā)酵過程中的微生物種類影響白酒品質(zhì)的形成和產(chǎn)量高低，著重從四大類微生物（酵母菌、霉菌、細菌、放線菌）角度，探討發(fā)酵過程中微生物對白酒品質(zhì)形成的影響，旨在為利用微生物改良白酒品質(zhì)提供思路，為白酒生產(chǎn)奠定基礎。

白酒；發(fā)酵；微生物；酵母菌；霉菌；細菌；放線菌

Abstract：The microbial species affected the formation of liquor quality and yield during the process of fermentation.Taking microbial four categories as clues，we discussed the effect of microorganisms on liquor quality formation.It provided ideas for using microbiology to improve liquor quality，laid the foundation for liquor practice production.

Key words：liquor；fermentation；microorganisms；Saccharomycetes；Mould；Bacterium；Actinomycetes

白酒釀造在我國具有悠久歷史，傳統(tǒng)白酒主要是蒸餾酒[1]，以高淀粉質(zhì)原料為發(fā)酵基質(zhì)，以傳統(tǒng)酒曲為糖化劑，采用固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵方式，經(jīng)蒸餾、陳化和調(diào)勾而成含酒精的飲品，被列為世界著名蒸餾酒之一。因為發(fā)酵基質(zhì)、酒曲種類、發(fā)酵工藝以及自然地理環(huán)境等差異，最終形成了不同特色、不同香型的白酒。盡管目前白酒的香型和風味呈現(xiàn)多種樣，白酒釀造和風味形成的關鍵仍取決于代謝過程的微生物的基礎作用和生物調(diào)節(jié)，這兩個環(huán)節(jié)決定了發(fā)酵進程及風味成分[2]。針對微生物在白酒發(fā)酵過程中的作用已有許多相關研究[3]，但是以發(fā)酵過程中的微生物種類及功能來闡述的文獻還相對較少。因此，本文主要以白酒發(fā)酵過程中微生物四大類為線索來闡述微生物的作用和地位。

1 酵母菌

酵母菌（Saccharomycetes）屬于單細胞真菌，劃為兼性厭氧菌，喜生活于含糖量較高的偏酸環(huán)境[4]。酵母菌本身含有豐富蛋白質(zhì)，尤其是含有13種酶系統(tǒng)（蔗糖酶、麥芽糖酶、己糖磷酸化酶、脫羧酶、脫氫酶，氧化酶、醛縮酶等等），生理活性物質(zhì)如氧化還原酶的輔酶煙酰胺類、脫羧酶的輔酶CoA、輔酶Q、呼吸鏈中的重要的組成成分細胞色素C、還原型的谷胱甘肽和核糖核酶等[5]；同時具備人體所必需的8種必需氨基酸、B族維生素（B1～B8和 B11）、維生素 D 原、碳水化合物、粗纖維素、脂肪、礦質(zhì)元素和微量元素等。此外，在厭氧條件下，酵母菌利用糖代謝的原理，通過糖酵解途徑，將糖經(jīng)過一系列的酶促反應轉(zhuǎn)化成丙酮酸，丙酮酸再在無氧的條件下，經(jīng)乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶轉(zhuǎn)化成乙醇。酒類發(fā)酵過程中，酵母菌分泌的胞外酶作用于發(fā)酵基料并使其分解，通過系列酶促反應，最終使產(chǎn)物間發(fā)生氧化、還原、脫水、水解等復雜反應，從而形成香、純、厚等不同風味的酒類?？刂苾?yōu)勢菌（釀酒酵母）在不同發(fā)酵時期的數(shù)量變化可以控制醇的產(chǎn)量以及決定白酒品質(zhì)。所以酵母菌在厭氧發(fā)酵這一環(huán)節(jié)顯得尤為重要。如生香酵母（產(chǎn)脂酵母、產(chǎn)膜酵母）在白酒發(fā)酵工藝上的應用，使白酒品質(zhì)和產(chǎn)量得到大大改善。由于其好氣性特點，代謝過程中產(chǎn)生大量脂類物質(zhì)，是釀制白酒產(chǎn)香菌種[6]。魯氏酵母在醬醪發(fā)酵過程中，通過糖酵解途經(jīng)，將葡萄糖分解為丙酮酸再脫羧形成乙醇。從醬香型白酒高溫堆積糟里分離具發(fā)酵能力的酵母[7]（意大利酵母、地生酵母、釀酒酵母及假絲酵母），證實了葡萄糖與蛋氨酸在意大利酵母作用下發(fā)生美拉德反應，是濃郁芝麻香（主要是3-甲硫基-丙醇-1及5-羥基麥芽酚）風味產(chǎn)生的主要菌類。在經(jīng)前期堆積發(fā)酵的酒醅中，篩選、增殖大量產(chǎn)酒產(chǎn)香的酵母菌，配合各種微生物利用營養(yǎng)物質(zhì)間發(fā)生各種反應相互偶聯(lián)的影響，形成了醬香或醬香前提物質(zhì)（呋喃酮、吡喃酮衍生物），經(jīng)后發(fā)酵逐步形成了獨特的醬香風味。

