張楠， 閆立新， 高杰， 孫秀萍， 宋銘晶

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京100021)

內(nèi)側(cè)杏仁核中催產(chǎn)素對布氏田鼠社會行為的影響

張楠， 閆立新， 高杰， 孫秀萍， 宋銘晶*

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京100021)

目的 探究內(nèi)側(cè)杏仁核(MeA)腦區(qū)中催產(chǎn)素(OT)對布氏田鼠Lasiopodomysbrandtii社會行為的影響。方法 在雄性布氏田鼠MeA區(qū)注射催產(chǎn)素受體拮抗劑后，采用社會識別實驗、中央競技場實驗確定MeA區(qū)催產(chǎn)素受體的變化對其社會行為的影響。結(jié)果 社會識別實驗發(fā)現(xiàn)在MeA區(qū)注射人工腦脊液的布氏田鼠(對照組)對陌生鼠的探索時間顯著長于探索熟悉鼠(0.0010.05)，實驗組對空籠、刺激鼠以及陌生鼠的探索時間都顯著少于對照組(0.010.05)。結(jié)論 MeA區(qū)中OT對布氏田鼠的社會記憶能力有影響，從而造成其社會識別障礙，但是對其社會性偏好和攻擊行為都沒有影響，說明OT在MeA區(qū)的表達是通過影響布氏田鼠的社會記憶進而影響其社會行為，而非改變布氏田鼠的親社會性。

布氏田鼠；催產(chǎn)素；杏仁核；社會記憶；親社會性

無論是人還是動物都有一部分個體或物種表現(xiàn)出較多的社會友善行為，一部分表現(xiàn)出較多的反社會行為。嚙齒動物既有以家族為單位群居的，表現(xiàn)出較多社會互助行為，如社會性強的橙腹田鼠Microtusochrogaster和布氏田鼠Lasiopodomysbrandtii等(Olazabal & Young，2006；Wangetal.，2011)，也有獨居的，在繁殖期和非繁殖期都有很強攻擊性的山地田鼠Microtusmontanus和大倉鼠Tscherskiatriton(Liuetal.，2001；Panetal.，2010)。Pan等(2016)研究發(fā)現(xiàn)群居的橙腹田鼠在遇到種群內(nèi)其他個體時表現(xiàn)出更多的探究行為，即社會探究行為，而獨居的山地田鼠表現(xiàn)出對空籠的探究行為超過對其他個體的探究行為。鑒于不同嚙齒動物社會行為的巨大差異，通過對其特定腦區(qū)的基因進行調(diào)控，改變其社會行為，可以研究該動物社會行為的遺傳機制。

催產(chǎn)素(oxytocin，OT)是哺乳動物分泌的一種環(huán)狀九肽分子神經(jīng)激素，以其在分娩和泌乳中起神經(jīng)調(diào)節(jié)作用而聞名，研究發(fā)現(xiàn)其在調(diào)節(jié)社會認知行為方面的影響顯著，其中包括焦慮、學習記憶、社會認知、配偶選擇等行為(孟雅婧等，2014；Shen，2015)。OT及其受體在動物腦區(qū)內(nèi)廣泛表達，不過目前的研究顯示其在不同腦區(qū)的表達會影響不同的社會行為，已有研究通過對棕色田鼠特定腦區(qū)內(nèi)側(cè)杏仁核(medial amygdala，MeA)和伏隔核區(qū)OT的表達進行調(diào)控，發(fā)現(xiàn)雄性棕色田鼠的育幼行為會隨著OT的表達減少而減弱(Caoetal.，2014)。Wang等(2015)對不同生殖經(jīng)驗的雄性棕色田鼠MeA腦區(qū)OT的研究發(fā)現(xiàn)OT及催產(chǎn)素受體(oxytocin receptor，OTR)的表達與棕色田鼠的生殖經(jīng)驗和親子行為呈正相關。

布氏田鼠社會行為發(fā)達，是一種研究動物親社會行為較為理想的模型動物，已有研究對群居的布氏田鼠與獨居的大倉鼠腦區(qū)OT的分布進行檢測，發(fā)現(xiàn)在MeA等腦區(qū)，群居的布氏田鼠OT的分布明顯多于獨居的大倉鼠(Xuetal.，2010)，而本實驗室對布氏田鼠與BALB/c小鼠不同腦區(qū)的OT及其受體的Western Blot檢測顯示布氏田鼠MeA區(qū)OT分布較多，且有研究表明腦部MeA區(qū)與社會識別行為有密切聯(lián)系(Wangetal.，2013)。社會識別行為以社會記憶能力為生理基礎，個體的社會記憶是個體間進行社會交往所必需的，是某個體在同物種內(nèi)能夠區(qū)分熟悉個體與陌生個體的能力，是種群內(nèi)所有社會關系形成的基礎(Fergusonetal.，2002)。為了明確大腦MeA區(qū)OT表達對動物社會行為和社會性的影響，本研究調(diào)控布氏田鼠MeA區(qū)OT的表達，并進行行為學分析，揭示動物社會行為的遺傳調(diào)控機制。

