李永蓮,劉文鋒,陽元娥,周亮,黎彧

（廣東輕工職業(yè)技術學院，廣東 廣州 510300；五邑大學，廣東 江門 529020）

微生物法降解玉米芯制備燃料乙醇的研究

李永蓮,劉文鋒,陽元娥,周亮,黎彧

（廣東輕工職業(yè)技術學院，廣東 廣州 510300；五邑大學，廣東 江門 529020）

研究微生物法酶解玉米芯的最佳工藝和酵母菌發(fā)酵的最佳工藝。方法：采用自篩微生物L2″對玉米芯進行酶解，酵母對酶解液進行發(fā)酵。結果：酶解條件：自篩微生物L2″用量30m L pH值為7.0，溫度35℃，酶解時間48h，還原糖濃度達到最高；發(fā)酵條件：酵母接種量40m L，發(fā)酵溫度35℃，發(fā)酵時間36 h，酒精產(chǎn)量最高。結論：自篩微生物L2″適合用以酶解玉米芯，在較佳的酶解和較佳的發(fā)酵條件下，可顯著提高酶解率和發(fā)酵率。

玉米芯；微生物法；酶解；發(fā)酵

隨著世界經(jīng)濟的全面發(fā)展，人類將需要越來越多的能源。因為化石能源是不可再生的，其儲存量將越來越少，將會面臨短缺危機；且化石能源污染環(huán)境，因此可再生能源的開發(fā)利用將越來越受到重視。燃料乙醇因環(huán)保無污染，并支持汽油充分燃燒，受到越來越多的關注。我國玉米年產(chǎn)量居世界第二，但是大量玉米芯因無法利用被廢棄而造成極大的浪費。如果利用玉米芯制備燃料乙醇，則環(huán)保又經(jīng)濟，具有重要的社會效益和經(jīng)濟效益[1]。本文采用玉米芯為原料，研究利用自篩的微生物對其進行降解及發(fā)酵制備乙醇的技術路線，以探究玉米芯進行發(fā)酵燃料乙醇的可行性和經(jīng)濟性，為玉米芯的綜合利用提供理論依據(jù)。

一、材料和方法

（一）材料

玉米芯購自廣西桂林，曬干、粉碎、過60目篩、恒重，置樣品袋中儲存?zhèn)溆肹2]；微生物菌L2"是廣東工業(yè)大學天然藥物與綠色化學研究所培養(yǎng)篩選得到；釀酒酵母購買自安琪酵母股份有限公司。

（二）培養(yǎng)基

微生物菌L2″活化培養(yǎng)基，即是PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂16g，蒸餾水1000m L。酵母活化培養(yǎng)基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸餾水1000m L。

（三）菌種制備

微生物菌L2″以PDA斜面于4℃儲藏，在微生物法預處理玉米芯前，接種到PDA液體培養(yǎng)基，置于35℃培養(yǎng)24h，菌絲長滿液面。預處理時，將長滿菌絲的液體接種到每個樣品[3]。

釀酒酵母S.cerevi si ae，利用安琪釀酒高活性干酵母培養(yǎng)，以PDA斜面于4℃保存，在發(fā)酵制備乙醇前，接種到酵母活化液體培養(yǎng)基中活化。

（四）實驗方法

稱取已恒重的玉米芯樣品10.0g，按固液比1：12加入1.0%（質量分數(shù)）稀H 2SO 4，設置2個重復實驗，放置濕熱高壓滅菌鍋在121℃的溫度下預處理1h，自然冷卻至室溫，用稀N aO H溶液調節(jié)pH 4.8～5.0，過濾。預處理后，在玉米芯水解液中加入自篩選培養(yǎng)的微生物菌L2"，放置溫控搖床，設置一定溫度和轉速進行酶解。酶解后，加入釀酒酵母S. cerevi si ae發(fā)酵液，放置于溫控搖床，設置一定的溫度和轉速進行發(fā)酵[4]。

（五）測定方法

還原糖含量測定：3，5-二硝基水楊酸法(DN S法)[5]；乙醇含量測定：氣相色譜法（GC）。

二、實驗內容

（一）微生物酶解的影響因素研究

1、菌用量

預處理后，加入24h活化的L2〞微生物菌液10、20、30、40、50m L，設計2個重復，調節(jié)pH至7.0，置于35℃、100rad/m i n恒溫搖床中培養(yǎng)48h。

