許 力，黃路平，魯黎明，李立芹

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 625014)

煙草鉀離子通道基因NtTPK的克隆及表達(dá)分析

許 力，黃路平，魯黎明，李立芹*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 625014)

采用同源克隆的方法對(duì)煙草品種K326中的一個(gè)鉀離子通道基因NtTPK進(jìn)行了研究，該基因序列全長(zhǎng)1 317 bp，編碼438個(gè)氨基酸。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，該基因在莖中的表達(dá)量最高；在低鉀處理24 h后該基因表達(dá)量最低；200 mmol·L-1NaCl處理24 h后該基因表達(dá)量最高；在煙草打頂7 d后，該基因在葉和根中的表達(dá)量達(dá)到最高。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究該基因的功能提供了一定理論基礎(chǔ)。

煙草；鉀離子通道；NtTPK；生物信息學(xué)；基因表達(dá)

鉀是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量元素之一，也是一些酶的激活劑，所以它在植物細(xì)胞光合作用、蛋白質(zhì)合成和氧化代謝等一些生理過程中起重要作用[1-2]。K+是植物細(xì)胞中含量最豐富的陽離子，但不屬于有機(jī)結(jié)構(gòu)的組分，在植物中含量很高，可占到植物總干質(zhì)量的10%左右，新鮮植物組織細(xì)胞內(nèi)的K+濃度高達(dá)100～200 mmol·L-1[3-4]。如果植物在生長(zhǎng)過程中缺鉀則其生長(zhǎng)就會(huì)受到限制，因?yàn)殁浫狈?huì)使依賴K+的酶活性降低，從而導(dǎo)致植物生理代謝紊亂[5]。由此可見，充足的K+對(duì)植物生長(zhǎng)具有重要意義。煙草是一種需鉀量很大的作物，煙葉含鉀量是衡量煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[6]。鉀除了作為重要的營(yíng)養(yǎng)元素參與煙葉的生理生化反應(yīng)外，它還可以增加煙葉的燃燒性并因此降低煙制品的焦油含量，從而提高其安全性。但在我國(guó)北方煙區(qū)的煙葉含鉀量大都不足2%[7]，這直接影響到煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。

鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體/通道是植物生理功能上的重要參與者，包括細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、滲透調(diào)節(jié)、植物營(yíng)養(yǎng)和金屬耐受性[8]。植物從土壤中吸收K+及在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)是通過鉀離子通道和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體完成的[9]。根據(jù)鉀離子通道的結(jié)構(gòu)和功能不同可將其分為三大類：Shaker家族通道、TPK/KCO通道和其他鉀離子通道[10]。模式植物擬南芥中TPK/KCO通道包括兩孔鉀離子通道TPK(也稱串聯(lián)孔通道)和一個(gè)Kir-型通道。TPK1和TPK4是擬南芥中兩孔鉀離子通道家族中研究較多的兩個(gè)成員，TPK1定位在液泡膜上，受Ca2+激活，是選擇性K+通道[11]；而TPK4定位在質(zhì)膜上，不具外向整流特點(diǎn)[12]；信號(hào)分子(如細(xì)胞內(nèi)的H+與Ca2+)和物理因素(如溫度與壓力)可以調(diào)節(jié)植物兩孔鉀通道活性[13]。目前煙草TPK/KCO家族中僅NtTPK1和NtTPK2有報(bào)道。因此，對(duì)鉀離子通道TPK/KCO家族成員的研究具有重要理論意義。本研究通過同源克隆的方法從煙草品種K326中成功克隆到NtTPK基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，以及分析其組織表達(dá)及在低鉀、高鹽處理下及打頂前后不同時(shí)期的表達(dá)情況，以期為今后NtTPK的功能研究及其鉀營(yíng)養(yǎng)分子機(jī)制提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

植物材料為煙草品種K326，首先進(jìn)行漂浮育苗，待其生長(zhǎng)到十字期，將其移栽到花盆中，每盆種植一株。對(duì)打頂前與打頂后煙株的根、葉以及正常生長(zhǎng)的根、莖、葉和花進(jìn)行取樣，然后在液氮中速凍，置于-80 ℃冰箱，以供后續(xù)試驗(yàn)使用。