隨著分子生物學技術發(fā)展，對傳統(tǒng)白酒發(fā)酵過程中微生物的研究和功能探索不斷深入。對醬香型白酒發(fā)酵過程中酵母菌群落結構分析采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）和實時熒光定量 PCR（RT-qPCR）技術[8]，對白酒香型起著重要作用的酵母主要包含9種，如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulasporadelbrueckii）、畢赤酵母（Pichiagaleiformis）、釀酒酵母（S.cerevisiae）、溶磷白地霉（Galactomyces geotrichum）、耐堿酵母（Trichosporon asahii）、拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）和費比恩畢赤酵母（P.fabianii）。監(jiān)測酒精發(fā)酵過程中酵母菌群菌落結構的變化，何培彥等[9]采用 Delta-PCR、ERIC-PCR和RAPD-PCR分子生物學技術，實驗證明是可行的。在發(fā)酵的不同階段這些酵母菌之間處于不斷的消長狀態(tài)，對形成白酒的香味的形成起著非常關鍵作用。

2 霉菌

霉菌（Mould）在自然界中廣泛分布，屬于菌絲體較發(fā)達、孢子具較強抗逆性的真菌類型，其菌絲體由分支或不分支的菌絲構成，菌落較疏松、干燥，呈蛛網(wǎng)狀、絨毛狀、氈狀等，故繁殖能力較強。同人類的生產(chǎn)、生活關系密切，是人類實踐活動中最早認識和利用的一類微生物[4]。霉菌在白酒釀制車間的數(shù)量均小于細菌和酵母菌[8]。霉菌在酒曲中有多種，如曲霉（Aspergillus）、根霉（Rhizopus）、毛霉（Mucor）、青霉（Penicillium）、紅曲霉（Monascus）等，大量著生于酒曲表面并生成孢子，因其抗逆特性在高溫高濕環(huán)境下可以繁殖與代謝，它們產(chǎn)生的多種水解酶類是發(fā)酵前期原料中淀粉等大分子物質(zhì)降解的主要動力，對白酒品質(zhì)的形成具有基礎性促進作用。此外，霉菌在生長過程中利用發(fā)酵基料代謝產(chǎn)生一些呈香物質(zhì)，對白酒風味形成具有一定影響。

白酒發(fā)酵過程中，霉菌代謝除了可產(chǎn)生檸檬酸、葡萄糖酸、草酸等有機酸外，還可產(chǎn)生多種酶制劑如糖化酶、液化酶、纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、酯化酶、果膠酶、漆酶等。此外，代謝產(chǎn)生的壺角甾醇具有抑制癌細胞活性功能，產(chǎn)生的麥角固醇是維生素D2的前體物，可抵抗傷痛[10]。因此，霉菌對前期原料降解、增加香型、賦予酒的保健功能等方面起著重要作用。霉菌種類、數(shù)量、分布等對白酒發(fā)酵過程及最終產(chǎn)物影響重大，尤其是對釀酒能產(chǎn)生直接作用的功能菌群結構，它們之間相互作用彼此消長，對白酒香型、產(chǎn)量和品質(zhì)都產(chǎn)生直接的影響[11]。

窖內(nèi)發(fā)酵過程中，霉菌主要來源于酒曲和糟醅在堆積過程中所滋生的霉菌，因其好氧性在發(fā)酵前期數(shù)量較多，其功能主要是參與淀粉質(zhì)原料的糖化過程。隨后霉菌數(shù)量呈下降趨勢，到發(fā)酵中后期有所回升，并逐漸趨于穩(wěn)定[12]。對茅臺酒酒醅中分離獲得的16種霉菌[11]，包括毛霉（Mucor）、根霉（Rhizopus）、構巢曲霉（Aspergillus nidulans）、煙曲霉（A.fumigatus）、亮白曲霉（A.candidus）、擬青霉（Paecilomyces）、紅曲霉（Monascus）、紫紅曲霉（M.purpureus）、紅色紅曲霉（M.ruber）、叢毛紅曲霉（Monaseus pilosus）、嗜熱棉毛菌（Thermomyces lanuginosus）等。對不同階段醬香型白酒發(fā)酵酒醅中霉菌研究[13]發(fā)現(xiàn)：窖池內(nèi)上、中、下不同層次酒醅中霉菌數(shù)量變化基本一致，即發(fā)酵開始霉菌數(shù)量急劇下降，中期數(shù)量短暫回升，后期菌體數(shù)量再次呈現(xiàn)減少趨勢直至發(fā)酵結束。因此，在白酒發(fā)酵過程中霉菌的數(shù)量、種類隨發(fā)酵進程進行不斷變化，窖池內(nèi)酒醅中霉菌種群、生態(tài)和時空分布及代謝產(chǎn)物間的多寡和差異，對不同層次酒醅酒體和風味形成都有一定影響。