2、溫度

預處理后，加入24h活化的微生物菌L2〞30m L，設計2個重復，調節(jié)pH至7.0，分別置于不同溫度：20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，100rad/m i n的恒溫搖床中培養(yǎng)48h。

3、pH值

預處理后，加入24h活化的微生物菌L2〞30m L，設計2個重復，調節(jié)不同的pH：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，然后置35℃，100rad/m i n的恒溫搖床中培養(yǎng)48h。

4、時間

預處理后，加入24h活化的微生物菌L2〞30m L，設計2個重復，調節(jié)pH至7.0，置于35℃，100rad/m i n的恒溫搖床中培養(yǎng)60h，每隔4h取樣2.0m L。

（二）發(fā)酵的影響因素研究

1、酵母接種量

酶解液中，分別加入20、30、40、50、60、70m L活化后的釀酒酵母S.cerevi si ae發(fā)酵液，密封，置于恒溫搖床，在35℃、100rad/m i n下發(fā)酵36h后停止，精餾發(fā)酵液，采用氣相色譜法檢測乙醇產(chǎn)量[6]。

2、溫度

在酶解液中加入40m L活化后的釀酒酵母S. cerevi si ae發(fā)酵液，密封，置于恒溫搖床，設置發(fā)酵溫度分別為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，在轉速100rad/m i n下發(fā)酵36h后停止，精餾發(fā)酵液，采用氣相色譜法檢測乙醇產(chǎn)量[6]。

3、時間

在酶解液中加入活化后的釀酒酵母S. cerevi si ae發(fā)酵液40m L，密封，置于恒溫搖床，在35℃、100rad/m i n下分別發(fā)酵12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h停止，精餾發(fā)酵液，采用氣相色譜法檢測乙醇產(chǎn)量[6]。

三、結果與討論

（一）微生物酶解的影響因素

1、菌用量的影響

降解生物質的活性物質主要是纖維素酶，但是目前纖維素酶的價格較高，因此目前制備燃料酒精的酶解過程關鍵環(huán)節(jié)是降低纖維素酶的成本[6]。研究了自篩微生物L2〞產(chǎn)生纖維素酶后進行玉米芯酶解效果的研究及最佳用量的研究。如圖1所示，自篩微生物L2〞進行玉米芯酶解產(chǎn)生了較佳的效果，玉米芯的酶解開始隨著菌用量的增加而加快。但是當菌用量到30m L時，繼續(xù)增大菌用量時酶解效果反而使還原糖濃度下降，原因可能是當在底物玉米芯用量一定的情況下，菌用量的增加有利于玉米芯酶解為還原糖，但是水解玉米芯也要消耗一部分還原糖以滿足微生物代謝需要，所以當微生物量過大，單位時間內微生物自身代謝消耗的還原糖量超過其酶解玉米芯得到的還原時，還原糖含量開始下降。因此自篩微生物L2〞酶解玉米芯的效果是明顯的，其最佳菌用量為30m L。

圖1 菌用量對微生物酶解的影響Fig.1 The effect of dosages

2、溫度的影響

溫度的變化影響微生物的生產(chǎn)速度、酶活力和酶促反應速率，溫度過高或者過低都會導致微生物不生長甚至死亡，酶活力和酶促反應速率降低甚至被破壞，所以需要尋找微生物的最適溫度。如圖2所示，自篩選微生物的最適生長溫度為35℃，此時還原糖的含量較高。當溫度過低時微生物生長緩慢，分解的纖維素酶較少，導致還原糖含量低；溫度過高則微生物生長會受到抑制或導致死亡，導致還原糖含量下降。

圖2 溫度對微生物酶解的影響Fig.2 The effect of temperature

3、pH值的影響

pH值的變化會影響微生物的生命活動、代謝過程酶活性。微生物都有最適pH值和一定的pH范圍，在最適范圍內生長速率最快，酶活性最高，催化作用最強；過酸過堿會導致微生物的生長受阻，甚至死亡。如圖3所示，微生物L2〞的最適pH為7.0，此時還原糖濃度最高。

圖3 pH值對微生物酶解的影響Fig.3 The effect of pH

4、時間的影響

如圖4所示，酶解時間增加，微生物充分接觸玉米芯，還原糖濃度增大，48h時還原糖量最大，而后還原糖的濃度不會再隨著酶解時間的延長而增加，反而略有降低。分析其原因可能主要有兩點：（1）微生物與底物玉米芯的結合在一定的酶促時間達到飽和[6]；（2）微生物分解纖維素酶的能力隨著時間的增加而降低。