將煙草品種K326種子表面消毒后布種于MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15 d后，將長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗分別轉(zhuǎn)移到低鉀(10 μmol·L-1)和高鹽(200 mmol·L-1NaCl)的培養(yǎng)基上，處理0、6、12、24 h，然后進(jìn)行整株取樣。低鉀培養(yǎng)基是去掉MS培養(yǎng)基中的KNO3，并且用NH4H2PO4代替KH2PO4，其余成分相同。高鹽培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加200 mmol·L-1NaCl。

通用型DNA純化回收試劑盒購(gòu)自天根公司，DH5α大腸埃希菌菌株購(gòu)于Vazyme Biotech公司，cDNA合成試劑盒購(gòu)于Thermo Scientific公司，Trizol試劑、高保真酶R045A、載體pMD19-T、Prime Script RT reagent Kit、SYBR Green Master mix等試劑均購(gòu)自大連寶生物公司，引物合成與測(cè)序由上海生工完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙草RNA的提取及cDNA的合成

按照TaKaRa公司的RNA提取用Trizol試劑盒的說明書提取煙草RNA。以RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒的操作說明完成cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄條件為：42 ℃ 60 min，72 ℃10 min。

1.2.2NtTPK基因的克隆

根據(jù)絨毛狀煙草兩孔鉀離子通道基因序列，設(shè)計(jì)引物NtTPKF和NtTPKR(表1)，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)。 目的片段純化后與pMD19-T載體16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α 感受態(tài)，隨后涂在含氨芐青霉素(Ampicillin)的LB 平板上進(jìn)行篩選，采用菌落PCR 法檢測(cè)陽性克隆，然后送到生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 目的基因的生物信息學(xué)分析

采用ExPASy ProtParam tool與 DNAMAN 軟件分析其編碼蛋白的分子量、等電點(diǎn)以及其他理化性質(zhì)，并進(jìn)行疏水性分析；運(yùn)用BioEdit，clustalx-2.0.9及MEGA2.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；運(yùn)用TMHMM Server v. 2.0進(jìn)行目的基因的跨膜區(qū)分析；采用PSORT、NetPhos3.1 Server在線工具、SWISS-MODEL等生物信息學(xué)工具對(duì)蛋白進(jìn)行亞定位預(yù)測(cè)、磷酸化位點(diǎn)及高級(jí)結(jié)構(gòu)等的分析。

1.2.4 目的基因的表達(dá)分析

根據(jù)基因序列，設(shè)計(jì)目的基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物NtTPKqF和NtTPKqR(表1)，采用煙草的18S rRNA作為內(nèi)參進(jìn)行基因表達(dá)差異研究。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?0 ℃反應(yīng)2 min，95 ℃預(yù)變性3 min，然后對(duì)95 ℃變性10 s和65 ℃延伸45 s進(jìn)行39個(gè)循環(huán)。所有的樣品都設(shè)置3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后，基因相對(duì)表達(dá)水平用2-△△Ct方法進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1NtTPK基因的克隆

表1 引物序列

首先提取煙草根總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果顯示獲得一條約1 300 bp的特異性條帶(圖1)。采用凝膠回收試劑盒純化該條帶，然后進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，挑取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。

2.2NtTPK基因的組織表達(dá)分析

為了檢測(cè)NtTPK基因在不同組織的表達(dá)水平，首先提取煙草根、莖、葉和花的總RNA，根、莖和葉的取樣是生長(zhǎng)60 d的煙草，而花的取樣時(shí)期為盛花期，然后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)分析NtTPK基因在根、莖、葉和花的表達(dá)量。結(jié)果表明，NtTPK基因根、莖、葉和花中均有表達(dá)，在莖中的表達(dá)量最高，其次是在根中的表達(dá)，在花中的表達(dá)量最低，在莖中表達(dá)量是在根中的3倍(圖2)。

2.3 目的基因的生物信息學(xué)分析

2.3.1NtTPK編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

運(yùn)用ExPASy ProtParam tool軟件對(duì)目的基因編碼的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)在線分析。結(jié)果顯示，NtTPK蛋白由20種氨基酸構(gòu)成(其中Leu最多為11.0%，而Trp最少為1.1%)。該預(yù)測(cè)蛋白的分子量為47.83 ku，分子式為C2188H3423N557O614S20，理論等電點(diǎn)pI為6.60；帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)是42，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)總數(shù)是40，消光系數(shù)在280 nm時(shí)為51 715，NtTPK的脂肪系數(shù)為97.49，總的親水性平均系數(shù)為0.099。NtTPK蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)是34.26，推測(cè)它是一個(gè)穩(wěn)定蛋白。