1 材料與實驗方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4月齡雄性布氏田鼠60只，體質(zhì)量45～55 g，均為中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所飼養(yǎng)、繁育并凈化。10只雄性3月齡SPF級BALB/c小鼠，體質(zhì)量約25 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(京)2012-0022。動物飼養(yǎng)在獨立送排風凈化動物籠。飲用水、墊料和籠具均經(jīng)高壓滅菌處理，飼料經(jīng)60Co照射消毒達到SPF級動物飼料標準，光照時間14L∶10D。實驗動物的使用通過了中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所的實驗動物使用和管理委員會批準，批準編號：ILAS-PG-2014-011。

1.1.2 儀器 腦立體定位儀，曠場裝置(長50 cm×寬50 cm×高30 cm)，三箱裝置(長105 cm×寬35 cm×高35 cm)，動物行為學視頻跟蹤系統(tǒng)(Noldus Information Technology，EthoVision XT，The Netherlandtiaokongs)。

1.2 實驗方法

1.2.1 Western Blot檢測 雄性布氏田鼠(n=6)和雄性BALB/c小鼠(n=6)取腦，扣取MeA區(qū)腦組織，由于單只MeA區(qū)腦組織較少，故將扣取的布氏田鼠和小鼠腦組織分別混合，提取蛋白，Western Blot檢測其OT與OTR的本底表達量，對比布氏田鼠MeA腦區(qū)OT與OTR的表達量及其與小鼠的差異。

1.2.2 埋管注射 布氏田鼠(n=46)經(jīng)水合氯醛麻醉(5%，0.6 mL/100 g)后固定在腦立體定位儀上，確認腦部前囟為零點坐標(X，Y，Z)，根據(jù)MeA區(qū)三維坐標(X：-1.8 mm，Y：±2.3 mm，Z：-6.3 mm)開顱鉆打孔，雙側(cè)腦部埋管，導管深入腦下6.3 mm，進入MeA腦區(qū)。套管通過螺絲和牙科水泥固定于頭骨上，不進行注射時，用導管帽進行封閉。待傷口愈合，手術10 d后微量進樣器給藥，然后進行行為學實驗。注射試劑：實驗組(n=23)雙側(cè)注射催產(chǎn)素受體拮抗劑(oxytocin receptor antagonist，OTRA；Sigma，L-368899)，注射劑量為單側(cè)750 ng(Arakawaetal.，2010)，注射速度0.1 μL·min-1，總體積0.5 μL。注射后留針2 min，使藥物充分擴散，防止倒流；對照組(n=23)注射相同體積的人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)。

1.2.3 社會識別實驗 三箱測試是在社會識別或社會新奇實驗中用來評估個體社交能力和對新事物的興趣程度的方法。實驗過程參考Page等(2009)的實驗步驟并加以修改，測試區(qū)域由3個相鄰的箱體組成(長105 cm×寬35 cm×高35 cm)，中間2個透明塑料分隔器分隔，并通過開放的門道使三箱連通起來。實驗對象為實驗組布氏田鼠(n=12)和對照組布氏田鼠(n=12)。實驗分為3個階段：

(1)第一階段(適應階段)：社會交互箱兩側(cè)箱體空置，中間的2個隔板門關閉，將實驗鼠放入中間箱體，適應10 min。

(2)第二階段：適應結(jié)束后，同一時間段進行測試期。測試過程中，左側(cè)箱體放入空籠，右側(cè)箱體的籠中放入同性幼年刺激鼠。將實驗鼠迅速放入中間箱體中，撤掉隔板，立即開始測試，動物跟蹤系統(tǒng)自動記錄實驗鼠進入各箱的時間、次數(shù)、路程，接觸空鼠籠和刺激鼠的潛伏期、時間，跟蹤時間為10 min。10 min后將實驗鼠取出。

(3)第三階段：步驟(2)中所用刺激鼠作為熟悉鼠，同時，在左側(cè)箱體的籠中，放入另外一只陌生刺激鼠，觀察10 min，采集數(shù)據(jù)指標同步驟(2)。每只實驗鼠結(jié)束實驗后都需要將實驗鼠的糞便清除干凈，并用75%的酒精再次擦拭，掩蓋老鼠的味道，待酒精揮發(fā)完后再進行下一只實驗。

