鄭彬彬，張維宇，羅楊春，黃 金，王 普

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310032)

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畢赤酵母生物轉(zhuǎn)化制備四氫姜黃素的轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

鄭彬彬，張維宇，羅楊春，黃 金，王 普

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310032)

利用庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母ZJPH0802菌株生物轉(zhuǎn)化姜黃素可制備得到四氫姜黃素，從而有效改善姜黃素水溶性差、生物利用度低等缺點(diǎn)。采用正交試驗(yàn)及單因素實(shí)驗(yàn)考察培養(yǎng)基組成和靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件對(duì)四氫姜黃素產(chǎn)率的影響，得到最佳培養(yǎng)基組成(g/L)：葡萄糖25，酵母膏2.5，NH4Cl 6.5，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41.0，K2HPO41.0；最佳轉(zhuǎn)化工藝條件：pH 6.5，靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度80 g/L，轉(zhuǎn)化過(guò)程中加入無(wú)水乙醇作為底物溶媒，底物姜黃素質(zhì)量濃度50 mg/L，生物轉(zhuǎn)化24 h。在此條件下，四氫姜黃素產(chǎn)率由優(yōu)化前的64.05%提高到77.43%，比優(yōu)化前提高了21%。

庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母；姜黃素；四氫姜黃素；生物轉(zhuǎn)化

姜黃素(curcumin)是從姜科姜黃屬植物姜黃、莪術(shù)、郁金等的根莖中提取的一種天然有效成分，為橙黃色粉末，在水中溶解度較低 (0.03 μmol/L)，易溶于堿、甲醇、乙醇、醋酸、氯仿和丙酮等有機(jī)溶劑。姜黃素主要用作食品添加劑，Cheng等研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有優(yōu)良的食品安全性，人體能耐受12 g/d 的劑量而不產(chǎn)生任何毒副作用。近年來(lái)，植物化學(xué)及藥理學(xué)研究表明，姜黃素具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗癌和抗HIV等廣泛的生物活性[3-6]，且其分子量小、毒性低，具有很好的臨床應(yīng)用潛力，日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。

在姜黃素應(yīng)用方面，由于其在機(jī)體內(nèi)藥效不持久、選擇性低、被機(jī)體吸收的能力差、易被降解、生物利用度低等缺點(diǎn)，制約了其在臨床的應(yīng)用。因此，在保留姜黃素原有藥效基礎(chǔ)上，通過(guò)化學(xué)法或生物法制備得到其新的衍生物成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。微生物轉(zhuǎn)化法具有區(qū)域選擇性和立體選擇性高、反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、成本低廉和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，逐漸受到人們的關(guān)注[9-10]。Maehara等[11]從姜黃根莖中分離出13株內(nèi)生真菌，分別對(duì)姜黃素進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，從中篩選到1株可制得4種姜黃素衍生物的Diaporthesp.菌株，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定，分別為四氫姜黃素、六氫姜黃素、(3S,5S)-八氫姜黃素和八氫姜黃素。Zeng等[12]利用球孢白僵菌(Beauveriabassiana) ATCC 7159對(duì)姜黃素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，獲得了一種新的姜黃素衍生物——姜黃素-8′-O-4″-O-甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷，產(chǎn)率為30%，并且新化合物的水溶性比姜黃素提高了39 000倍。Bharti等[13]采用紫紅紅球菌 (Rhodococcusrhodochrous) MTCC 265轉(zhuǎn)化姜黃素制備香蘭素，經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)基組分，產(chǎn)率由3.56 mg/L提高到29.02 mg/L。本課題組前期研究中通過(guò)菌種篩選，獲得了對(duì)姜黃素具有較好轉(zhuǎn)化能力的菌株——庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母 (Pichiakudriavzevii) ZJPH0802，利用該菌株轉(zhuǎn)化姜黃素可得到兩個(gè)主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，分別為六氫姜黃素和四氫姜黃素(其中四氫姜黃素為主要產(chǎn)物)[14]。據(jù)Natio等[15]研究發(fā)現(xiàn)，六氫姜黃素、四氫姜黃素及姜黃素的抗氧化能力(從大到小)順序依次為四氫姜黃素、六氫姜黃素、姜黃素。因此，進(jìn)一步提高該菌株合成四氫姜黃素的能力具有很好的研究?jī)r(jià)值。

