張歡　王春興

摘要：隨著飲用水安全問題日漸突出，快速準(zhǔn)確的水質(zhì)毒性檢測技術(shù)已經(jīng)成為研究的熱點。提出了一種基于發(fā)光細菌法的生物學(xué)檢測系統(tǒng)，這一系統(tǒng)可以對水質(zhì)毒性進行快速檢測。微弱的熒光丟失在檢測中得到了校準(zhǔn)，光電檢測的效率也得到了提高。實驗結(jié)果表明本系統(tǒng)檢測的可靠性可以達到甚至優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

關(guān)鍵詞：發(fā)光細菌；生物學(xué)方法；快速檢測；水質(zhì)毒性；光電檢測

中圖分類號：TP311 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1009-3044（2017）05-0221-02

Abstract： Nowsdays， the industrial modernization is improving， drinking water safety issues become increasingly prominent. Rapid and accurate water quality toxicity detection technology has become a hot spot. A biological detection system based on luminescent bacteria method is proposed. The system can detect the toxicity of drinking water rapidly. In the detecting， weak fluorescence loss is calibrated， the efficiency of photoelectric detection system is improved. The experimental results show that the reliability of this system can achieve even be better than traditional methods.

Key words： luminescent bacteria； biological method； fast detection； water toxicity； photoelectric detection

1 概述

發(fā)光細菌是一類自身能夠進行生物發(fā)光的細菌，當(dāng)遇到外界不利環(huán)境時，由于生理活動受到影響，細菌內(nèi)的發(fā)光反應(yīng)被抑制，發(fā)光程度也就受到影響。發(fā)光受抑制的程度跟有毒物質(zhì)的毒性大小及其濃度有關(guān)，光強的變化可以利用光電檢測技術(shù)獲得，從而判斷有害物質(zhì)的毒性。

為了測試設(shè)計系統(tǒng)的性能，檢測的樣品包括重金屬鹽，化學(xué)農(nóng)藥等，他們都會對發(fā)光細菌產(chǎn)生毒性?，F(xiàn)有的水質(zhì)檢測技術(shù)有理化方法和傳統(tǒng)生物評價方法。這些方法需要在實驗室進行，大都需要實驗儀器，測試結(jié)果需要花費24小時甚至更長時間。在這一設(shè)計中，首先要對發(fā)光細菌凍干粉進行菌種復(fù)活，制備好發(fā)光細菌試劑，然后，將待測毒物配置成不同濃度的溶液，至少配置兩個稀釋度，方便對比。本系統(tǒng)采用自動加樣單元將參加反應(yīng)的試劑加入反應(yīng)池中，這一自動加樣單元由主控芯片控制，可以避免人為操作的失誤。在實驗中，發(fā)光細菌凍干粉在復(fù)蘇后，在正常的生理條件下，會恢復(fù)發(fā)光。在將各種待測試劑連接到本系統(tǒng)后，自動加樣單元會將其加入到反應(yīng)池中，在充分混合后，發(fā)光細菌發(fā)出的光強會發(fā)生變化，并且隨著待測樣品濃度增加，發(fā)光細菌的發(fā)光強度會變?nèi)?，通過檢測發(fā)光強度的變化，對水質(zhì)進行評估。

2 實驗材料和方法

2.1 檢測細菌、待測毒物和備用試劑

測試用發(fā)光細菌：采用青?；【鷥龈煞?，配有復(fù)蘇液、滲透壓調(diào)節(jié)液，36%的稀鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液用于調(diào)節(jié)溶液pH。

待測毒物有重金屬鹽（氯化汞，氯化鎘，氯化鎳，硝酸鉛等），化學(xué)農(nóng)藥（殺蟲劑敵敵畏），其他物質(zhì)（氰化鉀等）。

2.2 檢測原理

科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)光細菌發(fā)光的機理都是由具有特異性的熒光酶（LE）、氧分子（02）、單核苷酸的黃素（FMNH2）、八碳以上的長鏈脂肪醛（RCHO）所參與的反應(yīng)，其大致過程如下：

這一發(fā)光反應(yīng)是由氧分子參與，將長鏈脂肪醛和還原性的黃素單核苷酸（FMNH2）氧化為長鏈脂肪酸及FMN。反應(yīng)過程中會發(fā)出微弱可見光，需要在黑暗環(huán)境中觀察。這一發(fā)光反應(yīng)是發(fā)光細菌正常的生理代謝，正是利用發(fā)光細菌這一特征。在實驗前，需要將參加反應(yīng)的試劑濃度比，反應(yīng)條件（pH，溫度等）調(diào)整到最適宜范圍，以獲得穩(wěn)定的峰值波長。