1.2.4 中央競技場實驗 中央競技場實驗參照李廣宇(2012)的方法，在曠場箱中間設置一個能上下抽拉的隔板，將曠場箱分為左右相等的兩部分。實驗于暗光周期1 h后開始，行為過程采用攝像記錄設備(夜視模式)記錄后進行分析，實驗時將實驗鼠與刺激鼠分別置于中央競技場隔板的兩側(cè)，并給予其5 min適應環(huán)境，每組實驗時間為20 min，每次實驗完成后清理箱底，用75%酒精擦拭箱底和箱壁，待晾干之后再進行下一組實驗。實驗對象為實驗組布氏田鼠(n=11)和對照組布氏田鼠(n=11)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

行為學數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學處理，用獨立樣本t檢驗分析MeA區(qū)OT對社會識別實驗和中央競技場實驗數(shù)據(jù)的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計學意義，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤(Mean±SE)表示，得到的結(jié)果用GraphPad Prism 6作圖。

2 實驗結(jié)果

2.1 Western Blot檢測

Western Blot檢測顯示在雄性布氏田鼠MeA區(qū)OT的表達量遠高于雄性BALB/c小鼠(圖1：A)，雄性布氏田鼠MeA區(qū)OTR的表達量與雄性BALB/c小鼠沒有明顯差異(圖1：B)。

圖1 Western Blot檢測OT與OTR的蛋白表達

A. 雄性布氏田鼠與雄性BALB/c小鼠MeA區(qū)OT蛋白相對表達量的對比， B. 雄性布氏田鼠與雄性BALB/c小鼠MeA區(qū)OTR蛋白相對表達量的對比， 用GAPDH蛋白做對照， 比較OT或OTR與GAPDH灰度的比值；***P<0.001。

A. comparison of OT protein relative expression in the MeA between the maleLasiopodomysbrandtiiand the male BALB/c mice， B. comparison of OTR protein relative expression in the MeA between the maleL.brandtiiand the male BALB/c mice using GAPDH as control;***P<0.001.

2.2 社會識別實驗

由于腦部埋管注射位置有偏差，通過腦部切片確認位置，統(tǒng)計分析注射正確位置樣本的行為：實驗組，n=8；對照組，n=7。對照組和實驗組布氏田鼠對有刺激鼠的籠探索時間多于對空籠的探索時間，且差異有高度統(tǒng)計學意義(0.0010.05)(圖2：B)。對實驗組和對照組的結(jié)果進行組間分析顯示，2組對空籠的探索時間的差異有高度統(tǒng)計學意義(0.0010.05)(圖2：D)。

圖2 實驗組和對照組社會識別實驗

Fig. 2 Social recognition experiment of experimental group and control group

A.對空籠和刺激鼠探索時間， B. 對熟悉鼠和陌生鼠探索時間， C. 對空籠和刺激鼠探索時間的組間對比， D. 對陌生鼠和熟悉鼠探索時間的組間對比；*P<0.05，**P<0.01。

A.the exploration time between empty and stimulus， B. the exploration time between novel and familiar， C. the exploration time of empty and stimulus between the groups， D. comparison the exploration time of novel and familiar between the groups；*P<0.05，**P<0.01.

2.3 中央競技場實驗

由于腦部埋管注射位置有偏差，通過腦部切片確認位置，統(tǒng)計分析注射正確位置樣本的行為：實驗組，n=7；對照組，n=7。實驗組布氏田鼠的攻擊潛伏期和攻擊時長與對照組的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3)。