1，NtTPK基因；M，Marker1， NtTPK PCR product; M， Marker圖1 NtTPK基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis analysis of NtTPK PCR product

圖2 不同組織中NtTPK基因的相對(duì)表達(dá)量分析Fig.2 The relative expression analysis of NtTPK in different tissues

2.3.2NtTPK編碼蛋白的跨膜區(qū)及疏水性分析

運(yùn)用TMHMM 2.0對(duì)NtTPK編碼蛋白的跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，NtTPK所編碼的蛋白含有5個(gè)跨膜區(qū)(圖3-A)，且在第3個(gè)和第4個(gè)跨膜區(qū)之間均有一個(gè)較長(zhǎng)的胞質(zhì)質(zhì)環(huán)。為了進(jìn)一步分析NtTPK的疏水性，運(yùn)用DNAMAN軟件對(duì)其疏水區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)及分析，結(jié)果表明，該蛋白含有較多的疏水區(qū)域(圖3-B)。結(jié)合NtTPK的疏水性、總的親水性平均系數(shù)(0.099)以及其他理化性質(zhì)綜合分析，可以說明NtTPK是一個(gè)疏水性膜蛋白。

A， 蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)分析； B， 蛋白質(zhì)疏水性分析A， Transmembrane domain analysis of target protein; B， Hydrophobicity analysis of target protein圖3 蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)與疏水性分析Fig.3 Transmembrane domain and hydrophobicity analyses of target protein

2.3.3 編碼蛋白的亞細(xì)胞定位及磷酸化位點(diǎn)分析

利用PSORT在線工具預(yù)測(cè)NtTPK的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，NtTPK主要定位在質(zhì)膜和葉綠體類囊體膜上，在質(zhì)膜上占0.6，葉綠體類囊體膜上占0.572，在高爾基體上占0.4，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(膜)上占0.3，說明其可能定位在質(zhì)膜與葉綠體類囊體膜上。利用NetPhos3.1 Server在線工具對(duì)NtTPK中的絲氨酸(Serine)激酶、蘇氨酸(Threonine)激酶和酪氨酸(Tyrosine)激酶的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NtTPK中含有24個(gè)絲氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，9個(gè)蘇氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(圖4)，推測(cè)此蛋白能被激酶磷酸化，從而參與鹽脅迫生理過程的調(diào)控。

2.3.4 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

運(yùn)用IBCP的在線工具SOPMA，對(duì)NtTPK的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)占46.42%，而β-折疊占7.92%，延伸鏈占22.64%以及無規(guī)則卷曲占23.02%(圖5)。運(yùn)用SWISS-MODEL生物信息學(xué)工具對(duì)NtTPK蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖6)。

圖4 NtTPK中絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸激酶的磷酸化位點(diǎn)分析Fig.4 Predicted phosphorylation site of serine， threonine and tyrosine kinase in NtTPK

圖5 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Predicted secondary structure of target protein

圖6 蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.6 The predicted advanced structure of target protein

2.3.5 NtTPK的序列多重比對(duì)及同源性分析

將NtTPK的氨基酸序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，按照相似性程度高低選擇19個(gè)序列，運(yùn)用BioEdit，clustalx-2.0.9及MEGA2.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，NtTPK與絨毛狀煙草兩孔鉀離子通道TPK3、普通煙草兩孔鉀離子通道NtTPK3、普通煙草NtTPK1等具有較高的序列同源性(99%、99%、98%)，與胡蘿卜兩孔鉀離子通道TPK3的同源性最低，為81%。根據(jù)比對(duì)的同源蛋白信息(圖7)，將克隆的煙草基因命名為NtTPK。2.4 低鉀與高鹽處理下NtTPK基因表達(dá)模式分析

首先在超凈工作臺(tái)把生長(zhǎng)15 d的煙草幼苗轉(zhuǎn)移到低鉀與高鹽的培養(yǎng)基上處理0、6、12、24 h，然后進(jìn)行取樣提取RNA。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)分析該基因在低鉀與高鹽處理后的表達(dá)模式，結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，NtTPK基因隨低鉀處理時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，在處理24 h時(shí)，其表達(dá)量最低，比對(duì)照降低5.1倍(圖8)。NtTPK基因隨高鹽處理時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，在處理24 h時(shí)，其表達(dá)量最高，是對(duì)照的5.3倍(圖8)。