本文中，筆者首先采用正交試驗(yàn)法對(duì)庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母 (Pichiakudriavzevii) ZJPH0802的發(fā)酵培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化，考察培養(yǎng)基中葡萄糖、蛋白胨、NH4Cl和MgSO4·7H2O等因素對(duì)四氫姜黃素產(chǎn)率的影響。隨后，對(duì)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化姜黃素的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，考察緩沖液pH、底物溶媒、底物濃度、細(xì)胞濃度和轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)率的影響，以期獲得最佳的轉(zhuǎn)化工藝條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母(Pichiakudriavzevii) ZJPH0802，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室成員從土樣中篩選得到并保藏[14]。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基，每升麥芽汁中加入20 g瓊脂。pH自然。

種子及發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖30，酵母膏2.0，NH4Cl 6.0，MgSO4·7H2O 0.4，KH2PO41.0，K2HPO41.0。pH自然。

細(xì)胞培養(yǎng)及姜黃素的生物轉(zhuǎn)化：取一滿環(huán)斜面種子接種至裝有200 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶，在30 ℃、200 r/min條件下，培養(yǎng)16 h，制得種子液。以10%接種量接種裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，在30 ℃、200 r/min條件下，培養(yǎng)16 h后，離心得到轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用細(xì)胞。將2 g濕菌體懸浮于10 mL 磷酸緩沖液 (pH 6.6) 中，加入0.25 mg 姜黃素，于30 ℃、200 r/min條件下，轉(zhuǎn)化24 h，實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，即轉(zhuǎn)化體系中只加菌體不加姜黃素。

1.3 液相色譜分析

轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液離心分離菌體，取上清液，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，于50 ℃減壓蒸餾除去乙酸乙酯，殘留物用色譜甲醇溶解后，用島津LC-20A液相色譜儀分析，色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18 (5 μm，250 mm×4.6 mm，Agilent公司)。檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，流動(dòng)相為乙腈-0.1%乙酸-水溶液，梯度洗脫，洗脫條件如表1所示。實(shí)驗(yàn)組：庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母ZJPH0802菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；對(duì)照組：轉(zhuǎn)化體系中只加菌體不加姜黃素。底物姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品及四氫姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜見(jiàn)圖1。

表1 HPLC液相色譜梯度洗脫條件

a—實(shí)驗(yàn)組：菌體加姜黃素；b—對(duì)照組：只加菌體不加姜黃素；c—姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品；d—四氫姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品圖1 菌株ZJPH0802生物轉(zhuǎn)化姜黃素的HPLC檢測(cè)圖譜Fig.1 HPLC analysis of microbial conversion with strain ZJPH0802

1.4 產(chǎn)率計(jì)算方法

菌株ZJPH0802轉(zhuǎn)化姜黃素制備四氫姜黃素的產(chǎn)率按式(1)計(jì)算。

(1)

式中:c0、c產(chǎn)物分別為反應(yīng)起始底物的濃度和反應(yīng)結(jié)束時(shí)產(chǎn)物的濃度。

1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，按正交設(shè)計(jì)表L9(34)優(yōu)化培養(yǎng)基中葡萄糖、酵母膏、NH4Cl和MgSO4·7H2O這4個(gè)組分的濃度，每組設(shè)3個(gè)平行樣，取平均值。

1.5.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在正交設(shè)計(jì)獲得的最優(yōu)培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)上，對(duì)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，考察不同緩沖液pH、底物溶媒、底物濃度、細(xì)胞濃度和轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)四氫姜黃素產(chǎn)率的影響，獲得最佳的轉(zhuǎn)化工藝條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

按正交設(shè)計(jì)表L9(34)優(yōu)化培養(yǎng)基中葡萄糖、酵母膏、NH4Cl和MgSO4·7H2O這4個(gè)組分，結(jié)果見(jiàn)表2，極差及方差分析的結(jié)果見(jiàn)表3～4。由表3可知：葡萄糖的極差最大，為影響四氫姜黃素產(chǎn)率的主要因素，其次為酵母膏和NH4Cl濃度，MgSO4·7H2O是次要因素，其最佳組合為A1B1C3D3，即葡萄糖25 g/L，酵母膏2.5 g/L，NH4Cl 6.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的畢赤酵母ZJPH0802靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化姜黃素，當(dāng)姜黃素質(zhì)量濃度為25 mg/L時(shí)，四氫姜黃素產(chǎn)率可達(dá)72.46%。由表4方差分析可知：影響四氫姜黃素產(chǎn)率因素的主次順序與極差分析結(jié)果一致。在考察的4個(gè)因素中，F(xiàn)(葡萄糖)>F0.05(2,2)，即葡萄糖濃度對(duì)四氫姜黃素產(chǎn)率具有顯著影響。