3 細菌

細菌（Bacterium）是一類細胞細短、結構簡單、多以二分裂方式繁殖和水生性較強的原核生物，喜在溫暖、潮濕和富含有機質(zhì)的環(huán)境生存[4]。在傳統(tǒng)白酒發(fā)酵過程中，細菌種群扮演著非常重要的角色。發(fā)酵中所用酒曲中的細菌，主要能功是分泌淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等水解酶類，淀粉酶分解酒醪中的多糖類成分，最終獲得單糖以及二糖和環(huán)糊精等；糖化酶主要是它能把淀粉從非還原性未端的直鏈上的以α-1.4葡萄糖苷鍵鏈接的葡萄糖水解成單個的葡萄糖，同時也能緩慢水解分支上的α-1.6葡萄糖苷鍵，進一步轉(zhuǎn)化為葡萄糖。蛋白酶主要使水解化學性質(zhì)是蛋白質(zhì)的酶類，使其由無活性狀態(tài)轉(zhuǎn)化到由活性狀態(tài)，這些酶水解發(fā)酵基料得到可用性糖和氨基酸。

中國傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)的基礎使窖泥，大量的實驗表明：窖齡越大，微生物的數(shù)量和種類越多，長齡窖的窖泥中已經(jīng)分離出的己酸菌、丁酸菌等細菌類微生物。同時，細菌在制曲過程中也可積累一些醬香物質(zhì)或香味前體物以達到增香效果[14]。Li等[15]研究表明，地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）在發(fā)酵大曲中不僅是優(yōu)勢菌種，且有較高α-淀粉酶、葡糖糖化酶活性。對比發(fā)現(xiàn)，蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）、奧列倫芽孢桿菌（B.oleronius）在德山和武陵大曲中既是優(yōu)勢菌種也是α-淀粉酶和葡糖糖化酶的優(yōu)良菌種。隨著發(fā)酵進程細菌多樣性下降，接近發(fā)酵結束耐酸乳酸菌（Lactobacillus acetotolerans）變成優(yōu)勢種群。但不同的上游生產(chǎn)工藝也決定了發(fā)酵中間階段不同的細菌群落。在高香型白酒發(fā)酵過程中，占據(jù)優(yōu)勢的細菌種群主要是芽孢桿菌（Bacilli）、擬桿菌（Bacteroidetes）和梭狀芽孢桿菌（Clostridia），而芝麻香型發(fā)酵優(yōu)勢菌屬于芽孢桿菌、黃桿菌（Flavobacteria）和γ-變形桿菌（Gammaproteobacteria）[16]。在發(fā)酵過程中，微生物的代謝產(chǎn)物、高分子化合物的降解產(chǎn)物及它們之間的相互作用形成了白酒呈香呈味物質(zhì)，其種類、含量及協(xié)調(diào)比例決定了白酒品質(zhì)。王濤等[17]研究表明，從發(fā)酵酒醅中分離的603株菌中599株屬于34屬101種，其中芽孢桿菌、鏈霉菌（Streptomyces）、賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）4個屬為優(yōu)勢菌。以產(chǎn)芽孢或孢子的細菌為顯著優(yōu)勢菌，因其抗逆性強能適應多變環(huán)境，在一定程度上表明濃香型白酒生產(chǎn)所形成的高酸、高乙醇、較高溫度與濕度環(huán)境下細菌群落具有一定多樣性和相對穩(wěn)定性，對濃香型白酒品質(zhì)的形成起著關鍵作用。王文晶等[3]研究表明，醬香型白酒酒醅中的優(yōu)勢細菌種類基本相似，細菌包括地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、同型腐酒乳桿菌（L.homohiochii）和布赫內(nèi)氏乳桿菌（L.buchneri），對醬香型白酒風味物質(zhì)的形成起到重要作用。研究[18]表明，芽孢桿菌可以產(chǎn)生醬香味，因此，使用產(chǎn)醬香芽孢桿菌制成細菌曲應用于發(fā)酵過程中，起到強化大曲的作用，可以改善北方醬香酒的品質(zhì)。地衣芽孢桿菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝物發(fā)生美拉德反應（Maillard reaction），經(jīng)過復雜的歷程形成特殊的系列揮發(fā)性物質(zhì)香味物質(zhì)；加上高溫多水的工藝環(huán)境為嗜熱芽孢桿菌提供了良好的生長條件，更近一步促進了美拉德反應的發(fā)生。因此，利用細菌中芽孢桿菌可達到生成大量醬香物質(zhì)，逐步成為從細菌角度改善白酒品質(zhì)關注的焦點。