圖7 NtTPK與其他植物鉀離子通道蛋白的同源性分析Fig.7 Homology analysis of NtTPK and other plant potassium channel protein

2.5NtTPK基因在打頂前與打頂后不同時(shí)期的表達(dá)分析

本試驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)分析該基因在煙草打頂后(0、1、3、7 d)不同時(shí)期葉片和根中的表達(dá)量，煙草打頂?shù)臅r(shí)期為現(xiàn)蕾期，結(jié)果顯示，在煙草打頂1、3和7 d后，葉中該基因表達(dá)量逐漸增加。7 d時(shí)，其表達(dá)量最高。在根中，與對(duì)照相比，該基因在打頂后1和3 d的表達(dá)量基本一致；但在打頂7 d時(shí)，NtTPK基因表達(dá)量達(dá)到最高水平，是對(duì)照的14.6倍(圖9)。

圖8 低鉀與高鹽處理下NtTPK基因表達(dá)模式分析Fig.8 Analysis of NtTPK gene expression under low potassiumor high salt treatments

圖9 打頂前后不同時(shí)期葉與根中NtTPK基因的相對(duì)表達(dá)量分析Fig.9 The relative expression analysis of NtTPK in leaves and roots before and after topping stage

3 討論

眾所周知，鉀對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)具有重要的影響[14]，在本研究中，首先采用同源克隆的方法獲得煙草品種K326中鉀離子通道基因NtTPK的全長(zhǎng)CDS序列，長(zhǎng)度為1 317 bp，編碼氨基酸438個(gè)，對(duì)其跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)分析顯示，該蛋白具有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，這與煙草NtTPK2和胡楊PeTPK1跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)目一致[15-16]。蛋白的理化性質(zhì)及疏水性分析表明，NtTPK可能是疏水性的膜蛋白。亞細(xì)胞預(yù)測(cè)其可能定位在質(zhì)膜與葉綠體類囊體膜上，這與擬南芥TPK3既定位在質(zhì)膜也定位在類囊體膜上的雙重定位結(jié)果一致[17]。磷酸化位點(diǎn)分析說明該蛋白能被一些激酶磷酸化，這些絲氨酸或蘇氨酸殘基的磷酸化是與一些蛋白(如14-3-3蛋白)相互作用的關(guān)鍵[18]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)表明，NtTPK在根、莖、葉和花中均有表達(dá)，這與擬南芥AtTPK/KCO和煙草NtTPK2的表達(dá)模式是一樣的[15，19]，其中該基因在莖中的表達(dá)量相對(duì)較高，這與NtTPK1基因的表達(dá)模式類似[20]。說明NtTPK可能在鉀的轉(zhuǎn)運(yùn)方面具有重要的作用。蔡元保等[21]研究表明，在巴西橡膠樹中HbKCO1基因在鉀饑餓處理12和24 h時(shí)表達(dá)量明顯下降，在本研究中，NtTPK基因在低鉀處理12和24 h后表達(dá)量也呈下降趨勢(shì)，與他們的結(jié)果一致。NtTPK基因在高鹽處理6、12和24 h后，其表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，這與煙草NtTPK1和HbKCO1表達(dá)模式類似，這兩個(gè)基因的表達(dá)也是受高鹽誘導(dǎo)[20-21]。

在生產(chǎn)上對(duì)煙草進(jìn)行打頂是提高煙葉產(chǎn)量的一項(xiàng)重要栽培措施，但打頂會(huì)影響煙葉的K+含量[22]。韓錦峰等[23]研究認(rèn)為，我國(guó)煙葉鉀含量低的重要原因是煙草通過根系將K+排到體外，而鉀又不能得到充分、適時(shí)、合理的補(bǔ)充所造成的。本試驗(yàn)中，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)分析煙草打頂前后不同時(shí)期葉和根中NtTPK的基因表達(dá)模式，結(jié)果表明，在打頂7 d后，NtTPK基因表達(dá)量在葉和根中達(dá)到最高。代曉燕等[24]研究了煙草品種紅花大金元中內(nèi)流型NKT1與外流型NTORK1鉀離子通道基因在打頂后的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)在打頂5和24 h后，NKT1基因和NTORK1基因在葉中表達(dá)量受到抑制，但是，在打頂1和5 h后這兩個(gè)基因在根中表達(dá)量增加。本研究中的NtTPK與這兩個(gè)基因在打頂后的表達(dá)模式不完全一致，原因可能是煙草品種不同、取樣時(shí)間不同以及鉀離子通道功能不同等。今后進(jìn)一步研究工作可通過酵母雙雜交尋找NtTPK互作蛋白、利用電壓鉗及轉(zhuǎn)基因技術(shù)等明確NtTPK功能。綜上所述，本研究結(jié)果為下一步研究煙草鉀離子通道TPK功能以及了解煙草鉀營(yíng)養(yǎng)的分子機(jī)制提供了一定理論基礎(chǔ)。