表2 正交實(shí)驗(yàn)L9(34) 設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 極差分析

表4 方差分析

2.2 靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化工藝的優(yōu)化

2.2.1 緩沖液pH對(duì)四氫姜黃素產(chǎn)率的影響

不同的緩沖體系pH會(huì)影響底物的解離度和菌體的酶活性，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的產(chǎn)率?？疾炀彌_液pH對(duì)四氫姜黃素產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：在pH為5.8～6.6時(shí)，四氫姜黃素產(chǎn)率呈上升趨勢(shì)，隨著pH繼續(xù)升高，四氫姜黃素產(chǎn)率逐漸下降。當(dāng)pH為6.6時(shí)，四氫姜黃素產(chǎn)率最大。因此，最佳緩沖液pH為6.6。

圖2 緩沖液pH對(duì)四氫姜黃素產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of buffer pH on the yield of tetrahydrocurcumin

2.2.2 底物溶媒對(duì)四氫姜黃素產(chǎn)率的影響

姜黃素在水中的溶解度較低，僅為0.03 μmol/L。為解決底物的低溶解性問(wèn)題，提高轉(zhuǎn)化率，可考慮加入有機(jī)溶媒來(lái)增加底物在水中的溶解度，使底物與菌體充分接觸轉(zhuǎn)化。郭亞文等]利用新月彎孢霉(Curvularialunata)對(duì)水難溶性的17α-羥基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(RSA)進(jìn)行C11-β羥基化時(shí)，以甲醇、乙醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺作為親水性有機(jī)溶劑預(yù)溶解底物后加入到轉(zhuǎn)化體系中，提高了轉(zhuǎn)化率。Ren等]在緩沖液反應(yīng)體系中加入15%的DMF，使脂肪酶Novozym 435酶法拆分外消旋2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯制備S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸的產(chǎn)率由45.6%提高至49.0%。為此，實(shí)驗(yàn)中分別采用甲醇、無(wú)水乙醇和丙酮作為溶媒溶解底物姜黃素，并考察不同底物溶媒對(duì)四氫姜黃素產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知：因?yàn)榻S素易溶于丙酮、乙醇及甲醇，從而使姜黃素均勻分散，促進(jìn)底物與細(xì)胞的接觸。相比較而言，用無(wú)水乙醇溶解底物姜黃素后投料轉(zhuǎn)化，所得四氫姜黃素的產(chǎn)率最高。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用無(wú)水乙醇作為底物溶媒。

2.2.3 底物濃度對(duì)四氫姜黃素產(chǎn)率的影響

當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，底物基本可被細(xì)胞完全轉(zhuǎn)化；而底物濃度過(guò)高時(shí)，底物會(huì)對(duì)菌體有抑制作用。因此，考察底物濃度對(duì)四氫姜黃素產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知：隨著底物濃度的增加，四氫姜黃素產(chǎn)率逐漸下降。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度高于50 mg/L時(shí)，產(chǎn)率大幅下降。因此，確定50 mg/L為最佳底物質(zhì)量濃度，此時(shí)四氫姜黃素產(chǎn)率為74.71%。

圖3 底物溶媒對(duì)四氫姜黃素產(chǎn)率的影響Fig.3 Effects of substrate solvent on the yield of tetrahydrocurcumin

圖4 底物質(zhì)量濃度對(duì)四氫姜黃素產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on the yield of tetrahydrocurcumin