圖4 時間對微生物酶解的影響Fig.4 The effect of time

（二）發(fā)酵過程的影響因素

1、酵母接種量的影響

如圖5所示，在開始的一段時間，隨著酵母接種量的增加，酒精的產(chǎn)量增大；但是當酵母接種量到40m L后，酵母接種量的增加反而使得酒精的產(chǎn)量減少。其原因[7]可能是：（1）酵母接種量過大時，酵母菌的生長消耗了大量的還原糖；（2）產(chǎn)物酒精的增多抑制酵母發(fā)酵。

圖5 酵母接種量對發(fā)酵的影響Fig.5 The effect of yeast dosages

2、溫度的影響

溫度對酵母菌的生長和發(fā)酵有關鍵作用。由圖6可知，隨著溫度的升高，酒精的產(chǎn)量增大，35℃最高，溫度繼續(xù)升高產(chǎn)量反而降低，可知35℃為最適的發(fā)酵溫度。原因可能是：（1）酵母的生長和發(fā)酵有最適溫度，過高或者過低都不利于酵母作用；（2）溫度過高導致乙醇揮發(fā)以致不能收集。

圖6 發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響Fig.6 The effect of fermentation temperature

3、時間的影響

由圖8可見，發(fā)酵時間在36h左右時，酒精產(chǎn)率達到最高值，繼續(xù)延長發(fā)酵時間后呈平緩趨勢，甚至慢慢降低。其原因可能有：當酒精濃度達到一定時，酵母生長受到抑制，導致酒精增加緩慢，繼續(xù)發(fā)酵，部分乙醇因揮發(fā)而導致產(chǎn)率略有下降。

圖7 時間對發(fā)酵的影響Fig.7 The effect of time

四、結論

(一)酶解最佳條件：自篩微生物L2〞適合用于酶解玉米芯，其用量最適為30m L，pH值最適為7.0左右，溫度最適為35℃，酶解時間最適為48h，在這樣的條件下，還原糖的濃度達到最高。

(二)發(fā)酵最佳條件：釀酒酵母S.cerevi si ae發(fā)酵液接種量最適為40m L，發(fā)酵溫度最適為35℃，發(fā)酵時間最適為36h，酒精產(chǎn)量最高可達0.42g/g葡萄糖，與理論值0.51 g/g葡萄糖相比較，產(chǎn)率達到82.3%，這與文獻[6]的研究成果基本是一致的。

[1]李永蓮.玉米芯預處理工藝及制備燃料酒精的研究[D].廣州：廣東工業(yè)大學，2011.

[2]馬曉軒，范代娣，馬沛等.秸稈微生物降解及發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究[J].西北大學學報(自然科學版)，2009，39（1）：71-74.

[3]阮奇城，祁建民，胡開輝等.白腐真菌Pleurotus sajor-caju預處理對紅麻秸稈發(fā)酵乙醇的影響[J].生物工程學報，2011,27（10）：1464-1471.

[4]李永蓮，張焜，趙肅清.玉米芯稀硫酸預處理后酶解及酒精制備研究[J].釀酒科技，2011，（04）：17-19.

[5]宋占午,壬萊,劉艷玲.3,5-二硝基水楊酸測定還原糖含量的條件考察[J].西北師范大學學報(自然科學版),1997，(33)：52-55.

[6]李永蓮，劉文鋒，陽元娥.酶法降解玉米芯以制備燃料乙醇的研究[J].廣東技術師范學院學報，2014，（07）：：4-51.

[7]Nobuhiro Nakamura,Ryosuke Yamada,Satoshi Katahira. Effective xylose/cellobiose co-fermentation and ethanol productionbyxylose-assimilatingS.cerevisiaevia expression of?-glucosidase on its cell surface[J].Enzyme and Microbial Technology,2008(43)：233-236.

TU741

A

1671-5993（2017）01-0067-04

2016-11-1

廣州市科技局項目：高檔羽絨殺菌除臭綠色新工藝的研究（201510010170）

李永蓮（1985-），女，廣東韶關人，工程師，工學碩士，主要研究生物資源的利用與開發(fā)。