本研究從煙草品種K326中克隆到1個(gè)煙草鉀離子通道基因，命名為NtTPK。該基因序列全長(zhǎng)1 317 bp，編碼438個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)其具有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析NtTPK與絨毛狀煙草TPK3相似性為99%。NtTPK基因在煙草莖中的表達(dá)量最高，低鉀處理抑制該基因的表達(dá)，而高鹽處理24 h后表達(dá)量明顯上升。在煙草植株打頂7 d后，該基因在葉與根中的表達(dá)量達(dá)到最高。

[1] MARSCHNER H. Mineral nutrition of higher plants[M]. London: Academic Press， 1995: 889.

[2] WHITE P J， KARLEY A J. Potassium[M]//HELL R， MENDEL R R. Plant cell monographs. Berlin: Springer， 2010: 199-224.

[3] 魯黎明，楊鐵釗.植物K+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].棉花學(xué)報(bào)， 2006， 18(6): 379-385. LU L M， YANG T Z. Advances in research of molecular mechnisms of potassium uptaking and transportation in plant[J].CottonScience， 2006， 18(6): 379-385.(in Chinese with English abstract)

[4] WANG Y， WU W H. Potassium transport and signaling in higher plants[J].AnnualReviewofPlantBiology， 2013， 64: 451-476.

[5] SYNSUKE K， REDA E， HANY A. Potassium deficiency affects water status and photosynthetic rate of the vegetative sink in green house tomato prior to its effects on source activity[J].PlantScience， 2011， 180(2): 368-374.

[6] 代曉燕，郭春燕，劉國(guó)順，等.鉀肥不同追施時(shí)期對(duì)烤煙品質(zhì)和產(chǎn)量的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2014， 26(2): 424-426. DAI X Y， GUO C Y， LIU G H， et al. Effects of different topdressing periods of potassium fertilization on quality and yields of flue cured tobacco[J].ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2014， 26(2): 424-426.(in Chinese with English abstract)

[7] 曹志洪.優(yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)的土壤與施肥[M].南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1991: 17-28.

[8] PINTO E， FERREIRA I M. Cation transporters/channels in plants: Tools for nutrient biofortification[J].JournalofPlantPhysiology， 2015， 179: 64-82.

[9] HAN M， WU W， WU W H， et al. Potassium transporter KUP7 is involved in K+acquisition and translocation inArabidopsisroot under K+-limited conditions[J].MolecularPlant， 2016， 9: 437-446.

[10] 程鈺宏，趙瑞雪，董寬虎.植物鉀(K+)離子通道的研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2008， 36(2): 3-7. CHENG Y H， ZHAO R X， DONG K H. Research on plasma K+channel protein[J].JournalofShanxiAgriculturalSciences， 2008， 36(2): 3-7. (in Chinese with English abstract)

[11] BIHLER H， EING C， HEBEISEN S， et al. TPK1 is a vacuolar ion channel different from the slow-vacuolar cation channel[J].PlantPhysiology， 2005， 139(1):417-424.

[12] MARCEL D， MüLLER T， HEDRICH R， et al. K+transport characteristics of the plasma membrane tandem-pore channel TPK4 and pore chimeras with its vacuolar homologs[J].FEBSLetters， 2010， 584(11): 2433-2439.

[14] 魯黎明.煙草鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因TPK1的電子克隆及生物信息學(xué)分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 44(1): 28-35. LU L M.Insilicocloning and bioinformatic analysis ofTPK1 gene in tobacco[J].ScientiaAgriculturaSinica， 2011， 44(1): 28-35. (in Chinese with English abstract)

[15] 閆亞飛，王根洪，程廷才，等.煙草鉀離子通道基因NtTPK2的克隆及序列分析[EB/OL]. (2012-03-07) http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201203-247.