2.2.4 靜息細(xì)胞濃度對(duì)四氫姜黃素產(chǎn)率的影響

靜息細(xì)胞的添加量會(huì)對(duì)產(chǎn)物的產(chǎn)率有影響，所以考察不同靜息細(xì)胞濃度對(duì)四氫姜黃素產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知：隨著靜息細(xì)胞濃度的升高，四氫姜黃素產(chǎn)率逐漸上升。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)量濃度為80 g/L時(shí)，產(chǎn)率達(dá)最大，為76.44%。繼續(xù)增加細(xì)胞濃度，由于對(duì)反應(yīng)體系傳質(zhì)效率的影響會(huì)阻礙轉(zhuǎn)化進(jìn)程，導(dǎo)致產(chǎn)率明顯下降。故選擇80 g/L靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度為宜。

圖5 靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度對(duì)四氫姜黃素產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of cell concentration on the yield of tetrahydrocurcumin

2.2.5 轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間對(duì)姜黃素轉(zhuǎn)化的影響

在最佳反應(yīng)條件下，考察菌株ZJPH0802對(duì)姜黃素轉(zhuǎn)化的反應(yīng)時(shí)間曲線，如圖6所示。由圖6可知：隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，四氫姜黃素產(chǎn)率上升明顯，而姜黃素含量呈相應(yīng)下降趨勢(shì)，轉(zhuǎn)化24 h后，四氫姜黃素產(chǎn)率基本不再增加，較佳的轉(zhuǎn)化時(shí)間為24 h，此時(shí)四氫姜黃素產(chǎn)率為77.43%，姜黃素含量為8.2%。菌株ZJPH0802轉(zhuǎn)化姜黃素的主要產(chǎn)物為四氫姜黃素，除此外，還有少量的六氫姜黃素和其他未知產(chǎn)物[14]。

圖6 轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間對(duì)姜黃素轉(zhuǎn)化的影響Fig.6 Effects of reaction time on the conversion of curcumin

3 結(jié)論

采用正交優(yōu)化法對(duì)庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母ZJPH0802發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，考察了葡萄糖、酵母膏、NH4Cl和MgSO4·7H2O這4個(gè)因素對(duì)四氫姜黃素產(chǎn)率的影響。極差分析表明，各因素對(duì)產(chǎn)率的影響程度從大到小依次為葡萄糖、酵母膏、NH4Cl、MgSO4·7H2O。優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基組成(g/L)：葡萄糖25，酵母膏2.5，NH4Cl 6.5，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41.0，K2HPO41.0；最佳轉(zhuǎn)化工藝條件pH 6.6，靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度80 g/L，以無(wú)水乙醇作為底物溶媒，底物姜黃素質(zhì)量濃度50 mg/L，轉(zhuǎn)化時(shí)間24 h。在此條件下，四氫姜黃素的產(chǎn)率由優(yōu)化前的64.05%提高到77.43%，比優(yōu)化前提高了21%。研究結(jié)果表明，利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)是制備得到姜黃素衍生物的有效途徑。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Optimization of microbial transformation conditions for tetrahydrocurcumincatalyzed byPichiakudriavzeviiZJPH0802 strain

ZHENG Binbin,ZHANG Weiyu,LUO Yangchun,HUANG Jin,WANG Pu

(College of Pharmaceutical Science,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310032,China)

Tetrahydrocurcumin was produced byPichiakudriavzeviiZJPH0802,with better water solubility and higher bioavailability.Orthogonal experiment and single factor experiments were used to evaluate the effects of medium components and biotransformation conditions on the yield of tetrahydrocurcumin.The optimal medium forPichiakudriavzeviiZJPH0802 was composed of (g/L):glucose 25,yeast extract 2.5,NH4Cl 6.5,MgSO4·7H2O 0.5,KH2PO41.0 and,K2HPO41.0; the optimal biotransformation conditions were as follows:pH 6.5,wet cell weight 80 g/L,dehydrated alcohol as substrate solvent,curcumin concentration 50 mg/L,bioconversion for 24 h.The yield of tetrahydrocurcumin was enhanced from 64.05% to 77.43%,an increase of 21% compared with the original medium.

Pichiakudriavzevii; curcumin; tetrahydrocurcumin； biotransformation

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.02.005

2016-12-02

浙江省自然科學(xué)基金(LY16B060010)

鄭彬彬(1991—)，女，浙江溫州人，研究方向：天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化；王 普(聯(lián)系人)，教授，E-mail:wangpu@zjut.edu.cn

TQ426.97；R972

A

1672-3678(2017)02-0030-05