趙敬翠

四環(huán)素類抗生素能促進(jìn)幼畜禽的快速生長(zhǎng)，具有促生長(zhǎng)作用，有些養(yǎng)殖戶受利益驅(qū)動(dòng)，在動(dòng)物的飼料、飲水中過(guò)量添加，造成畜產(chǎn)品中抗生素殘留。如果長(zhǎng)期食用該藥殘的畜產(chǎn)品，會(huì)使人肌肉酸痛、肝腎損壞、骨骼生長(zhǎng)發(fā)育受阻及易患四環(huán)素牙。因此，國(guó)家規(guī)定通過(guò)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)雞肉中四環(huán)素類抗生素為不得檢出。

目前酶聯(lián)免疫吸附法是我們縣區(qū)最常用的檢測(cè)方法。本文用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)雞肉中四環(huán)素類抗生素的含量，其原理是待測(cè)樣品中的四環(huán)素類藥物與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競(jìng)爭(zhēng)抗體，當(dāng)樣品中四環(huán)素類藥物含量少時(shí)，更多的抗體就會(huì)與酶標(biāo)板上的抗原結(jié)合而被固定在酶標(biāo)板上，加入酶標(biāo)記物，催化底物顯色，顏色為深藍(lán)色；反之，含量多時(shí)，顏色為淺藍(lán)色。

一、實(shí)驗(yàn)材料

樣品前處理：隨機(jī)抽取代表性樣品（雞肉）40批次，每個(gè)樣品取雞腿部肌肉，精確秤取1±0.01g，均質(zhì)后的樣品于50mL離心管中，充分渦動(dòng)1min，4000g以上離心10min，立即取50uL上清液進(jìn)行檢測(cè)。

試劑盒：四環(huán)素類酶聯(lián)免疫試劑盒（96孔）。北京維德維康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

試劑盒回溫：試劑盒內(nèi)各組份放于室內(nèi)恢復(fù)至室溫23-27℃。

添加陽(yáng)性對(duì)照：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定陽(yáng)性對(duì)照濃度為6ppb，取濃度12.15ppb標(biāo)準(zhǔn)品494.0μL添加到1g空白樣品中，成為濃度6ppb的陽(yáng)性對(duì)照品，用于計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照回收率。前處理同前。

二、檢測(cè)步驟

取出酶標(biāo)板，做雙孔平行，記錄標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照品和樣品的位置。

在標(biāo)準(zhǔn)品孔內(nèi)依次加入標(biāo)準(zhǔn)品工作液（0、0.15、0.45、1.35、4.05、12.15ppb）50μL，在樣品孔內(nèi)依次加入陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品和其它待測(cè)樣品均為50μL。添加不同樣品時(shí)需更換槍頭，防止交叉污染。

每孔加入50μL酶標(biāo)記物工作液，再每孔加入50μL抗體工作液。

用蓋板膜蓋好酶標(biāo)板，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻，室溫（23-27℃）下避光反應(yīng)30min。

揭開蓋板膜，倒掉孔中的液體，在每孔中加入260μL洗滌工作液（1份濃縮洗滌液加19份去離子水），洗滌4次，每次浸泡15-30s。最后一次清洗后，倒掉孔中洗液，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，拍干。（在亮光處觀察孔底是否有氣泡，氣泡可用干凈的槍頭戳破，戳不同孔底的氣泡應(yīng)更換槍頭）

立即在每孔中加入100μL底物A、B混合液（按1：1比例充分混合，必須在5min內(nèi)使用，不能使用金屬盛裝、攪拌試劑）。

用蓋板膜蓋好酶標(biāo)板，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻，室溫（23-27℃）下避光反應(yīng)15-20min。

揭開蓋板膜，每孔中加入50μL終止液，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻。

終止后5min內(nèi)，將酶標(biāo)板放在酶標(biāo)儀的載板架上，用酶標(biāo)儀在雙波長(zhǎng)450nm、630 nm下讀取酶標(biāo)板吸光度值，并將數(shù)值打印出來(lái)。

三、計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照回收率

利用電腦上r-biopharm數(shù)據(jù)分析軟件，把測(cè)得的數(shù)值錄入，軟件自動(dòng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出所有檢測(cè)樣品中四環(huán)素類抗生素的含量。回收率（%）=（實(shí)測(cè)陽(yáng)性對(duì)照濃度—實(shí)測(cè)陰性對(duì)照濃度）÷添加濃度（6ppb）×100%，本次檢測(cè)回收率為95%，在75-105%范圍內(nèi)，說(shuō)明此次檢測(cè)和結(jié)果準(zhǔn)確性高。

四、結(jié)語(yǔ)

試劑盒貯存于2-8℃環(huán)境中，抗體和酶標(biāo)Ⅱ抗在常溫下容易變性。

加樣時(shí)移液槍應(yīng)垂直于板孔，防止將液體加在孔壁上部；加等量同種試劑時(shí)應(yīng)用多道移液槍，提高速度，節(jié)省操作時(shí)間，減少實(shí)驗(yàn)誤差。

實(shí)驗(yàn)中的保溫避光反應(yīng)步驟，是抗原抗體反應(yīng)的完成過(guò)程，需要有一定的時(shí)間和溫度。因?yàn)榭乖c抗體結(jié)合的機(jī)會(huì)不均等，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸，這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程。

洗板是很關(guān)鍵的一步。主要靠洗滌使游離的與結(jié)合的酶標(biāo)記物的達(dá)到分離目的，通過(guò)洗滌清除殘留在板孔中沒結(jié)合的物質(zhì)。如果洗滌次數(shù)不夠、注入的洗滌液量不足或洗板間隔太久會(huì)直接影響檢測(cè)的結(jié)果，甚至使實(shí)驗(yàn)失敗。

檢測(cè)藥物殘留的常用方法有：高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)機(jī)法和酶聯(lián)免疫吸附法。目前我們常用的是酶聯(lián)免疫法，具有方便、快速、靈敏等特點(diǎn)，適用于大批量樣品篩查。