[16] WANG F F， DENG S R， DING M Q， et al. Overexpression of a poplar two-pore K+channel enhances salinity tolerance in tobacco cells[J].PlantCellTissueandOrganCulture， 2013， 112(1): 19-31.

[17] CARRARETTO L， FORMENTIN E， TEARDO E， et al. A thylakoid-located two-pore K+channel controls photosynthetic light utilization in plants[J].Science， 2013， 342(6154): 114-118.

[18] LATZ A， BECKER D， HEKMAN M， et al. TPK1，a Ca2+-regulatedArabidopsisvacuole two-pore K+channel is activated by 14-3-3 proteins[J].ThePlantJournal， 2007， 52(3): 449-459.

[19] VOELKER C， SCHMIDT D B， MUELLER-ROEBER B， et al. Members of the Arabidopsis AtTPK/KCO family form homomeric vacuolar channels in planta[J].ThePlantJournal， 2006， 48(2): 296-306.

[20] HAMAMOTO S， MARUI J， MATSUOKA K，et al. Characterization of a tobacco TPK-type K+channel as a novel tonoplast K+channel using yeast tonoplasts[J].TheJournalofBiologicalChemistry， 2007， 283(4): 1911-1920.

[21] 蔡元保，朱家紅，暢文軍，等.巴西橡膠樹K+通道蛋白基因HbKC01的克隆與表達(dá)分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2010， 18(1): 30-36. CAI Y B， ZHU J H， CHANG W J， et al. Cloning and expression analysis ofHbKC01 fromHeveabrasiliensis[J].JournalofAgriculturalBiotechnology， 2010， 18(1): 30-36. (in Chinese with English abstract)

[22] JIANG F， LI C J， JESCHKE W D， et al. Effect of top excision and replacement by 1-naphthylacetic acid on partition and flow of potassium in tobacco plants[J].JournalofExperimentalBotany， 2001， 52(364): 2143-2150.

[23] 韓錦峰，朱大恒，劉華山，等.我國(guó)烤煙含鉀量低的原因及解決途徑[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 39(2): 18-23. HAN J F， ZHU D H， LIU H S， et al. Reasons and solutions for low potassium content of flue-cured tobacco in China[J].JournalofHenanAgriculturalSciences， 2010， 39(2):18-23. (in Chinese)

[24] 代曉燕，蘇以榮，魏文學(xué)，等.打頂對(duì)烤煙植株鉀素代謝和鉀離子通道基因表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009， 42(3): 854-861. DAI X Y， SU Y R， WEI W X， et al. Effects of topping on potassium metabolism and expression of potassium channels in tobacco plants[J].ScientiaAgriculturaSinica， 2009， 42(3): 854-861. (in Chinese with English abstract)

(責(zé)任編輯 張 韻)

Cloning and expression analysis of potassium channelNtTPKgene in tobacco

XU Li， HUANG Luping， LU Liming， LI Liqin*

(CollegeofAgronomy，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu625014，China)

A new potassium channel geneNtTPKwas cloned from cultivar K326 using homologous cloning strategy. Sequences analysis showed this gene contained 1 317 bp and coded 438 amino acid residues. Quantitative real-time PCR results showed that the highest expression level of this gene was in the stem; and the lowest expression level emerged after 24 h under low potassium treatment; the gene expression reached its peak level after 24 h under 200 mmol·L-1NaCl treatment; and 7 d after topping， the gene expression showed the highest level in leaves and roots of tobacco. These results provide theoretical bases for further study of the function of potassium channelNtTPKgene.

tobacco; potassium channel;NtTPK; bioinformatics; gene expression

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.03.03

2016-10-28

植物生理學(xué)與生物化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(SKLPPBKF 1505, SKLPPBKF 1506)

許力(1992—)，女，四川中江人，碩士研究生，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail: 892334388@qq.com

*通信作者，李立芹，E-mail: liliqin88@163.com

S572

A

1004-1524(2017)03-0366-07

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(3): 366-372

http://www.zjnyxb.cn

許力，黃路平，魯黎明，等. 煙草鉀離子通道基因NtTPK的克隆及表達(dá)分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(3)： 366-372.