4 放線菌

放線菌（Actinomycetes）主要是一類呈絲狀生長和以孢子繁殖的陸生性較強的原核生物，作為一類生活史和生理生化特征相對獨特的微生物類型，其種類繁多、代謝功能各異，廣泛分布于含水量較低、有機物豐富、呈弱堿性的土壤中。大多數(shù)放線菌是有益菌，對纖維素有極強分解能力，是許多酶、維生素、抗生素的生產(chǎn)菌株[4]。目前，已發(fā)現(xiàn)由放線菌合成的次級代謝產(chǎn)物占微生物來源生物活性物質(zhì)的50%以上。放線菌在高溫大曲里數(shù)量極少，一般認為它的作用微小。但有研究[2]表明，放線菌作為白酒發(fā)酵過程中四大菌類之一，對酒體風味和風格具有一定影響。相對其他三大類微生物，鏈霉菌屬（Streptomyces）屬放線菌能夠耐受厭氧環(huán)境，且能完成無氧條件下發(fā)生的代謝，還未引起足夠的重視[19]。迄今，對放線菌大部分研究主要集中在對菌株的篩選、鑒定[20]、產(chǎn)酸產(chǎn)酯及對環(huán)境酸堿度的影響[21]，針對白酒固態(tài)發(fā)酵過程中放線菌產(chǎn)香功能和從微生態(tài)角度研究相對較少，但其某些獨特代謝產(chǎn)物具有土腥味（土腥味素）等特征，對白酒風味的影響不可忽視。國外已有放線菌揮發(fā)性產(chǎn)物相關研究的報道[22]。游玲等[23]研究表明，分離自濃香型白酒發(fā)酵糟醅、窖房和曲房空氣中的4株鏈霉菌（S.mutabilis、S.vinaceusdrappus、S.coelicoflavus、S.violascens） 可產(chǎn)生揮發(fā)性產(chǎn)物如丁酸、己酸、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯及糠醛等，它們是對濃香型白酒風味有重要影響的醇溶性和水溶性揮發(fā)性產(chǎn)物，且它們對高酸、高乙醇含量的環(huán)境適應良好。關于放線菌對發(fā)酵過程中功能性微生物群落的整體性生物學調(diào)控和風味調(diào)控機理有待深入研究[2]。

5 展望

統(tǒng)覽近10年（2006～2016）文獻，對白酒發(fā)酵過程中微生物的研究主要集中在優(yōu)良模式菌株的篩選和鑒定，而對發(fā)酵過程中有益微生物間的互作探索較少；對于微生物發(fā)酵區(qū)系中，影響白酒品質(zhì)和風味的主要微生物種類、數(shù)量及時空分布研究不夠深入。目前，對傳統(tǒng)白酒發(fā)酵過程中產(chǎn)香微生物與香味物質(zhì)間的對應關系研究還處于起步階段，將成為白酒研究的重要方向。欲弄清白酒發(fā)酵的本質(zhì)，利用現(xiàn)代分子生物學技術結合傳統(tǒng)發(fā)酵技術，運用分組測序技術、代謝組學、基因組學、蛋白組學、聚合酶鏈式反應-溫度梯度凝膠電泳/變性梯度凝膠電泳（Polymerase Chain Reaction-Temperature Gradient Gel Electrophoresis/Denatured Gradient Gel Electrophoresis，PCR-TGGE/DGGE）、實時定量聚合酶鏈式反應（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）、核酸探針技術、克隆文庫等技術分析發(fā)酵過程中微生物種群結構和數(shù)量變化，從微生物生態(tài)學角度探索不同發(fā)酵階段微生物群落間演替變化規(guī)律，揭示微生物與代謝產(chǎn)物間的關系，對實際生產(chǎn)中改善白酒品質(zhì)和提高產(chǎn)量具有深遠意義。

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Research Progress on Microorganisms and Function during Traditional Liquor Fermentation

ZHAO Long-fei1，ZHOU Wen-he2
（1.College of Biology and Food Science，Shangqiu Normal University，Shangqiu 476000，Henan，China；2.Henan Lin he Wine Corporation Limited，Shangqiu 476000，Henan，China）

2016-12-29

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.043

國家自然科學基金項目（U1204301）；河南省高等學校重點科研項目（17A180011、18B180022）；國家級大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目（201610483021）

趙龍飛（1978—），男（漢），副教授，博士，主要從事微生物資源與應用研究。