2.3 系統(tǒng)設(shè)計

在本系統(tǒng)中，采用日本濱松H5773型光電倍增管，Pi-102臺式ATP熒光檢測儀的測量結(jié)果作為參照。采用瑞士ARL3460光譜儀測量光強度。系統(tǒng)的MCU采用AD公司的ADUC834單片機。本系統(tǒng)主要包括以下模塊：試劑反應(yīng)單元，熒光捕獲單元，光校準(zhǔn)單元和信號調(diào)理模塊。反應(yīng)和捕獲單元是在一個封閉的容器中進行，熒光捕獲部分由光電倍增管捕獲熒光，并起著光電轉(zhuǎn)換的作用，光校準(zhǔn)單元通過檢測熒光衰減的程度對光強進行補償。

2.3.1 試劑的反應(yīng)

這一模塊實現(xiàn)了自動加樣功能，縮短了檢測時間。本系統(tǒng)采用歐姆龍繼電器G6E實現(xiàn)對加樣泵的控制，采用繼電器驅(qū)動器實現(xiàn)對于繼電器的控制。在這一系統(tǒng)中，輸送試劑用的管路是低粘性的，這樣可以避免輸送線路上的損失。如圖1所示，待測試劑和細菌溶液反應(yīng)的容器選用透明玻璃反應(yīng)池。圖1中，a中存放待測有毒試劑，b中存放發(fā)光細菌試劑，c是發(fā)光細菌與待測毒物反應(yīng)容器。

2.3.2 光的校準(zhǔn)和捕獲

發(fā)光細菌發(fā)出的熒光會被玻璃容器和溶液吸收而減弱，造成檢測結(jié)果的差異，如圖2所示，本系統(tǒng)在光電檢測之前添加了校準(zhǔn)模塊，在反應(yīng)容器的前側(cè)添加了發(fā)光二極管，保證檢測到的光強與發(fā)光細菌發(fā)出的熒光強度一致，校準(zhǔn)和捕獲過程在密閉容器中進行。

2.3.3 信號調(diào)理

信號處理是系統(tǒng)的關(guān)鍵步驟，光電倍增管在完成光電轉(zhuǎn)換之后，得到的是電流信號，電流信號在電路系統(tǒng)中是不方便處理的，需要轉(zhuǎn)換為電壓信號，并經(jīng)過逐級放大才能達到可以處理的范圍。信號調(diào)理電路如圖3所示。

3 結(jié)果及討論

3.1 部分有毒物質(zhì)的檢測實驗

首先使用本系統(tǒng)對不同濃度重金屬溶液的毒性進行測試，從實驗數(shù)據(jù)可以得出，有毒試劑毒性與其濃度呈線性關(guān)系，可以得到不同重金屬（HgCl2， NiCl2，Pb（NO3）2，CdCl2）對發(fā)光細菌的半數(shù)抑制濃度值EC50。然后用同樣的方法，對農(nóng)藥敵敵畏進行檢測，同樣可以得出其EC50值，氯化鎘、硝酸鉛溶液與發(fā)光細菌發(fā)光強度的關(guān)系如圖4所示。對它們的濃度曲線進行分析，可以得出這幾種物質(zhì)的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。采用國外水質(zhì)毒性測試儀Microtox對于鉛和鎘的檢測限分別為24.4mg/L和20.0mg/L，從圖中可知，本系統(tǒng)檢測結(jié)果更優(yōu)。

3.2 系統(tǒng)降噪

穩(wěn)定的系統(tǒng)輸出是系統(tǒng)性能重要指標(biāo)之一。PCB電路在系統(tǒng)測試階段會產(chǎn)生噪聲，由于系統(tǒng)檢測的是微弱信號，系統(tǒng)噪聲過大會對檢測結(jié)果造成影響，在電路設(shè)計中添加了濾波電路，經(jīng)多次測試，噪聲可以被限制到很低的范圍，對檢測結(jié)果的影響可以忽略，對系統(tǒng)末端輸出的測量數(shù)據(jù)如圖5所示。

3.3 檢測系統(tǒng)的準(zhǔn)確性

系統(tǒng)可重復(fù)性是系統(tǒng)準(zhǔn)確性的重要指標(biāo)之一，在測試一中，對系統(tǒng)的可重復(fù)性進行測試，選擇6mg/L的ZnCl2溶液作為測試用試劑，重復(fù)10次實驗，測試所得數(shù)據(jù)如表1，變異系數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值×100%=2.86%。從數(shù)據(jù)可以看出，本系統(tǒng)具有較強的穩(wěn)定性。除了可重復(fù)性，系統(tǒng)的準(zhǔn)確性還體現(xiàn)在它和傳統(tǒng)生物方法的相關(guān)性上。在測試二中，在城市中共測試100份樣品污染水源，分別使用本系統(tǒng)和傳統(tǒng)生物方法進行測試。由圖6可以看出，兩者具有很好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為87%。綜上，系統(tǒng)的準(zhǔn)確性可以滿足測量要求。

4 結(jié)論

本系統(tǒng)經(jīng)過多方測試，可以應(yīng)用于絕大多數(shù)飲用水安全檢測中，發(fā)光細菌作為一種野生菌，獲取成本低，檢測效率高。隨著研究的深入，這一檢測技術(shù)必將在未來發(fā)揮重要的作用。

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