圖3 催產(chǎn)素受體抑制劑對布氏田鼠攻擊行為的影響

3 討論

識別一個個體并對此個體形成一個社會記憶的過程是后期社會關系形成的一個主要步驟。社會識別實驗是基于嚙齒類動物探索新物體(或者個體)的時間要多于探索熟悉物體(個體)的時間這種現(xiàn)象而成立的(Winslow，2003)。MeA區(qū)注射ACSF的對照組布氏田鼠對陌生鼠的探索時間明顯高于對熟悉鼠的探索時間，而注射OTRA的實驗組布氏田鼠對陌生鼠和熟悉鼠的探索時間的差異無統(tǒng)計學意義，說明MeA區(qū)內(nèi)OTR的抑制能影響布氏田鼠的社會行為。這種社會行為的改變可能有2個原因：一是由于社會記憶形成的障礙造成的；二是動物親社會性的改變造成的。Pan等(2016)對獨居的山地田鼠和群居的橙腹田鼠分別做社會識別實驗，發(fā)現(xiàn)獨居的山地田鼠對空籠探索的時間比對同種的其他個體更長，而且對熟悉個體和陌生個體的探索時間沒有顯著差異，推測因為獨居動物的親社會性水平低，所以它們更關注物體，而不是同種的陌生或熟悉個體，缺少探究行為。而野外實驗研究也報道獨居鼠在自然狀態(tài)下遭遇時多回避或攻擊(張健旭等，1999)。本實驗結(jié)果顯示，實驗組和對照組雄性布氏田鼠在面對空籠和刺激鼠時，對刺激鼠的探索時間都顯著高于對空籠的探索時間，初步說明MeA區(qū)OT阻斷不影響雄性布氏田鼠的親社會性。而對不同組間進行比較發(fā)現(xiàn)，注射OTRA的實驗組布氏田鼠對空籠、刺激鼠以及陌生鼠的探索時間都明顯低于注射ACSF的對照組布氏田鼠，說明OTRA能夠降低布氏田鼠的社會探索行為。以上實驗都證明在MeA區(qū)注射OTRA能夠減少其社會探索行為。但是這種社會行為的改變是由于社會記憶障礙造成的還是親社會性的改變造成的還需要進一步確定。因此為了進一步確定布氏田鼠的親社會性有無改變，我們用中央競技場的實驗進行驗證。結(jié)果證明，實驗組與對照組相比，其攻擊潛伏期和攻擊時長都沒有明顯差異，表明OT在MeA區(qū)的阻斷對布氏田鼠的主動攻擊行為沒有影響。綜上所述，OT在MeA的表達是通過影響布氏田鼠的社會記憶，進而影響其社會行為，而不是改變布氏田鼠的親社會性。

已有研究證明OT在不同腦區(qū)表達變化與自閉癥、抑郁癥等精神類疾病的形成有關(Penagarikanoetal.，2015)。Shen(2015)對近年OT的研究進行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)有關OT對自閉癥影響的研究中，OT的治愈能力不僅能在動物實驗中呈現(xiàn)，在臨床治療中也得到了肯定，研究中還發(fā)現(xiàn)OT的劑量效應呈“U”型曲線，推測OT對精神類疾病的作用比較復雜，有待進一步探究。現(xiàn)有有關OT動物實驗與臨床治療的研究表明，OT的作用隨其表達腦區(qū)的位置和濃度梯度變化均有所改變，所以我們希望找到調(diào)控社會行為的主要腦區(qū)和OT對社會行為的調(diào)控機制，本實驗室和其他研究都已經(jīng)證明OT與社會行為有關，但要確定影響社會行為的主要腦區(qū)，還需要對布氏田鼠的不同腦區(qū)進行比較研究和基因調(diào)控才能實現(xiàn)。

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Effect of Oxytocin in the Medial Amygdala on the Social Behavior ofLasiopodomysbrandtii

ZHANG Nan， YAN Lixin， GAO Jie， SUN Xiuping， SONG Mingjing*

(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine， Ministry of Health， Institute of Laboratory Animal Science， Chinese Academy of Medical Sciences & Comparative Medicine Center， Peking Union Medical College， Beijing 100021， China)

Objective To explore the influence of oxytocin (OT) in the medial amygdala (MeA) on the social behaviors of Brandt’s voles (Lasiopodomysbrandtii). Methods Oxytocin receptor antagonist (OTRA) was injected into the MeA of male Brants’s voles， and then the social behaviors were tested using social recognition experiment and neutral arena encounter experiment. Results The control group (injected with artificial cerebrospinal fluid) took more time to explore the strangers than the familiars (0.0010.05). And the experimental group spent significantly less time on empty cage， stimulus and strangers than that of the control group (0.010.05). Conclusion OT in MeA can influence the social recognition and memory ability of the Brandt’s voles， but cannot affect its attack behavior. Therefore， it was concluded that the expression of OT in MeA could affect Brandt’s voles’ social behavior by impairing the ability of social memory， rather than changing their prosocial ability.

Lasiopodomysbrandtii; oxytocin; medial amygdala; social memory; prosocial

2016-10-21 接受日期：2016-12-15

國家自然科學基金項目(31301890); 農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室開放研究基金項目(Chinese IPM1615)

張楠(1991—)， 男， 碩士研究生， 主要從事實驗動物學研究

*通信作者Corresponding author， E-mail：songmj@cnilas.org

10.11984/j.issn.1000-7083.20160288

Q959.837； Q95-33

A

1000-7083(2017)02-0193-05